Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Основная идея настоящего проекта состоит в том, что внутриклеточная стимуляция единичного нейрона может приводить к изменению его функциональных свойств, что, в свою очередь, может быть связано с пластическими модификациями синаптических входов, конвергирующих на данную клетку. Наша центральная гипотеза предполагает, что клеточным механизмом перестроек зрительных рецептивных полей in vivo является взаимодействие гомосинаптической и гетеросинаптической пластичности. Мы провели исследование возможности модификации рецептивного поля нейрона зрительной коры путем индукции гомосинаптических изменений – посредством оптогенетической стимуляции клетки в сочетании с предъявлением зрительных стимулов. Эксперименты были выполнены на первичной зрительной коре трансгенных мышей, у которых под промотором Thy экспрессировался ген светоактивируемого белка ChR2. Мы предъявляли животному зрительные стимулы в виде движущихся на мониторе светлых полос различной ориентации. Характерной особенностью нейронов первичной зрительной коры является ориентационная селективность, заключающаяся в генерации потенциалов действия преимущественно в ответ на предъявление зрительных стимулов оптимальной ориентации. В ходе исследования мы производили оптогенетическую стимуляцию нейронов 5-го слоя первичной зрительной коры, экспрессирующих ChR2, в сочетании с предъявлением зрительных стимулов. Регистрация нейронов производилась методом юкстаклеточной регистрации. Оптогенетическая стимуляция осуществлялась с помощью синего светодиода через оптоволокно, помещенное в микроэлектрод при помощи специализированного держателя - оптпопетчера. В течение первых 10 минут регистрации производилось определение оптимальной ориентации для регистрируемого нейрона. Животному на экране монитора предъявляли горизонтальные и вертикальные движущиеся полосы и одновременно производилась юкстаклеточная регистрация нейрона зрительной коры. Ориентация стимула, ответ на который был бОльшим, принималась за оптимальную. После этого проводилась оптогенетическая стимуляция регистрируемого нейрона в сочетании с предъявлением неоптимального стимула. Всего, для каждого нейрона, производилось от 100 до 200 таких сочетаний, после чего, производилось дальнейшая регистрация ответов на оптимально и неоптимально ориентированные стимулы, по крайней мере, 40 минут после сочетанной стимуляции. Было обнаружено, что после сочетанного предъявления неоптимально ориентированного стимула и оптогенетической стимуляции нейрона происходило кардинальное изменение характеристик рецептивного поля клетки: амплитуда ответа на ранее неоптимальный стимул начинала превышать амплитуду ответа на ранее оптимальный стимул. Было найдено, что оптогенетическая стимуляция нейрона, сочетанная с предъявлением неоптимально ориентированного стимула, приводит к долговременному изменению ориентационной селективности данной клетки. Таким образом, мы показали, что с использованием данной модели возможно изучение механизмов пластических модификаций синаптических входов одиночного нейрона в неокортексе взрослого животного in vivo. Во время проведения экспериментов по регистрации активности нейронов зрительной коры мыши мы обратили внимание на тот факт, что достаточно регулярно в мозге возникают вспышки генерализованной активности, которые выражаются в возникновении пачки потенциалов действия и сопровождаются характерным паттерном активности на ЭЭГ. Понятно, что такая спонтанная активность, возникающая при зрительной стимуляции, значительно ухудшает характеристики зрительного ответа. Для устранения этого явления мы разработали алгоритм, основанный на методах машинного обучения, позволяющий определить предикторы генерализованной спонтанной активности и затем «вычитать» из записи активности нейрона зрительной коры спонтанные (не вызванные зрительной стимуляцией) потенциалы действия. Полученные экспериментальные данные указывают на то, что разработанный нами алгоритм успешно идентифицирует потенциалы действия, возникшие в результате генерализованной активности мозга. Удаление таких потенциалов действия из записей активности нейронов при зрительной стимуляции позволяет более адекватно оценить параметры рецептивных полей нейронов, в частности ориентационную селективность клеток. Ключевым моментом в идеологии проведения наших экспериментов с оптогенетической стимуляцией является обеспечение локальности световой стимуляции. Мы предполагаем показать, что стимуляция одной единственной клетки способна вызвать долговременную перестройку ее рецептивного поля, вызванную пластическими перестройками множества синаптических входов, конвергирующих на данную клетку и определяющих структуру рецептивного поля. Основным инструментом, который мы используем в настоящей работе является оптопетчер – специализированный холдер для электродов, позволяющий проводить одновременную юкстаклеточную регистрацию активности нейронов и их оптогенетическую стимуляцию. Однако в своем базовом виде – оптоволокно, заканчивающееся в 2 мм от кончика прозрачной стеклянной пипетки, – оптопетчер не способен обеспечить требуемой локальности световой стимуляции. В современной литературе отсутствует детальное описание того, в каком объеме происходит надпороговая стимуляция нейронов, экспрессирующих светоактивируемый канал, при использовании оптопетчера. Для выяснения этого вопроса была проведена серия экспериментов на переживающих срезах мозга, полученных из трансгенных мышей линии Thy-CHR2. Пирамидный нейрон, экспрессирующий CHR2, регистрировался внутриклеточно методом петч клямп в конфигурации целая клетка. При помощи второго манипулятора к этому же нейрону под визуальным контролем вплотную к соматической мембране подводился оптопетчер и определялся порог генерации потенциала действия в ответ на световой стимул длительностью 100мс в режиме фиксации тока. После этого интенсивность стимула увеличивалась на 1/3, усилитель переводился в режим фиксации потенциала и регистрировались светоиндуцированные трансмембранные токи, возникающие при разном положении оптопетчера относительно нейрона. Для улучшения локальности световой стимуляции мы также покрывали поверхность стеклянной пипетки черной краской, после чего проводились эксперименты с оптической стимуляцией нейрона при разных положениях оптопетчера относительно клетки, аналогично тому, как это было сделано с некрашеным оптопетчером. Используя методику, описанную выше, мы приблизительно определили объем ткани, внутри которого происходит надпороговая стимуляция нейронов, экспрессирующих канальный родопсин2, если используется интенсивность стимула, составляющая 1,3 от пороговой для нейрона, который находится непосредственно у кончика стимулирующей пипетки. Оказалось, что использование окрашенных пипеток для оптопетчера в несколько раз снижает объем стимулируемого пространства, которое становится приблизительно равным области 150х150 мкм. Принимая во внимание, что количество нейронов, экспрессирующих канальной родопсин существенно меньше общего количества пирамидных нейронов, можно ожидать, что количество стимулируемых нейронов при использовании окрашенного оптопетчера будет минимальным. Однако, для обеспечения максимальной селективности оптической стимуляции мы планируем дальнейшие модификации оптопетчера, в частности, мы планируем заменить штатное 200 микронное волокно на 50 микронное, кончик которого можно продвинуть дальше в узкую часть пипетки и, таким образом, он будет располагаться ближе к стимулируемому нейрону. В рамках работ, проведенных в 2020 году, была отработана методика прижизненного морфологического окрашивания нейронов, регистрируемых юкстаклеточно. Кроме того, была налажена «с нуля» методика картирования мозга мышей по внутреннему оптическому сигналу. Использование данного метода оказалось критичным для электрофизиологических экспериментов с регистрацией ответов нейронов первичной зрительной коры мыши.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Была отработана методика экспрессии быстрого канального родопсина oChieff в пирамидных нейронах 2/3 слоя зрительной коры мышей при помощи стереотаксической инъекции суспензии вирусных частиц в соседние со зрительной корой области неокортекса. Показано, что через две недели после инъекции наблюдается интенсивная экспрессия конструкции oChieff-Venus селективно в пирамидных нейронах верхних слоев неокортекса. Данная методика позволит в дальнейшем провести эксперименты с выработкой гетеросинаптической пластичности в зрительных нейронах путем их высокочастотной оптогенетической стимуляции. Определены количественные параметры светоактивируемого поля нейронов при экспрессии в них канального родопсина, связанного с мотивом калиевого канала Kv2.1. Показано, что применение данного мотива значительно снижает область, в которой световая стимуляция приводит к активации клеток. Однако было найдено, что экспрессия конструкции Kv2.1-CHR2 приводит к значительному снижению количества видимых дендритных шипиков, что может свидетельствовать об их недоразвитии. Вследствие чего использование данной конструкции может негативно влиять на процессы синаптической пластичности в трансфицированных нейронах. Гамма осцилляции (25-70 Гц) играют важную роль в различных аспектах обработки зрительной информации и способствуют синхронизации активности нейронных ансамблей. В предыдущих работах на зрительной коре кошек было показано, что во время предъявления зрительных стимулов в мембранном потенциале нейронов возникают гамма осцилляции, которые модулируются временной частотой зрительных стимулов таким образом, что во время зрительного ответа эти осцилляции становятся сильнее во время фаз деполяризации и слабее в фазу гиперполяризации. В более поздних работах на математических моделях нейронов было показано, что подобная модуляция высокочастотных осцилляций приводит к улучшению кодирования медленных осцилляций мембранного потенциалах и увеличению скорости передачи информации в нейронных сетях. Ранее высказывалось предположение, что гамма-колебания в зрительной коре головного мозга мыши играют второстепенную роль в обработке изображений из-за отсутствия специализированных нейронов, которые участвуют в генерации гамма-колебаний. В ходе исследования нами было обнаружено, что в простых клетках первичной зрительной коры мыши осцилляции мембранного потенциала в гамма-диапазоне модулируются частотой предъявляемого зрительного стимула. В то же время в исследовании на срезах мы экспериментально доказали, что данная модуляция может приводить к улучшению кодирования нейроном медленных осцилляций мембранного потенциала через последовательности потенциалов действия. Таким образом, явление амплитудной модуляции гамма-колебаний временной частотой стимула, первоначально описанное в зрительной системе кошек, может представлять собой универсальный механизм, улучшающий кодирование зрительной информации, которая присутствует даже у животных с относительно слабо развитой зрительной системой, такие как мыши. Была отработана методика изучения динамики изменения морфологии шипикового аппарата пирамидных нейронов на переживающих срезах мозга. С применением методов конфокальной и эпифлуоресцентной микроскопии показано, что на протяжении 1-1,5 часов морфология шипиков не претерпевает существенных изменений, что открывает возможность использовать переживающие срезы мозга для изучения особенностей изменения дендритных шипиков нейронов при выработке в них пластических перестроек. Теоретические и модельные исследования демонстрируют, что гетеросинаптическая пластичность - изменения в синапсах, неактивных во время индукции, - способствует детальному дискриминационному обучению в системах Хеббовского типа и помогает достичь устойчивой способности к повторяющемуся обучению. Отсутствие инструментов для выборочного манипулирования отдельными типами пластичности препятствует экспериментальному анализу предполагаемой роли гетеросинаптической пластичности в поведении. В нашей совместной работе с коллегами из Университета Коннектикута (США) мы обошли это препятствие, проверяя конкретные предсказания о поведенческих последствиях нарушения гетеросинаптической пластичности путем экспериментальных манипуляций с рецепторами аденозина A1. В предыдущих работах было продемонстрировано, что блокада аденозиновых рецепторов A1 ухудшает гетеросинаптическую пластичность в срезах мозга и, при реализации в компьютерных моделях, выборочно нарушает повторяющееся обучение при выполнении последовательных задач. Основываясь на этой работе, мы спрогнозировали, что мыши с нокаутом A1R будут демонстрировать (1) нарушение гетеросинаптической пластичности и (2) поведенческие дефициты при повторном обучении. Используя электрофизиологические эксперименты на срезах мы показываем, что, по сравнению с контрольными животными дикого типа, мыши A1R KO имеют нарушенную синаптическую пластичность в нейронах зрительной коры. Как затем показали наши коллеги из Университета Коннектикута, мыши с нокаутом A1R демонстрировали дефицит в задачах с повторным обучением, причем этот дефицит становился все более заметным с обучением последовательным задачам визуального различения все большей сложности. Эти поведенческие результаты подтверждают предсказания нашей модели и предоставляют первые экспериментальные доказательства предполагаемой роли гетеросинаптической пластичности в обучении на уровне организма. Более того, эти результаты идентифицируют гетеросинаптическую пластичность как новую потенциальную мишень для воздействий, которые могут помочь улучшить новое обучение на фоне существующих воспоминаний. Была отработана методика иммунохимической детекции продукта раннего гена cFos на переживающих срезах мозга после электрофизиологического эксперимента. Показано, что при использовании раствора, в котором ионы натрия заменены на сахарозу для приготовления срезов в некоторых областях мозга (в частности, СА области гиппокампа и 5й слой неокортекса) не происходит активации cFos. Это открывает возможность использования переживающих срезов мозга для изучения закономерностей активации ранних генов при разных процедурах выработки синаптической пластичности. В экспериментах in vivo было показано, что оптогенетическая стимуляция единичного пирамидного нейрона зрительной коры мыши может приводить к изменению параметров его рецептивного поля, выражающемуся в изменении его ориентационной и дирекциональной селективности по механизмам гомосинаптической пластичности. Полученные данные проливают свет на роль пластических перестроек, происходящих в отдельном нейроне, в работе нейронных сетей неокортекса.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Согласно одной из центральных гипотез современной нейробиологии синаптическая пластичность обеспечивает адаптивное функционирование кортикальных сетей в процессах развития, перцепции, обучении и памяти. Однако, поскольку клеточные и молекулярные механизмы синаптической пластичности исследуются главным образом на упрощенных препаратах, таких как культура нейронов или переживающие срезы мозга, представление о роли синаптической пластичности в механизмах работы корковых сетей является в значительной степени коррелятивным. В ходе нашей работы мы исследовали влияние сочетанной и несочетанной со зрительной стимуляции на сенсорные ответы единичных нейронов первичной зрительной коры мыши in vivo. Мы использовали парадигму Хебба, которая вызывает долгосрочные изменения эффективности синаптической передачи в экспериментах in vitro, для управления свойствами единичного пирамидного нейрона в зрительной коре мыши. Нами было показано, что оптогенетическая стимуляция пирамидного нейрона, экспрессирующего ChR2, в первичной зрительной коре мышей Thy-ChR2 в сочетании с предъявлением зрительного стимула неоптимальной ориентации может вызывать долговременные изменения свойств рецептивного поля, проявляющиеся в изменении ориентационной селективности клетки. Несочетанная стимуляция при этом не приводила к изменению свойств рецептивного поля нейрона в ходе эксперимента. Помимо Хеббовской существует также неассоциативная гетеросинаптическая пластичность, механизмы которой изучены существенно меньше, но которая, как было показано в модельных экспериментах, критически необходима для правильного функционирования нейронных сетей. Для исследования влияния гетеросинаптической пластичности на зрительные ответы in vivo в нашей работе использовался протокол внутриклеточной тетанизации. Во время тетанизации в регистрируемом нейроне вызывались серии из 10 пачек по 5 потенциалов действия с частотой 100 Гц каждую секунду; всего было пять таких серий с интервалом 60 секунд. В многочисленных экспериментах на срезах мозга ранее было показано, что подобный протокол вызывает массированные пластические изменения синаптических входов на данный нейрон: часть входов потенциируется, часть депрессируется, часть остается без изменений. Оказалось, что применение данной парадигмы в зрительном нейроне in vivo приводит к тонким изменениям структуры рецептивного поля нейрона, выражающимся в изменении дирекциональной селективности клетки при сохранении ее ориентационной селективности. Исходя из известных механизмов формирования дирекционной селективности нейронов мы предполагаем, что гетеросинаптические изменения, вызванные активацией постсинаптического нейрона, могут затрагивать лишь часть канала передачи сенсорной информации, что приводит к наблюдаемым перестройкам функциональных свойств нейронов. Таким образом, в нашей работе мы продемонстрировали роль ассоциативной и неассоциативной синаптической пластичности в динамической организации рецептивных полей нейронов зрительной коры, что приближает нас к раскрытию нейронных механизмов сенсорного восприятия. Кроме того, мы раскрыли некоторые механизмы и закономерности формирования гетеросинаптической пластичности в разных нейронных системах. Так, в экспериментах с флуоресцентно меченными нейронами было показано, что внутриклеточная тетанизация, приводящая к индукции гетеросинаптической пластичности, приводит к массированным перестройкам шипикового аппарата клетки при которых часть шипиков увеличивается, а часть уменьшается. При этом прослеживается закономерность, заключающаяся в том, что увеличившиеся шипики, как правило, соседствуют с уменьшившимися, причем чем больше произошедшее увеличение шипика, тем на большее расстояние распространяется его «угнетающее» влияние. Таким образом, полученные данные свидетельствуют в пользу выдвинутой нами гипотезы о том, что шипики (синапсы), потенциированные в результате внутриклеточной тетанизации, уменьшают длину соседних шипиков, вероятно вызывая в них долговременную депрессию. Одним из объяснений данного феномена, согласно литературным данным, может быть запуск в потенциированном шипике локальной трансляции мРНК немедленного раннего гена ARC, продукт которого затем диффундирует в соседние шипики и вызывает уменьшение их размера. Зубчатая фасция является одним из немногих мест во взрослом мозге, где происходит нейрогенез. Интеграция новообразованных гранулярных клеток в сеть гиппокампа обеспечивает субстрат для структурной пластичности, необходимой для нормальной функции взрослого гиппокампа. Однако механизмы синаптической пластичности, которые опосредуют интеграцию новообразованных гранулярных клеток в существующие цепи, остаются плохо изученными. Особенно плохо описаны механизмы пластичности ГАМК-ергических синапсовх. В нашей работе мы показали, что постсинаптические пачки потенциалов действия, не сопровождаемые пресинаптической активацией, могут индуцировать гетеросинаптическую неассоциативную пластичность ГАМКергических входов как в незрелых, так и в зрелых гранулярных клетках гиппокампа. Как в незрелых, так и в зрелых нейронах пластические изменения были двунаправленными, и отдельные входы могли демонстрировать долговременную потенциацию или долговременную депрессию или не изменяться. Однако свойства неассоциативной пластичности резко изменяются по мере созревания новообразованных гранулярных клеток: если в незрелых клетках наблюдается явное преобладание неассоциативной долговременной потенциации, то в зрелых нейронах потенциация и депрессия уравновешиваются, в среднем с нулевой суммой. Таким образом, мы продемонстрировали, что ГАМКергические входы гранулярных клеток пластичны и что правила индукции неассоциативной пластичности меняются по мере созревания нейронов. Мы предполагаем, что неассоциативная потенциация ГАМК-ергической передачи в незрелых нейронах может помочь уравновесить повышенное возбуждение в сети, которому способствуют сниженные пороги индукции долговременной потенциации в глутаматергических синапсах в созревающих гранулярных клетках. Такой механизм может помочь создать сильный ГАМК-ергический драйв, обеспечивающий выживание новообразованных нейронов, которые необходимы для нормального функционирования гиппокампа.