Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Настоящий этап исследований был посвящён совершенствованию системы скрининга нейропротекторов при фокальной ишемии коры головного мозга, в том числе разработке методик комплексного электро-имаджингового исследования топологии и динамики физиологических и патофизиологических паттернов в коре головного мозга, характеристике и прогностической значимости ишемических сверхмедленных отрицательных потенциалов (СОП), а также разработке оригинальной методики для реконструции медленноволновых процессов при регистрации электрической активности в коре головного мозга с применением R-CR фильтров с частичным подавлением низких частот. Кроме того, нами была исследована динамика смерти нейронов относительно аноксической деполяризации (АД) в модели кислородно-глюкозной депривации в срезах коры головного мозга ин витро, и описаны эффекты локальной гипертермии на электрическую активность коры головного мозга в рамках исследования нейропротекторных эффектов локальной гипотермии при фокальной ишемии головного мозга. Для исследования топологии и динамики распространения спонтанных и сенсорно-вызванных физиологических паттернов активности мозга, а также патологического паттерна распространяющейся депрессии (РД) в калиевой модели были применены эпидурально расположенные матрицы ЭКоГ электродов, которые были разработаны нашими коллегами в МФТИ. Данные матрицы в силу своей оптической прозрачности также позволили производить одновременную регистрацию внутренних оптических сигналов (ВОС). Комбинированная регистрация электрической активности коры головного мозга одновременно с ВОС регистрацией позволила охарактеризовать пространственную организацию ответов, вызываемых стимуляцией отдельных вибрисс в бочонковой коре, а также распространение дельта-волновой активности и волн РД, вызываемых локальной эпипиальной аппликацией 1М- KCl. Помимо этого, одновременное использование интракортикальных многоэлектродных линейных кремниевых проб позволило охарактеризовать распространение волн РД как в горизонтальном, так и вертикальном измерениях. В частности, было показано, что распространение РД по коре сопровождается угасанием скорости проведения и компартментализацией РД в поверхностных слоях коры, с последующей остановкой проведения РД. При этом был обнаружен феномен волн возбуждения в глубоких слоях коры, которые распространяются параллельно с депрессией в поверхностных слоях, в случаях поверхностных РД-волн. На следующем этапе предполагается использовать данный комплексный электро-имаджинговых подход для исследования развития ишемического поражения коры головного мозга в модели фокальной ишемии, вызываемой ЭТ-1. Для характеристики свойств ишемических сверхмедленных отрицательных потенциалов (СОП) в различных слоях коры головного мозга бы использованы линейные матрицы Ir – электродов в модели фокальной ишемии, вызываемой эпипиальной аппликацией ЭТ-1. Была выявлена корреляция времени возникновения СОП и его амплитуды со степенью морфо-функционального поражения в модели фокальной ишемии, вызываемой эпипиальной аппликацией ЭТ-1. При этом амплитуда СОП была большей в глубине коры, что анти-коррелировало с вертикальным градиентом ишемического поражения с наибольшими функциональными дефицитами на поверхностных слоях. При одновременной регистрации Ir и AgCl – электродами в моделях ишемии, вызываемой ЭТ-1 и ингаляцией азота было обнаружено, что СОП наблюдается лишь на Ir электродах, что предполагает электрохимическую природу этого феномена, что будет исследоваться детально на следующем этапе. В задаче, посвященной разработке методики реконструкции медленноволновых процессов, характеризующих развитие ишемического поражения (РД, АД, СОП), был разработан математический аппарат и осуществлен подбор оптимальных параметров значений элементов R-CR фильтра с частичным подавлением низких частот для ко-регистрации высоко- и низкочастотных ЭЭГ сигналов, который позволяет адекватную регистрацию активности в широком частотном диапазоне, включая сверхмедленные процессы СОП, РД и АД, и традиционные диапазоны от дельтаволновой активности до спайковой активности. В результате удалось достичь удовлетворительной реконструкции медленно-волновых процессов без потери амплитудных и фазовых характеристик сигнала в полном частотном диапазоне. Данный подход позволит извлечь характеристики ишемических медленно-волновых процессов не только с помощью модификаций во входных фильтрах, но также и при использовании стандартных ЭЭГ-регистраторов, что может стать важным инструментом для прогностики ишемического поражения. Помимо поставленных в задании задач, были также решены две комплементарные задачи. Во-первых, была исследована динамика необратимой потери мебранного потенциала и возбудимости нейронов (как метрик смерти нейронов) относительно аноксической деполяризации (АД) в модели кислородно-глюкозной депривации в срезах коры головного мозга ин витро. Было показано, что потеря этих витальных функций происходит задержанно, в течение десятков минут на популяционном уровне, и что АД не является ультимативным маркером нейрональной смери при ишемии, как это считалось ранее в данной модели. Эти данные согласуются с данными, полученными ин виво, и позволяют использование КГД-модели ишемии для исследования нейропротекторов в пост-АД периоде ишемического поражения. Во-вторых, было исследовано влияние локальной гипотермии на электрическую активность коры головного мозга в качестве контрольных экспериментов по исследованию нейропротекторных эффектов локальной гипотермии при фокальной ишемии головного мозга. Было выявлено, что локальная гипотермия подавляет медленные колебания и десинхронизирует активность нейронов во всех слоях коры. При этом уменьшается частота нейрональной активности во всех слоях коры, за исключением 5 слоя, в котором охлаждение индуцирует переменные и непоследовательные изменения активности нейронов, что является общей особенностью перехода от синхронизации медленных волн к десинхронизированной активности в коре головного мозга.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Настоящий этап исследований был посвящён совершенствованию системы скрининга нейропротекторов при фокальной ишемии коры головного мозга, в том числе: 1) Разработке методик комплексного электро-имаджингового исследования топологии и динамики физиологических и патофизиологических паттернов в коре головного мозга при фокальной ишемии, вызываемой вазоконстриктором эндотелином-1 (ЭТ-1) с использованием комбинированной регистрации электрической активности мозга интракортикальными линейными матрицами электродов, многоэлектродных ЭКоГ матриц на гибко-пленочной основе и имаджинга внутренних оптических сигналов; 2) Исследованию генеративных механизмов ишемических сверхмедленных отрицательных потенциалов (СОП), в том числе исследованию вклада чувствительности электродов из благородных металлов (иридия и платины, используемых для регистрации СОП) к гипоксии и изменениям электролитного состава в ишемическом очаге. В рамках этой задачи планировалось также выяснить, возникают ли СОП в не-нейрональной ткани на примере ишемии почки. 3) Практической реализации полночастотной регистрации медленных и сверхмедленных ишемических потенциалов (РД и СОП) с использованием стандартных АС-усилителей на основании разработанной на предыдущем этапе оригинальной методики для реконструкции медленноволновых процессов при регистрации электрической активности в коре головного мозга с применением R-CR фильтров с частичным подавлением низких частот. Для этого планировалось осуществить аппаратную доработку стандартного АС-усилителя путём замены входного фильтрующего CR каскада на R-CR фильтр с частичным подавлением низких частот. В результате проведенных исследований были проведены эксперименты и получены следующие результаты: 1) Для исследования топологии и динамики распространения ишемических нарушений в электрической активности коры головного мозга в ЭТ-1 модели ишемии были применены эпидурально расположенные матрицы ЭКоГ электродов, которые были разработаны нашими коллегами в МФТИ, и линейные матрицы электродов на кремниевой основе. ЭКоГ матрицы в силу своей оптической прозрачности также позволили производить одновременную регистрацию внутренних оптических сигналов (ВОС) во время развития ишемического поражения. Комбинированная регистрация электрической активности коры головного мозга одновременно с ВОС-регистрацией позволила охарактеризовать пространственную организацию изменений в электрической активности в бочонковой коре по мере развития ишемического поражения в острую фазу инсульта (в течение 3 часов после инъекции ЭТ-1). Было обнаружено, что адекватная характеристика ишемических изменений в горизонтальном и вертикальном измерениях коры возможна лишь при учёте как высокочастотной (МПД), так и низкочастотной активности (дельта-осцилляции). Это объясняется тем, что высокочастотная активность на поверхности мозга мало информативна в горизонтальном измерении, но эффективна в вертикальном измерении. В то же время изменения в активности в дельта-волновом диапазоне на поверхности коры достоверно характеризуют горизонтальное развитие ишемического поражения. Так, подавление дельта-волновой активности на обширных участках коры, наблюдающееся в течение 1 часа после инъекции ЭТ-1, характеризуется горизонтальным градиентом скорости и степени восстановления с наибольшей скоростью восстановления по мере удаления от места инъекции ЭТ-1. При этом самые ранние и наиболее устойчивые сигналы, характеризующиеся увеличением светопроницаемости ткани мозга при ВОС-регистрации, позволяют максимально точно указать на проекцию центра ишемии. Гистологический анализ ишемических очагов, формирующихся при интракортикальном введении ЭТ-1 выявил больший размер ишемического повреждения в поверхностных слоях коры, что согласуется с результатами, полученными ранее при эпипиальной аппликации ЭТ-1, и является дополнительным подтверждением вертикального градиента ишемического поражения, характеризующегося более значительным поражением поверхностных слоев коры по сравнению с глубокими слоями во время фокальной ишемии, вызываемой вазоконстрикцией под действием ЭТ-1. 2) Для исследования вклада чувствительности электродов из благородных металлов (иридия и платины, используемых для регистрации СОП) к гипоксии и изменениям электролитного состава в ишемическом очаге были проведены эксперименты in vitro с контролируемыми изменениями в концентрации О2 и электролитного состава растворов. Было обнаружено, что Ir- и Pt/Ir-электроды обладают высокой чувствительностью к рО2. При изменении pО2 от 95% до 5% падение потенциала на Ir- и Pt/Ir-электродах достигало -100 мВ и более (R> 0.7, p<0.001), а коэффициент линейной зависимости потенциала от рО2 варьировал от 0.5 до 1.8 мВ / 1% рО2. При этом AgCl-электроды не проявили значительной чувствительности к рО2. Учитывая близкую к линейной зависимость потенциала на Ir- и Pt/Ir электродах от рО2, и с учётом максимально возможного изменения в рО2 от 20% до 0% во время гипоксии, вклад рО2-чувствительности Ir- и Pt/Ir электродов в СОП (достигающих в среднем -70 мВ на пике ишемии) можно оценить в диапазоне от -10 до -40 мВ. Аналогичный анализ также выявил чувствительность потенциала на Ir- и Pt/Ir электродах от рН (R = -0.9, p<0.0001) с коэффициентом линейной зависимости -33мВ/1 ед. pH. Поскольку изменения в межклеточной рН могут колебаться во время ишемии в диапазоне от +0.2 до -0.5, вклад рН-чувствительности Ir- и Pt/Ir электродов в СОП можно оценить в диапазоне от -7 до +17 мВ. Наконец, воспроизведение изменений в электролитном составе внеклеточной жидкости, происходящих во время ишемии, включая снижение внеклеточной концентрации ионов натрия, хлора и кальция, и повышение концентрации ионов калия, вызывало положительное смещение потенциала на Ir- и Pt/Ir электродах на значения от + 5 до +20 мВ. Таким образом, электроды из благородных металлов, которые используются при регистрации СОП, обладают значительной чувствительностью к рО2, и в меньшей степени к рН и электролитному составу. Следовательно, можно предположить, что электрохимические свойства электродов, в первую очередь их высокая рО2-чувствительность, вносят значительный вклад в ишемические СОП. Эти результаты согласуются с обнаруженной нами ранее значительно меньшей амплитудой СОП (до -20 мВ) при регистрации Ag/AgCl-электродами. Также в рамках данной задачи мы исследовали СОП при регистрации Ir- электродами в не-нейрональной ткани на примере ЭТ-1-вызванной ишемии почки. Было обнаружено, что инъекция ЭТ-1 в ткань почки вызывает аналогичный СОП медленно развивающийся сдвиг внеклеточного потенциала внутри почки на -42±7 мВ. Параллельно с СОП наблюдались комплексные изменения светопроницаемости ткани почки при ВОС-регистрации с наиболее выраженной первой фазой увеличения светопроницаемости, которая, по всей видимости, отражает фазу цитотоксического ишемического отёка. Таким образом, было показано, что СОП не являются уникальным свойством нейрональной ткани и, возможно, эти сдвиги потенциала в значительной степени обусловлены рО2 чувствительностью Ir-электродов и гипоксией ткани во время ишемии. В совокупности, полученные нами данные позволяют сделать вывод о том, что природа СОП в коре головного мозга является комплексной, и включает в себя как биоэлектрический компонент, так и электрохимические процессы на электродах, обусловленные чувствительностью электродов к рО2 и изменениям в электролитном составе среды при ишемии. 3) В задаче, посвященной разработке методики реконструкции медленноволновых процессов, характеризующих развитие ишемического поражения (РД, АД, СОП), на первом этапе нами был разработан математический аппарат и осуществлен подбор оптимальных параметров значений элементов R-CR фильтра с частичным подавлением низких частот для ко-регистрации высоко- и низкочастотных ЭЭГ сигналов, который обеспечивает адекватную регистрацию активности в широком частотном диапазоне, включая сверхмедленные процессы СОП, РД и АД, и традиционные диапазоны от дельтаволновой активности до спайковой активности. На данном этапе была осуществлена практическая реализация полночастотной регистрации медленных и сверхмедленных ишемических потенциалов (РД и СОП) с использованием стандартного АС-усилителя с входным RC-фильтром, настроенного на работу с переменной составляющей входного сигнала (AC-режим). Во входной фильтрующий каскад одного из каналов усилителя параллельно конденсатору (С) был добавлен резистор (Rc). В ходе проверки работы модифицированного усилителя на тестовых сигналах имеющих формы реальных калий-вызванных РД и эндотелин-вызванных СОП, а также при in vivo регистрации Ir-пробами на кремниевой основе калий-вызванных РД и аноксических СОП в соматосенсорной коре крыс было показано, что ошибка реконструкции сигналов не превышает 1%. Предложенная модификация позволила превратить классический AC-усилитель в гибридный AC/DC усилитель с возможностью восстановления сигналов в полном частотном диапазоне (DC-режим).