КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер 17-15-01175

НазваниеИсследование ключевых параметров клеток мозга на ранних стадиях развития ишемического инсульта.

РуководительБилан Дмитрий Сергеевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2020 г. - 2021 г.

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (18).

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-101 - Экспериментальная медицина

Ключевые словаинсульт головного мозга, ишемия-реперфузия, нейроны, астроциты, генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы, флуоресцентная микроскопия

Код ГРНТИ34.15.43

СтатусУспешно завершен

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
Проект посвящен исследованию биологических процессов в клетках мозга при развитии ишемического инсульта в модели окклюзии средней мозговой артерии лабораторных крыс. Подход основан на применении популярных в современных медико-биологических исследованиях генетически кодируемых биосенсоров на основе флуоресцентных белков. Их принцип работы основан на изменении спектральных характеристик при изменении исследуемого параметра клетки или концентрации соединения. Используя такие инструменты, мы разработали принципиально новый подход изучения патогенеза инсульта, который позволяет регистрировать динамику исследуемого процесса in vivo одновременно в разных точках мозга в режиме реального времени с первых секунд развития заболевания. Для этого животным в область мозга с экспрессией гена биосенсора, доставленного в клетки с помощью заражения вирусом, имплантируют короткие оптические волокна, через которые в дальнейшем осуществляют регистрацию флуоресцентного сигнала при развитии ишемического инсульта. Поскольку биосенсор представляет собой белковую молекулу, используя специфичные промоторы и сигнальные последовательности, инструмент легко можно локализовать в разных типах клеток тканей мозга, а также в их отдельных компартментах. Используя такой подход, мы исследовали изменение величины рН в разных клетках тканей мозга при ишемии и реперфузии, показав, что динамика изменений рН в разных структурах мозга при инсульте может существенно отличаться. В 2019 году произошел революционный прорыв в области разработок генетически кодируемых биосенсоров. В коллекции инструментария редокс-биологии появились сверхбыстрые и сверхчувствительные биосенсоры, флуоресцентный сигнал которых стабилен в клетках даже в условиях сильный изменений рН. Таким образом, совокупность имеющихся на данный момент технических и методологических подходов позволяет, наконец, вывести исследования патологических процессов мозга на совершенно новый уровень. Впервые в реальном времени нами будет показана динамика окислительного стресса при ишемии тканей мозга и последующей реперфузии не только в разных клетках и их компратментах, но и в разных зонах повреждения: ядерной зоне инсульта и зоне ишемической полутени (пенумбре). Одновременно с in vivo исследованиями в рамках Проекта мы будем изучать динамику окислительного стресса и ацидоза в нейронах и астроцитах первичной гиппокампальной культуры клеток в условиях гипоксии-реоксигенации. Данная модель позволит нам исследовать зависимость динамики этих процессов от концентрации биохимических субстратов в среде, а также выявить возможные эффекты влияния ингибирования клеточных систем транспорта лактата и потенциальных источников активных форм кислорода после реоксигенации. Подход in vivo исследования биологических процессов с помощью оптического волокна не позволяет визуализировать отдельные клетки и внутриклеточные структуры. Однако для некоторых задач, например, при исследовании взаимодействий разных типов клеток, необходим другой метод регистрации сигнала. Теоретически для решения подобных задач можно использовать флуоресцентную микроскопию тканей мозга in vivo через краниальное окно. Однако возможности этого метода сильно ограничены крайне низкой прозрачностью мозговой ткани в видимой части спектра. Решить эту задачу позволяет использование технологии многофотонной микроскопии. Переход в дальне-красную и ближнюю инфракрасную области спектра существенно увеличивает глубину, на которой возможно производить наблюдение в тканях, сохраняя при этом высокое пространственное разрешение. Принцип основан на том, что используемый в модели хромофор одновременно поглощает два или три инфракрасных фотона, после чего эмиссия наблюдается в видимом диапазоне спектра. В рамках Проекта с использованием подхода мультифотонной микроскопии мы впервые проведем in vivo визуализацию клеток коры головного мозга крыс через краниальное окно при развитии ишемического инсульта. Мы также сосредоточимся на исследовании в клетках ацидоза и окислительного стресса при инсульте.

Ожидаемые результаты
С появлением недавно разработанных технологий в рамках Проекта 2020 нами будет впервые исследована динамика окислительного стресса в разных типах клеток и их компартментах в тканях мозга модельного объекта крысе при развитии ишемического инсульта в режиме реального времени. Созданный подход позволяет регистрировать динамику сигнала используемого биосенсора в любых координатах мозга, таким образом, динамика окислительного стресса будет исследована в ядерной зоне инсульта, а также в тканях на периферии в зоне ишемической полутени. Несмотря на актуальность данной темы и многочисленные попытки создать терапию лечения на основе подавления в клетках окислительного стресса, из-за отсутствия подходящих методов исследования in vivo динамика активных форм кислорода при инсульте головного мозга до сих пор не была показана прямым способом. Подобные сведения представляют огромную ценность для медицины, и только сейчас полученный инструментарий позволяет провести исследования на таком уровне. Мы также продолжим исследования динамики ацидоза тканей мозга при ишемии-реперфузии и получим больших данных о динамике значения рН в ядерной зоне инсульта, пенумбре и в здоровых тканях, клетки которых в некоторых структурах мозга также демонстрируют закисление. Мы исследуем динамику окислительного стресса и ацидоза с помощью биосенсоров в разных компартментах нейронов и астроцитов первичной гиппокампальной культуры клеток в условиях гипоксии-реоксигенации. Это позволит сравнить особенности изучаемых процессов на выделенных клетках и в составе тканей целого организма. Данные результаты имеют фундаментальное значение, поскольку внесут вклад в общее понимание целесообразности применения клеточных моделей в изучении сложных заболеваний, как, например, в нашем исследовании патогенеза инсульта головного мозга. В случае обнаружения общих закономерностей внутриклеточных патологических процессов in vivo при инсульте и в культуре клеток при гипоксии-реоксигенации, на клеточной модели мы получим сведения о том, как динамика ацидоза и окислительного стресса зависят от концентрации в среде энергетических субстратов, например, глюкозы. Используя ингибиторы клеточных систем транспорта лактата и потенциальных источников активных форм кислорода, мы выявим по изменению динамики рН и концентрации пероксида водорода, какие из клеточных систем вносят больший вклад в развитие патологического состояния клеток при гипоксии-реоксигенации. Исследования будем проводить на смешанной культуре нейронов и клеток глии, а также на изолированных нейронах. Это позволит установить, зависит ли от клеточного окружения нейронов динамика развития ацидоза и окислительного стресса в исследуемой модели. Разработанный нами подход может оказаться полезным для последующих исследований. В частности, полученная модель микроскопии клеток в условиях гипоксии-реоксигенации в дальнейшем может быть использована для скрининга соединений, воздействующих на биохимические внутриклеточные события клеток, динамика которых визуализируется с помощью генетически кодируемых биосенсоров. Подходы, влияющие на патологические состояния клеток, которые могут быть найдены с помощью такого способа, в дальнейшем могут быть протестированы на модели визуализации патологических процессов in vivo. С помощью подхода мультифотонной микроскопии мы впервые проведем in vivo микроскопию нейронов и астроцитов, экспрессирующих флуоресцентные биосенсоры, в коре головного мозга крыс при развитии ишемического инсульта. Это позволит регистрировать события одновременно в разных типах клеток, а также исследовать их взаимодействия при развитии патологических состояний.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---