Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Исследования в рамках Проекта в 2020 г. были посвящены расширению знаний о разнообразии амилоидных белков растений и их функций. Нами впервые было проведено исследование амилоидных свойств запасных белков семян посевного гороха P. sativum L. легумина А2 и конвицилина. Эти белки ранее были идентифицированы в протеомном скрининге белков, формирующих амилоидоподобные детергент-устойчивые агрегаты в семенах гороха. Полученные в рамках настоящего этапа работы данные впервые показали, что в определенных условиях оба этих белка формируют фибриллы, обладающие устойчивостью к обработке холодными ионными детергентами, связывающие амилоид-специфичный краситель Тиофлавин-Т и демонстрирующие двойное лучепреломление при связывании красителя Конго красный. Эти результаты свидетельствуют в пользу наличия амилоидогенных свойств у легумина А2 и конвицилина in vitro. Связывание конго красного и формирование двойного лучепреломления клетками бактерий, секретирующих легумин А2 и конвицилин в системе C-DAG, показывает, что эти белки могут формировать амилоидоподобные агрегаты и в условиях, приближенных к in vivo. Амилоидные свойства этих белков in vivo планируется проверить в рамках следующего этапа работ. Эти результаты представляют значительный интерес, так как свидетельствуют в пользу того, что разные запасные белки могут быть представлены в амилоидной форме в семенах и, потенциально, образовывать сложные агрегаты, состоящие из белков разных групп. Взаимодействие различных амилоидов растений друг с другом и с амилоидами человека и бактерий планируется изучить в 2021 году, для чего в рамках данного этапа проекта получены в препаративных количествах фибриллы требуемых белков. Необходимо отметить, что легумины, конвицилин и вицилин, амилоидные свойства которого были показаны нами [Antonets et al., PLOS Biology, 2020], относятся к глобулинам семян, имеющим домены древнего суперсемейства Cupin, представленные в белках как прокариот, так и эукариот, и обладающие структурой бета-баррель. Основываясь на полученных нами данных можно предположить, что именно эти домены являются ключевыми детерминантами амилоидных свойств глобулинов семян, а также потенциально могли бы обуславливать их взаимодействие в амилоидной форме. Другим аспектом функциональных свойств амилоидов запасных белков семян растений, который был изучен в рамках настоящего исследования, было возможное участие этих белков в защите растений от патогенов. Хорошо известно, что купиновые белки, к которым относятся и глобулины семян, играют важную роль в защите растений от патогенов, прежде всего, благодаря своей лектиновой активности. Мы изучили особенности продукции белка вицилина в различных органах растения гороха и выяснили, что если в листьях и стебле наблюдается достаточно низкая продукция этого белка, то в корне вицилин продуцируется на значительно более высоком уровне и образует хорошо детектируемые при помощи флуоресцентной микроскопии агрегаты. Более того, особенно высокий уровень продукции вицилина наблюдался в корневых клубеньках гороха, где было отмечено как диффузное свечение, которое может свидетельствовать в пользу наличия вицилина в растворимой или олигомерной форме, так и крупных агрегатов. Данные о естественной сверхпродукции вицилина в корнях и клубеньках гороха свидетельствуют в пользу его возможной вовлеченности в надорганизменные растительно-микробные взаимодействия. Несмотря на то, что взаимодействия растений с клубеньковыми бактериями являются мутуалистическими, молекулярные системы, обуславливающие взаимодействия «патоген-хозяин» и «симбионт-хозяин», обладают существенным сходством [см., например, обзор Kosolapova et al., Int. J. Mol. Sci., 2020], поэтому взаимодействие вицилина с бактериями в клубеньках может потенциально свидетельствовать и о его взаимодействии с патогенами. Мы проанализировали влияние амилоидных фибрилл вицилина на рост патогенных бактерий Rhodococcus fascians и гриба Fusarium solani, в результате чего было обнаружено, что амилоиды вицилина подавляют рост этих видов, хотя эффекты в отношении F. solani были выражены слабее, что может быть связано с конкретными особенностями использованных сред и режимов культивирования. Более того, с использованием дрожжей S. cerevisiae нами было показано, что дизрупция фибрилл вицилина при помощи ультразвука приводит к элиминации токсичности, то есть именно фибриллярное амилоидное состояние вицилина вызывает ингибирование роста грибов. Таким образом, данные, полученные нами в рамках выполнения настоящего этапа Проекта, показывают, что фибриллы вицилина оказывают существенное ингибирующее влияние на рост патогенных микроорганизмов, что свидетельствует в пользу возможного участия этого белка в амилоидной форме в защите от патогенов. В целом, в рамках выполнения данного этапа Проекта впервые получены приоритетные данные об амилоидных свойствах запасных белков семян гороха P. sativum L. легумина А2 и конвицилина in vitro, а также показано что вицилин продуцируется и агрегирует в различных органах этого растений, причем максимальная продукция этого белка достигается в корне и корневых клубеньках, а его амилоиды токсичны для патогенных для растения грибов и бактерий. Публикации по результатам выполнения Проекта в 2020 году: 1. Kosolapova A.O., Antonets K.S., Belousov M.V., Nizhnikov A.A. Biological functions of prokaryotic amyloids in the interspecies interactions: facts and assumptions // International Journal of Molecular Sciences, 2020, V.21, e7240. 2. Antonets K.S., Belousov M.V., Sulatskaya A.I., Belousova M.E., Kosolapova A.O., Sulatsky M.I., Andreeva E.A., Zykin P.A., Malovichko Y.V., Shtark O.Y., Lykholay A.N., Volkov K.V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Kochetkova E.Y., Bobylev A.G., Usachev K.S., Demidov O.N., Tikhonovich I.A., Nizhnikov A.A. Accumulation of storage proteins in plant seeds is mediated by amyloid formation // PLOS Biology, 2020, V.18(7), e3000564.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Исследования в рамках Проекта в 2021 году были направлены на анализ амилоидных свойств белков растений и клубеньковых бактерий in vivo, а также их взаимодействий и влияния на агрегацию друг друга и амилоидогенез других белков. Нами был выполнен анализ амилоидных свойств белков RopA и RopB у бактероидов и недифференцированных клеток из клубеньков гороха линий Sprint-2 и Sprint-2Fix-, соответственно. Способность этих белков образовывать амилоидные фибриллы у свободноживущей культуры R. leguminosarum, находящейся в стационарной фазе роста, была показана нами ранее. В настоящей работе удалось установить, что подобные фибриллы образуют и бактероиды R. leguminosarum, находящиеся в корневых клубеньках, что может свидетельствовать в пользу потенциальной функциональной значимости амилоидогенеза RopA и RopB. Известно, что экспрессия генов ropA и ropB увеличивается на ранних этапах клубенькообразования, а количество амилоидов RopA у свободноживущей культуры возрастает при стимуляции клеток флавоноидом лютеолином, имитирующей начальные этапы формирования симбиотических отношений. Эти данные также свидетельствуют в пользу вовлеченности амилоидогенеза RopA и RopB в надорганизменные взаимодействия. Амилоидные свойства RopA и RopB у бактероидов и недифференцированных клеток, выделенных из клубеньков гороха линий Sprint-2 и Sprint-2Fix-, соответственно, показаны в данном исследовании при помощи целого спектра методов, включающих анализ устойчивости к обработке ионными детергентами, трансмиссионную электронную и поляризационную микроскопию. Также RopA и RopB были выявлены при помощи протеомного анализа в составе детергент-устойчивых белковых фракций клубеньков гороха линий Sprint-2 и Sprint-2Fix-, инокулированного R. leguminosarum. Протеомный анализ также выявил формирование детергент-устойчивых агрегатов ряда запасных белков (вицилин, легумины, конвицилин) в корневых клубеньках гороха линии Sprint-2. Примечательно, что клубеньки гороха линии Sprint-2Fix-, в которых дифференцировка клеток R. leguminosarum в бактероиды не происходит, не содержат агрегаты запасных белков. Эти данные свидетельствуют в пользу специфичности формирования амилоидных агрегатов запасных белков гороха в клубеньках, содержащих дифференцированные бактероиды R. leguminosarum, что, возможно, связано со специфичными механизмами контроля надорганизменных взаимодействий, однако это предположение требует дальнейшего анализа. Сам описанный нами феномен амилоидной агрегации запасных белков гороха в корневых клубеньках при формировании эффективных симбиотических отношений, обладает новизной на мировом уровне. Необходимо отметить, что, как нам удалось показать в 2021 году, различные запасные белки семян гороха обладают амилоидными свойствами в нативных условиях in vivo, а их агрегаты взаимодействуют. Так, нам удалось полностью показать амилоидные свойства легумина A2 in vivo (детергент-устойчивость, формирование фибрилл, двойное лучепреломление при связывании конго красного), а также при помощи ко-иммунопреципитации выявить ко-агрегацию амилоидов вицилина и легумина. Таким образом, амилоидогенезу, по-видимому, подвержены различные запасные белки семян, причем этот процесс сопровождается формированием сложных амилоидных комплексов, включающих в себя агрегаты различных белков. Еще одним важным результатом, полученным в 2021 году, стало выявление ингибирующего влияния «затравок» из фибрилл амилоидных белков растений на амилоидогенез патологических амилоидных белков человека. Этот эффект был установлен при оценке влияния «затравок» из амилоидов растений на фибриллогенез лизоцима, инсулина, бета-2-микроглобулина и амилоидного пептида-бета человека, и является, на наш взгляд, крайне важным и неожиданным, поскольку показывает, что амилоидные фибриллы запасных белков растений, попадающие в организм человека с пищей, не индуцируют амилоидогенез белков человека. Наличие такого эффекта и возможного патогенеза можно было бы предположить, исходя из известных фактов о кросс-индукции амилоидогенеза при взаимодействии различных амилоидных белков друг с другом. Тем не менее, как нами установлено, амилоидные фибриллы растений, напротив, подавляют патологический амилоидогенез белков человека, что потенциально может являться принципиально новым механизмом защиты от амилоидозов. Таким образом, в рамках работы по Проекту в 2021 году нами показано формирование амилоидов RopA и RopB бактероидами R. leguminosarum, впервые показаны амилоидные свойства белка легумина А2 семян гороха in vivo и взаимодействие амилоидов легумина и вицилина друг с другом. Описано формирование амилоидов запасных белков растений в эффективных клубеньках P. sativum L. Впервые установлено ингибирующее влияние «затравок» из амилоидных фибрилл растений на амилоидогенез белков человека. Эти результаты обладают новизной на мировом уровне и свидетельствуют в пользу того, что система взаимодействий амилоидов различных организмов является селективной и участвует в контроле выполнения важных биологических функций. Публикации по Проекту в 2021 году: 1. Sulatskaya A.I., Kosolapova A.O., Bobylev A.G., Belousov M.V., Antonets K.S., Sulatsky M.I., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Stepanenko O.V., Nizhnikov A.A. β-Barrels and Amyloids: Structural Transitions, Biological Functions, and Pathogenesis // International Journal of Molecular Sciences, 2021, V.22, e11316. https://doi.org/10.3390/ijms222111316 2. Belousov M., Zykin P., Andreeva E., Kosolapova A., Shtark O., Vasileva E., Antonets K., Nizhnikov A. The Aggregates of Vicilin Protein Are Found in the Roots and Nodules of Pisum sativum L. // The FASEB Journal V.35, S1, 02280. https://doi.org/10.1096/fasebj.2021.35.S1.02280 Также одна из публикаций по данному Проекту вышла в конце 2020 года и не вошла в отчет за прошлый год: 3. Malovichko Y.V., Shtark O.Y., Vasileva E.N., Nizhnikov A.A., Antonets K.S. Transcriptomic signatures of seed maturation heterochrony in garden pea (Pisum sativum L) accessions // BMC Bioinformatics, 2020, V.21, Suppl 20, e567, P10. https://doi.org/10.1186/s12859-020-03838-2