КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 20-64-46027

НазваниеСтруктурно-динамические исследования внутри- и межмолекулярных взаимодействий амилоидогенных пептидов и их предшественников для установления молекулярных механизмов патогенеза и разработки таргетных методов терапии нейродегенеративных заболеваний

РуководительБочаров Эдуард Валерьевич, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2020 г. - 2022 г.

Конкурс№46 - Конкурс 2020 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (ведущие ученые).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые слованейродегенеративные заболевания, болезнь Альцгеймера, амилоидогенные белки и пептиды, мембранные белки, внутриклеточные органеллы, белковая инженерия, структурная биология, биофизика, конфокальная флуоресцентная микроскопия,молекулярные механизмы патогенеза, внутримолекулярная динамика, пространственная структура, межмолекулярные взаимодействия, функциональные тесты, таргетные лекарственные препараты

Код ГРНТИ34.15.15

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Стремительное увеличение доли пожилых людей, нуждающихся в уходе и медицинской поддержке, является серьезной социальной и экономической проблемой в развитых странах. Процесс старения включает в себя различные нейродегенеративные заболевания, нарушающие сложную сеть метаболических и сигнальных путей. Болезнь Альцгеймера - самый распространенный в мире вид нейродегенеративного заболевания, которым ежегодно заболевает несколько миллионов человек. С увеличением продолжительности жизни вероятность развития этого вида деменции возрастает многократно. Клинические проявления болезни Альцгеймера объясняются избирательной дегенерацией нейронов в участках коры головного мозга, ответственных за когнитивное восприятие и память. В патогенезе болезни Альцгеймера задействованы различные пептиды и белки, в том числе амилоидогенные: прежде всего, бета-амилоидный пептид (Aβ), а также взаимодействующие с ним Тау-белок и прионный белок PrP. Несмотря на обширные исследования и огромное количество информации, полученной по различным аспектам болезни Альцгеймера, эффективного метода лечения по-прежнему не существует. Вне нервных клеток, в местах контакта нейронов, накапливается пептид Aβ, который собирается в упорядоченные тяжи, фибриллы, формирующие так называемые амилоидные бляшки. Предложенные методы лечения, основаны на разрушении внеклеточных отложений Aβ, которые могут привести к получению гораздо более опасных небольших олигомеров Aß, способных воздействовать на функцию амилоидогенных белков (таких как, Тау-белок и белок PrP), мембранных рецепторов и каналов (например, рецептор RAGE), а также внутриклеточных органелл (таких как митохондрии), приводя к угнетению функции нейронов и клеточной смерти. Результаты нашего исследования составят фундаментальную основу для разработки лекарств направленных на предотвращение ключевых взаимодействий опасных малых олигомеров пептида Aβ с их молекулярными мишенями, в том числе, прионным белком PrP, рецептором конечных продуктов гликозилирования RAGE и митохондриями нейронов. Существует огромная потребность в мире в создании терапевтического потенциала основанного на структурно-динамических исследованиях для определения целей и выяснения способа предотвращения взаимодействий мономеров и олигомеров Aβ с белками и клеточными органеллами. Одним из наиболее перспективных подходов терапии болезни Альцгеймера признано непосредственное вмешательство в первичное звено патогенетического процесса путем селективного воздействия на распознавание, связывание и аномальный протеолиз секретазами в мембране белка предшественника Aβ (APP), непосредственно вовлечённого в патогенез болезни Альцгеймера. Создание эффективных таргетных фармакологических соединений с направленной доставкой к определенным молекулярным системам невозможно без детального понимания разнообразных динамических межмолекулярных взаимодействий, обеспечивающих их биологическую активность. Проект направлен на комплексные структурные, биофизические и биохимические исследования механизмов межмолекулярных взаимодействий Aβ и мембранных фрагментов APP (субстратов мембранных секретаз, предшественников Aβ) с их молекулярными мишенями и фармакологическими соединениями перспективными для терапии болезни Альцгеймера. В качестве основных исследуемых соединений выбран D-энантиомерный пептид D3 и его производные (Van Groen et al., 2015), показавшие свою эффективность на модельных системах in vitro и in vivo в предотвращении токсичной олигомеризации Aβ, взаимодействия Aβ с белками-мишенями и развития болезни Альцгеймера, а также иллюстрирующие подход использования структурно-комплиментарных D-энантиомерных пептидов для предотвращения фибрилляции (Perov et al., PLoS pathogens 2019). Впервые с помощью комплексного подхода на основе интеграции взаимодополняющих методов структурной биологии, биохимии и биофизики будут решены структуры пептидов Aβ и их предшественников - мембранных фрагментов APP (дикого типа и с мутациями аминокислотных остатков, ассоциированных с семейными формами болезни Альцгеймера) с их молекулярными мишенями и терапевтическими D3-пептидами. Для решения задачи планируется использовать такие методы как белковая инженерия, флуоресцентная конфокальная микроскопия, круговой дихроизм, малоугловые рентгеновское и нейтронные рассеяния, рентгеновская кристаллография, криоэлектронная и атомно-силовая микроскопии, спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), определение контстанты диссоциации с помощью микроскопического термофореза (MST, МСТ) и поверхностного плазмонного резонанса (SPR, ППР), компьютерное моделирование. Будет сделано детальное сравнительное описание внутри- и межмолекулярных взаимодействий (белок-белок, белок-липид, белок-вода) для комплексов D3-пептидов с Aβ и фрагментами APP, в том числе в различных олигомерных состояниях, в комплексах Aβ с белками-мишенями (функциональные фрагменты белка PrP и рецептора RAGE) и в мембранном окружении различного состава. Будет проанализировано влияние патогенных мутаций на межмолекулярные взаимодействия D3 и Aβ и их предшественников – фрагментов APP. Будет визуализировано и охарактеризовано распределение D3-пептидов, взаимодействующих с Aβ и АРР в плазматической мембране и внутриклеточных органеллах. Выполнение поставленной задачи позволит выявить структурно-функциональные детерминанты и описать биофизические принципы межмолекулярных взаимодействий, отвечающих за процессы распознавания Aβ и белка АРР потенциальными лигандами, предотвращающими патогенетические процессы и влияющими на протеолитическую активность мембранных секретаз. Результаты проекта будут также востребованы для установления молекулярных механизмов начальных стадий патогенеза болезни Альцгеймера. Полученные знания составят фундаментальную и практическую основу для разработки эффективных таргетных фармакологических соединений с направленной доставкой к определенным молекулярным системам, связанных с амилоидогенезами в организме человека.

Ожидаемые результаты
Все научные результаты, ожидаемые в ходе комплексных структурно-динамических и биофизических исследований межмолекулярных взаимодействий Aβ и фрагментов APP с их молекулярными мишенями (на примере прионного белка PrP и рецептора RAGE) и фармакологическими соединениями, перспективными для терапии болезни Альцгеймера, будут получены впервые в мире: (1) Выявлены структурно-функциональные детерминанты и описаны биофизические принципы межмолекулярных взаимодействий, отвечающих за процессы распознавания Aβ и их предшественников с молекулярными мишенями (на примере прионного белка PrP и рецептора RAGE) и потенциальными лигандами, предотвращающими патогенетические процессы. (2) Впервые получены пространственные структуры и описана динамика комплексов D3-пептидов с Aβ и их предшественниками, трансмембранными фрагментами белка APP. (3) Детально описаны внутри- и межмолекулярные взаимодействия (белок-белок, белок-липид, белок-вода) для комплексов D3-пептидов с Aβ и трансмембранными фрагментами APP, а также в составе комплексов с белками-мишенями (на примере функциональных фрагментов прионного белка PrP и рецептора RAGE). (4) Описано влияние аминокислотных мутаций, ассоциированных с семейными формами болезни Альцгеймера на взаимодействие Aβ и их предшественников с D3-пептидами и с белками-мишенями (на примере прионного белка PrP и рецептора RAGE). (5) Охарактеризовано распределение D3-пептидов, взаимодействующих с Aβ и их предшественниками в плазматической мембране и внутриклеточных органеллах. Область фундаментального и практического применений результатов проекта – структурная биология, биотехнология, биоинженерия и медицина. Обобщение и анализ полученных результатов поможет на молекулярном уровне описать каскад событий, происходящих внутри и вблизи клеточной мембраны нейронов при последовательном протеолизе АРР, токсичной олигомеризации Aβ и взаимодействия Aβ с их молекулярными мишенями (на примере прионного белка PrP, рецептора RAGE) и клеточными органеллами, а также выявить ключевые факторы, приводящие к развитию болезни Альцгеймера. Систематическое исследование молекулярных механизмов, межмолекулярных взаимодействий Aβ и их предшественников с перспективными фармакологическими соединениями приведет к новым и перспективным вариантам терапии для замедления прогрессирования заболевания. В результате выполнения заявленного проекта на основе взаимодополняющих методов структурной биологии будет разработан комплексный подход и создана наукоёмкая технологическая платформа для разработки и оптимизации прототипов фармакологических соединений и создания лекарственных препаратов нового поколения для адекватной терапии и ранней диагностики ряда социально-значимых заболеваний, связанных амилоидогенезами. Учитывая огромный интерес российских и зарубежных фармацевтических компаний к решению проблемы нейродегенеративных заболеваний, результаты заявленного проекта будут ориентированы на широкое применение в научно-исследовательских организациях и фирмах-производителях наукоёмкой продукции.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Детальная информация о структуре, динамике и разнообразных межмолекулярных взаимодействий для биомолекул, непосредственно вовлеченных в развитие болезни Альцгеймера, требуются для как для раскрытия фундаментальных механизмов патогенеза нейродегенеративных заболеваний человека, так и для рациональной разработки новых биологически активных соединений и скрининга существующих для получения наиболее эффективных кандидатов в лекарственные средства. Проект направлен на комплексные структурные, биофизические и биохимические исследования механизмов межмолекулярных взаимодействий для амилоидных β-пептидов (Aβ) и их предшественников (мембранных фрагментов белка предшественника β-амилоида, АРР) с разнообразными молекулярными и внутриклеточными мишенями (на примере прионного белка PrP, α-синуклеина, рецептора конечных продуктов гликозилирования RAGE и митохондрий), а также фармакологическими соединениями (такими как D-энантиомерные D3-подобные пептиды) перспективными для терапии болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний, связанных с амилоидогенезами в организме человека. Для решения задачи на отчетном этапе были использованы такие методы структурной биологии как белковая инженерия, микромасштабный термофорез (MST, МСТ), флуоресцентная конфокальная микроскопия, спектроскопия кругового дихроизма (CD, КД), криоэлектронная (cryo-EM, крио-ЭМ) и атомно-силовая микроскопии (AFM, АСМ), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (NMR, ЯМР) и компьютерное моделирование, в частности методы молекулярной динамики (МД). В итоге в 2020 году российским коллективом Проекта совместно с ведущими учеными профессором Дитером Вильбольдом и доктором Лотаром Гремером были получены следующие основные научные результаты: На основе разработанных участниками проекта бесклеточных систем экспрессии и очистки для структурно-динамических исследований наработаны в препаративных количествах немеченые и 13C/15N-изотопно-меченые образцы следующих фрагментов APP: i) Фрагментов АРР Asp672-Lys726 (APPmc, Aβ1-55) и Gln686-Lys726 (APPjmtm, Aβ15-55) дикого типа, содержащих ТМ домен APP с примембранными (juxtamembrane) внеклеточными N-концевыми участками и включающие или невключающие металл-связывающий домен бета-амилоида, что соответствует протеолизу APP β - и α-секретазами); ii) фрагментов АРР Gln672-Lys726 с патогенными мутациями Glu693Gly («арктическая» форма) и Asp694Asn («айовская» форма), расположенными во внеклеточном примембранном участке, входящем в состав Aβ пептидов, и в ТМ сегменте Leu723Pro («австралийская» форма) в области протеолиза АРР γ-секретазой. Получены фрагменты как с одиночными мутациями, так и с двойными и тройными аминокислотными заменами: L723P-APPmc, E693G/D694N-APPmc, и E693G/D694N/L723P-APPmc. Мембранные фрагменты APP были встроены в цвиттерионные DPC мицеллы. Для структурно-динамических исследований специфических взаимодействий фрагментов APP (Aβ различной длины) с перспективными фармакологическими соединениями на первом этапе Проекта был выбран D-энантиомерный пептид D3, который был разработан для терапии болезни Альцгеймера под руководством ведущих ученых Проекта профессора Дитера Вильбольда и доктора Лотара Гремера. Химическим синтезом получены пептид D3 и его флуоресцентно- и спин-меченые производные. С помощью гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения в сочетании с методами микромасштабного термофореза, спектроскопии кругового дихроизма и молекулярной динамики напрямую зарегистрировано и детально исследовано взаимодействие D3-подобных пептидов с мембраносвязанными фрагментами APP, APPmc (Aβ1-55) и APPjmtm (Aβ15-55). Помимо фрагмента APPmc дикого типа, в экспериментах по связыванию с пептидом D3 были использованы фрагменты с семейными мутациями: L723P-APPmc, E693G/D694N-APPmc, и E693G/D694N/L723P-APPmc. МСТ-измерениями обнаружено, что флуоресцентно-меченый пептид D3 взаимодействует с мембрано-связанным APPmc с константой диссоциации Kd, равной 10,6 мкМ, в то время как мутации E693G/D694N уменьшают энергию D3/APP-взаимодействий с увеличением Kd в два раза, указывая на важность локальных электростатических контактов в образовании комплекса. Методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии показано, что пептид D3 динамически связывается с амфифильным примембранным JM-участком Aβ17-26, способным в зависимости от внешних условий претерпевать конформационный переход из α-спиральной конформации в β-цепь, участвующую в сворачивании β-амилоида в фибриллы. На основе парамагнитного PRE-уширения ЯМР-сигналов была получена пространственная структура комплекса D3-пептид/АРР-фрагмент (D3-пептид/Aβ), встроенного в DPC мицеллы, с последующей МД-релаксацией в явно заданном липидном POPC бислое. Анализ МД-данных показал, что динамические комплексы D3-пептид/АРР-фрагмент не разрушаются в течении 200 нс вдоль всех МД-траекторий, проведенных без ЯМР-ограничений. В комплексе между аминокислотными остатками пептида D3 и АРР-фрагментов происходит динамическое образование многочисленных временных межмолекулярных водородных связей, а также взаимодействия солевой мостик, катион-π и стэкинг-взаимодействия. В итоге, для соединения перспективного для терапии болезни Альцгеймера впервые установлена пространственная структура и охарактеризована динамика лиганд-белок комплекса D3-пептид/АРР-фрагмент (D3-пептид/Aβ) в липидном бислое. Таким образом, были описаны молекулярные интерфейсы и предложены механизмы динамического взаимодействия D3-пептидов с мембраносвязанными фрагментами АРР (прекурсорами Aβ). Выявлено влияние ряда патогенных семейных мутаций AD, расположенных в разных структурно-функциональных частях АРР (Aβ), на связывание пептидов D3. В результате проведённых экспериментов с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии была получена информация о изменении взаимного распределения модельного перспективного фармакологического соединения - пептида D3 и пептида Aβ42 в клетках. Показано, что пептид D3 взаимодействует с Aβ пептидом, препятствуя его взаимодействиям с клеточными органеллами. В итоге, было функционально охарактеризовано протективное воздействие перспективного фармакологического соединения - пептида D3 на митохондрии клеток человека. Была визуализирована внутри- и внеклеточная локализация во времени флуоресцентномеченых D3-пептидов, как модельных перспективных фармакологических соединений, взаимодействующих с Aβ пептидами. Установлена взаимная локализация D3-пептидов с экзогенным Aβ42 в клетках линий нейробластомы человека SH-SY5Y и олигодендроглии крысы OLN-93; определена степень воздействия D3-пептидов на клеточные повреждения, вызванные Aβ. Одной из причин болезни Альцгеймера являются воспалительные процессы, вызванные в том числе вирусными и бактериальными инфекциями. Поэтому важно регулировать и купировать воспалительные процессы и для установления молекулярных механизмов патогенеза и разработки направленных методов терапии нейродегенеративных заболеваний. В рамках тематики Проекта начаты комплексные структурные, биофизические и биохимические исследования взаимодействий Aβ пептидов с одной из их молекулярных мишеней — с рецептором конечных продуктов гликозилирования RAGE, участвующего в регуляции воспалительных процессов в мозге человека. В частности, было исследовано связывание Аβ42 с флуоресцентно-меченым фрагментом рецептора RAGE перспективным для терапии болезни Альцгеймера. Помимо этого, в рамках Проекта были исследованы молекулярные механизмы перспективных таргетных препаратов, воздействующих на гистоноподобные HU-белки бактерий, которые относятся к классу нуклеоид-ассоциированных белков. В рамках Проекта было изучено, как перспективные терапевтические препараты бисфенольных производных флуорена ингибируют биологическую функцию HU-белка из Spiroplasma Melliferum. Методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии, дополненной молекулярной динамикой и сайт-направленным мутагенезом, найден сайт связывания ингибиторов, которые встраиваются в α-спиральный домена HU-белка, что аллостерически влияет на конформационную динамику ДНК-связывающего домена HU-белка и его биологическую функцию. В рамках тематики Проекта ведущими учеными профессором Дитером Вильбольдом и доктором Лотаром Гремером были проведены два исследования, демонстрирующие терапевтический потенциал тандемной версии димерной формы D3-подобного пептида RD2 (RD2RD2) на модели болезни Альцгеймера у трансгенных мышей (APP/PS1) и на модели БАС у трансгенных мышей (SOD1*G93A). Боковой амиотрофический склероз (БАС) — это прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, характеризующееся избирательной гибелью нейронов в стволе головного и спинного мозга. Результаты указывают на то, что D3-подобный пептид RD2RD2 является потенциальным терапевтическим кандидатом против БАС. Также были исследованы взаимодействия прионного белка (PrP) с олигомерами Aβ пептидов болезни Альцгеймера и α-синуклеина (αSyn), вызывающего синаптические нарушения при болезни Паркинсона и других синуклеинопатиях. Для решения задачи были использованы белковая инженерия, флуоресцентная конфокальная микроскопия, атомно-силовая микроскопия, и гетероядерная ЯМР-спектроскопия. Человеческий PrP (huPrP) представляет собой рецептор с высоким сродством к олигомерному Aβ. Анализ данных показал, что в большинстве huPrP(145-230) C-концевая область является частью плотного комплекса, при этом наблюдается потеря регулярной вторичной структуры в двух С-концевых α-спиралях huPrP. N-концевой участок huPrP (23-144) в комплексе остается в значительной степени лишенным постоянной вторичной структуры с конформационной подвижностью основной цепи. В то же время показано, что олигомеры подвижного N-концевой участка huPrP (23−144) объединяются с человеческим αSyn (αSynO) в олигомеры микронного размера. Примечательно, что участок huPrP (95−111), взаимодействующий с αSynO, соответствует области белка, ответственной за когнитивные нарушения, опосредованного αSynO. Результаты исследований предполагают, что αSynO-опосредованная конденсация huPrP участвует в патогенезе синуклеинопатий. В рамках тематики Проекта ведущими учеными профессором Дитером Вильбольдом и доктором Лотаром Гремером были исследованы амилоидные отложения, состоящие из фибриллярных островковых амилоидных полипептидов (IAPP) в островках поджелудочной железы, которые связаны с потерей бета-клеток и вовлечены в диабет 2 типа (T2D). Применение криоэлектронной микроскопии позволило сделать реконструкцию плотности трех доминирующих полиморфов фибрилл IAPP, образованных in vitro из синтетического человеческого IAPP, рассчитать пространственную структуру основного PM1-полиморфа фибрилл IAPP. В результате обнаружено сходство между структурами фибрилл IAPP и Aβ, что особенно заметно с учетом связи между диабетом и AD. Полученная структурная информация может служить основой для определения механизмов образования амилоида и токсичности IAPP. Кроме того, фибрилла PM1 может использоваться в качестве целевой структуры для создания зондов для визуализации фибрилл IAPP и ингибиторов роста фибрилл IAPP. Полученные в ходе Проекта знания составят фундаментальную и практическую основу для рационального конструирования лигандов с заданным профилем специфичности и направленной доставки для адекватной терапии болезни Альцгеймера и других заболеваний, связанных с амилоидогенезами в организме человека.

Публикации

1. Аветисян А., Баласанянц С., Симонян Р., Короев Д., Камынина А., Зиновкин Р., ... и Вольпина О. Synthetic fragment (60–76) of RAGE improves brain mitochondria function in olfactory bulbectomized mice Neurochemistry International, Volume 140, November 2020, 104799 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1016/j.neuint.2020.104799

2. Агапова Юлия К., Дмитрий А. Алтухов, Владимир И. Тимофеев, Виктор С. Стройлов, Виталий С. Митянов, Дмитрий А. Корженевский, Анна В. Власкина, Евгения В. Смирнова, Эдуард В. Бочаров, Татьяна В. Ракитина Structure-based inhibitors targeting the alpha-helical domain of the Spiroplasma melliferum histone-like HU protein Scientific reports, Scientific Reports volume 10, Article number: 15128 (2020) (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1038/s41598-020-72113-4

3. Кёниг Анна С., Надин С. Рёзенер, Лотар Гремер, Даниэль Флендер, Вольфганг Хойер, Филипп Нойдекер, Дитер Вильбольд и Хенрике Хайзе Structural details of amyloid beta oligomers in complex with human prion protein as revealed by solid-state MAS NMR spectroscopy bioRxiv, Cold Spring Harbor Laboratory, bioRxiv – 2020 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1101/2020.06.22.164574

4. Пост, Дж., Когель, В., Шаффрат, А., Ломанн, П., Шах, Н. Дж., Ланген, К. Дж., ..., Дитер Вильбольд и Кутче, Дж. A Novel Anti-in ammatory D-peptide Halts Disease Phenotype Progression in an Als Mouse Model Research Square, Research Square 2020 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-30893/v1

5. Рёдер, К., Купрейчик, Т., Гремер, Л., Шефер, Л. У., Потула, К. Р., Равелли, Р. Б., ... и Шредер, Г. Ф. Cryo-EM structure of islet amyloid polypeptide fibrils reveals similarities with amyloid-β fibrils Nature Structural & Molecular BIology, Nature Structural & Molecular Biology volume 27, pages660–667(2020) (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1038/s41594-020-0442-4

6. Розенер, Н.С., Гремер, Л., Вёрдехофф, М.М., Купрейчик, Т., Эцкорн, М., Нойдекер, П., и Хойер, В. Clustering of human prion protein and α-synuclein oligomers requires the prion protein N-terminus COMMUNICATIONS BIOLOGY, Communications Biology volume 3, Article number: 365 (2020) (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1038/s42003-020-1085-z

7. Бочаров Э.В. , К. Павлов, Д. Лесовой, О.В. Бочарова, А. Урбан, Ю.В. Бершатский, П. Волынский, Р. Ефремов, А. Арсеньев MOLECULAR MECHANISMS OF BITOPIC PROTEIN FUNCTIONING REVEALED BY STRUCTURAL-DYNAMIC STUDIES OF TRANSMEMBRANE DOMAIN INTERACTIONS International Conference Condensed Matter Research at the IBR-2 October 12–16,2020 ABSTRACT BOOK Dubna, Russia CMR @ IBR-2, CondensedMatter Research at the IBR-2: Programme and Abstracts of the International Conference (Dubna, Oct. 12–16, 2020). — Dubna: JINR, 2020. — p. 194 (год публикации - 2020)

8. Камынина А., Эстерас Н., Короев Д., Ангелова П., Охрименко И., Вольпина О., Абрамов А. АКТИВАЦИЯ РЕЦЕПТОРА КОНЕЧНЫХ ПРОДУКТОВ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ ЕГО ФРАГМЕНТОМ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 60-76 СТИМУЛИРУЕТ КАЛЬЦИЕВЫЙ СИГНАЛ В НЕЙРОНАХ БИОЛОГИЯ – НАУКА ХХI ВЕКА: 24-я Международная Пущинская школа- конференция молодых ученых. 2020, Пущино. Сборник тезисов, 2020., БИОЛОГИЯ – НАУКА ХХI ВЕКА: 24-я Международная Пущинская школа- конференция молодых ученых. 2020, Пущино. Сборник тезисов, 2020. – 385 с. (год публикации - 2020)

9. Камынина А.В. , Н. Эстерас, Д.О. Короев, И. Охрименко, Н.В. Бобкова, А.Ю. Абрамов, О. Вольпина RAGE PEPTIDE (60-76) AND ITS modified ANALOGUE PROTECT SPATIAL MEMORY IN TRANSGENIC 5ХFAD MICE AND INDUCE CALCIUM SIGNALING VIA ACTIVATION OF RAGE International Conference Condensed Matter Research at the IBR-2 October 12–16,2020 ABSTRACT BOOK Dubna, Russia CMR @ IBR-2, CondensedMatter Research at the IBR-2: Programme and Abstracts of the International Conference (Dubna, Oct. 12–16, 2020). — Dubna: JINR, 2020. — p. 88 (год публикации - 2020)

10. Охрименко И.С. , Ю.А. Загрядская, Ю.Л. Рижиков, А. Куклин, Н.А.Денчер, В.И. Горделий Preparation of liposomes from native cell membrane for SAXS/SANS studies International Conference Condensed Matter Research at the IBR-2 October 12–16,2020 ABSTRACT BOOK Dubna, Russia CMR @ IBR-2, CondensedMatter Research at the IBR-2: Programme and Abstracts of the International Conference (Dubna, Oct. 12–16, 2020). — Dubna: JINR, 2020. — p. 213 (год публикации - 2020)

11. Вильбольд Дитер Development and application of the truly disruptive anti-prionic mode of action for the disease-modifying treatment of neurodegenerative diseases Доклады на Международной школе молодых учёных "Молекулярные механизмы нейродегенеративных заболеваний" (International School "MOLECULAR MECHANISMS OF NEURODEGENERATIVE DISEASES" November 26, 2020 MIPT), - (год публикации - 2020)

12. Гремер Лотар Biophysics on Amyloid-beta/Prion Protein Interaction Доклады на Международной школе молодых учёных "Молекулярные механизмы нейродегенеративных заболеваний" (International School "MOLECULAR MECHANISMS OF NEURODEGENERATIVE DISEASES" November 26, 2020 MIPT), - (год публикации - 2020)

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Болезнь Альцгеймера - самый распространенный в мире вид нейродегенеративного заболевания, которым ежегодно заболевает несколько миллионов человек, причем с возрастом вероятность развития этого вида деменции возрастает многократно. Детальная информация о структуре, динамике и разнообразных межмолекулярных взаимодействий для биомолекул, непосредственно вовлеченных в развитие болезни Альцгеймера, требуются для как для раскрытия фундаментальных механизмов патогенеза нейродегенеративных заболеваний человека, так и для рациональной разработки новых биологически активных соединений и скрининга существующих для получения наиболее эффективных кандидатов в лекарственные средства. Проект направлен на комплексные структурные, биофизические и биохимические исследования механизмов межмолекулярных взаимодействий для амилоидных β-пептидов (Aβ) и их предшественников (мембранных фрагментов белка предшественника β-амилоида, АРР) с разнообразными молекулярными и внутриклеточными мишенями (на примере прионного белка PrP, α-синуклеина, белка Тау, рецептора конечных продуктов гликозилирования RAGE и митохондрий), а также фармакологическими соединениями (такими как D-энантиомерные D3-подобные пептиды) перспективными для терапии болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний, связанных с амилоидогенезами в организме человека. Предшественник D3 состоящий из L-аминокислот был выбран в начале 2000х с помощью фагового дисплея как пептид взаимодействующий с мономерным пептидом Aβ42 составленным из остатков D-аминокислот. В начале пептидная библиотека включала в себя более миллиарда различных случайных 12-мерных последовательностей. Далее из таких же аминокислотных остатков был составлен D3 состоящий из остатков D-аминокислот. При этом было проверено взаимодействие с нативным пептидом Aβ42 (Van Groen, et al., ChemMedChem 2008). Фактически D3 и его производные являются «инвертированным зеркальным отображением» Aβ, что делает их интересными фундаментальными объектами и перспективными инструментами исследования молекулярных механизмов патогенеза болезни Альцгеймера. Для решения задачи на отчетном этапе были использованы такие методы структурной биологии как белковая инженерия, микроскопический термофорез (MST, МСТ), флуоресцентная конфокальная микроскопия, поляризация флуоресценции, микрожидкостная диффузионная калибровка (МДК, MDS), круговой дихроизм (CD, КД), криоэлектронная (cryo-EM, крио-ЭМ) и атомно-силовая микроскопии (AFM, АСМ), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (NMR, ЯМР) высокого разрешения и компьютерное моделирование. В итоге 2021 году российским коллективом Проекта совместно с ведущими учеными из Германии профессором Дитером Вильбольдом и доктором Лотаром Гремером и ведущими учеными из России профессором И.М. Кузнецовой и профессором К.К. Туроверовым были получены следующие основные научные результаты: На основе разработанных участниками проекта бесклеточных систем экспрессии и очистки для продолжения структурно-динамических исследований наработаны в препаративных количествах немеченые и 13C,15N-изотопно-меченые образцы следующих фрагментов белков человека PrP и APP: i) Фрагмент PrP Lys23-Asp144 (huPrP-N) дикого типа, содержащую подвижную N-концевую последовательность с катион-связывающими участками; ii) Фрагментов АРР Asp672-Lys726 (APPmc, Aβ1-55) и Gln686-Lys726 (APPjmtm, Aβ15-55) дикого типа, содержащих ТМ домен APP с примембранными (juxtamembrane) внеклеточными N-концевыми участками и включают или нет металл-связывающий домен бета-амилоида, что соответствует щеплению APP β - и α-секретазами); iii) Фрагментов АРР Gln672-Lys726 с патогенными мутациями Glu693Gly («арктическая» форма) и Asp694Asn («айовская» форма), расположенными во внеклеточном примембранном участке, входящего в состав Aβ пептидов, и в ТМ сегменте Leu723Pro («австралийская» форма) в области протеолиза АРР γ-секретазой. Получены фрагменты как с одиночными мутациями, так и с двойными и тройными аминокислотными заменами: L723P-APPmc, E693G/D694N-APPmc, и E693G/D694N/L723P-APPmc. Мембранные фрагменты APP были встроены в цвиттерионные DPC мицеллы. Для структурно-динамических исследований специфических взаимодействий фрагментов APP (Aβ различной длины) с перспективными фармакологическими соединениями на первом этапе Проекта были выбраны D-энантиомерные пептиды D3, D3-D3 (ковалентный димер), и RD2, RD2-RD2 (два последних показывают наилучшие терапевтические свойства, причём RD2 уже проходит 2 стадию клинических испытаний для терапии болезни Альцгеймера). Химическим синтезом получены данные D3-подобные пептиды и их флуоресцентно- и спин-меченые производные. С помощью гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения в сочетании с методами микроскопического термофореза, поляризации флуоресценции, микрожидкостной диффузионной калибровки, кругового дихроизма и молекулярной динамики напрямую зарегистрировано и детально исследовано взаимодействие D3-подобных пептидов с мембраносвязанными фрагментами APP, APPmc (Aβ1-55) и APPjmtm (Aβ15-55). Помимо фрагмента APPmc дикого типа, в экспериментах по связыванию с D3-подобными пептидами были использованы фрагменты с семейными мутациями: L723P-APPmc, E693G/D694N-APPmc, и E693G/D694N/L723P-APPmc. Методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии показано, что пептид D3 динамически связывается с амфифильным примембранным JM-участком Aβ17-26, способным в зависимости от внешних условий претерпевать конформационный переход из α-спиральной конформации в β-цепь, участвующую в сворачивании β-амилоида в фибриллы. Характер уширения ЯМР-сигналов показывает, что взаимодействие D3-подобных пептидов является динамичным, с быстрыми конформационными перестройками и изменениями контактирующих групп аминокислотных остатков в противостоящих субъединицах комплекса характерно для IDP/IDP-подобных взаимодействий (intrinsically disordered proteins, внутренне неупорядоченных белков). На основе парамагнитного PRE-уширения ЯМР-сигналов была получена модель комплекса RD2-пептид/АРР-фрагмент (RD2-пептид/Aβ), встроенного в DPC мицеллы. Таким образом, были описаны молекулярные интерфейсы и предложены механизмы динамического взаимодействия D3-подобных пептидов с мембраносвязанными фрагментами АРР (прекурсорами Aβ). Выявлено влияние ряда патогенных семейных мутаций AD, расположенных в разных структурно-функциональных частях АРР (Aβ), на связывание пептидов RD2. С помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии показано, что флуоресцентно-меченные D-энантиомерные пептиды D3 и RD2 взаимодействующие с Aβ проникают в клетки нейробластомы SH-SY5Y дифференцированной с помощью ретиноевой кислоты практически сразу же после их добавления в культуральную среду. Экзогенный Aβ1-42, напротив, практически не имеет внутриклеточной локализации в клетках дифференцированной нейробластомы SH-SY5Y во все времена наблюдения начиная с 30 минут после его добавления к клеткам и заканчивая 48-ю и даже 72 часами. Отмечена существенная примембранная локализация Aβ1-42 со внешней стороны клеточной мембраны. В экспериментах по изучению изменений работы комплексов окислительного фосфорилирования выработка АТФ митохондриями, выделенными из клеток нейробластомы SH-SY5Y предварительно культивируемых в присутствии Aβ1-42, Aβ1-40, Aβ22-40, снижается как в абсолютном выражении, так и в дифференциальном — снижается скорость синтеза АТФ (первая производная на графике зависимости количества АТФ от времени) после добавления субстратов и АДФ. При этом присутствие D3 и RD2 вместе с Aβ1-42 практически полностью снимает ингибирование активности митохондрий пептидами Aβ. Это было показано с использованием люциферазы. С помощью малоуглового рассеяния нейтронов (SANS) и рентгеновских квантов (SAXS) были измерены параметры размера липидных везикул (характерный диаметр и толщина липидного бислоя) в зависимости от температуры, чтобы проследить влияние на фазовые переходы липидов в мембранах. Показано влияние Aβ1-42 на параметры, характеризующие толщину липидных мембран (использована мембранная фракция клеток нейробластомы человека содержащая мембранные белки). В рамках Проекта продолжены комплексные структурные, биофизические и биохимические исследования взаимодействий Aβ пептидов с одной из молекулярной мишенью рецептором конечных продуктов гликозилирования RAGE, участвующего в регуляции воспалительных процессов в мозгу человека. В частности, методом конфокальной флуоресцирующей микроскопии нами было показано, что добавление к первичной культуре нейронов и астроцитов гипокампа и коры мозга крыс пептида RAGE 60-76 вызывает возникновение кальциевого сигнала в нейронах, но не в астроцитах. В рамках тематики Проекта были проведены исследования, показывающие незначительные влияние D3-подобных пептидов на активность α-,β-,γ-секретаз (необходимых для разнообразных клеточных молекулярных механизмов) и демонстрирующие терапевтический потенциал тандемной версии димерной формы D3-подобного пептидов RD2 и D3 (RD2-RD2 и RD2-D3), а также синтетических Aβ-S8C димеров, интерферирующие с Aβ пептидами дикого типа в формировании Aβ фибрилл in vivo и in vitro. Была охарактеризована модельная трансгенная линия мышей с мутацией P301L в белке Tau, а также сгенерирована новая модельная линия мышей, в которых производятся амилоидные бляшки, содержащие агрессивный амилоидный пептид pEAβ с модифицированным в пироглутамат остатком Glu3, что наблюдается в амилоидных бляшках человека. Полученные в ходе Проекта знания создают фундаментальную и практическую основу для рационального конструирования лигандов с заданным профилем специфичности и направленной доставки для адекватной терапии болезни Альцгеймера и других заболеваний, связанных с амилоидогенезами в организме человека.

Публикации

1. Армине Аветисян, Самсон Баласанянц, Рубен Симонян, Дмитрий Короев, Анна Камынина, Роман Зиновкин, Наталья Бобкова, Ольга Вольпина Synthetic fragment (60–76) of RAGE improves brain mitochondria function in olfactory bulbectomized mice Neurochemistry International, Volume 140, November 2020, 104799 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.neuint.2020.104799

2. Бочаров Э.В., Гремер Л.Р., Урбан А.С., Охрименко И.С., Волынский П.Е.,..., Горделий В.И., Вильбольд Д. All-D-enantiomeric peptide D3 designed for Alzheimer´s disease treatment dynamically interacts with membrane-bound amyloid-β precursor Journal of Medicinal Chemistry, J. Med. Chem. 2021, 64, 22, 16464–16479 Publication Date:November 5, 2021 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.1c00632

3. ван Герресхайм, Э. Ф., Херринг, А., Гремер, Л., Мюллер-Шиффманн, А., Кейвани, К., и Корт, К. The interaction of insoluble Amyloid-β with soluble Amyloid-β dimers decreases Amyloid-β plaque numbers Neuropathology and Applied Neurobiology, Volume47, Issue5 August 2021 Pages 603-610 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1111/nan.12685

4. Джулия Пост, Аня Шаффрат, Ян Геринг, Соня Хартвиг, Стефан Лер, Н. Йон Шах, Карл-Йозеф Ланген, Дитер Вильбольд, Джанин Куцше и Анть Виллувейт Oral Treatment with RD2RD2 Impedes Development of Motoric Phenotype and Delays Symptom Onset in SOD1G93A Transgenic Mice Int. J. Mol. Sci., Int. J. Mol. Sci. 2021, 22(13), 7066; (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/ijms22137066

5. Джулия Пост, Ванесса Когель, Аня Шаффрат, Филипп Ломанн, Н. Йон Шах, Карл-Йозеф Ланген, Дитер Вильбольд, Антье Виллувейт, Джанин Куцше A Novel Anti-Inflammatory d-Peptide Inhibits Disease Phenotype Progression in an ALS Mouse Model Molecules, Molecules 2021, 26(6), 1590; (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/molecules26061590

6. Камынина А., Эстерас Н., Короев Д. О., Ангелова П. Р., Вольпина О. М., Абрамов А. Ю. Activation of RAGE leads to the release of glutamate from astrocytes and stimulates calcium signal in neurons. Journal of Cellular Physiology, 2021, 236(9), pp. 6496–6506 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1002/jcp.30324

7. Луана Кристина Камарго, Доминик Хонольд, Роберт Бауэр, Н. Йон Шах, Карл-Йозеф Ланген, Дитер Вильбольд, Джанин Куцше, Антье Виллувейт и Сара Шеммерт Sex-Related Motor Deficits in the Tau-P301L Mouse Model Biomedicines, Biomedicines 2021, 9(9), 1160 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/biomedicines9091160

8. Луана Кристина Камарго, Михаэль Шёнек, Ниветини Сангарапиллаи, Доминик Хонольд, Н. Йон Шах, Карл-Йозеф Ланген, Дитер Вильбольд, Джанин Кутче, Сара Шеммерт и Анть Виллувайт PEAβ Triggers Cognitive Decline and Amyloid Burden in a Novel Mouse Model of Alzheimer’s Disease Int. J. Mol. Sci., Int. J. Mol. Sci. 2021, 22(13), 7062 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/ijms22137062

9. Шеммерт, С., Камарго, Л.С., Хонольд, Д., Геринг, И., Куцше, Дж., Виллувайт, А., и Вильбольд, Д. In Vitro and In Vivo Efficacies of the Linear and the Cyclic Version of an All-d-Enantiomeric Peptide Developed for the Treatment of Alzheimer’s Disease Int. J. Mol. Sci., Int. J. Mol. Sci. 2021, 22(12), 6553 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/ijms22126553

10. А. Урбан, Ю.В. Бершатский, К. Павлов, Бочаров Э.В. Structural Study of Membrane Glycoprotein-Precursor of β-Amyloid and Proteins Involved in Its Proteolysis Crystallography Reports, 66, pages 737–750 (2021) (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1134/S1063774521050229

11. Урбан А.С., Павлов К.В., Камынина А.В., Охрименко И.С., Арсеньев А.С., Бочаров Е.В. Structural Studies Providing Insights into Production and Conformational Behavior of Amyloid-β Peptide Associated with Alzheimer’s Disease Development Molecules, Molecules 2021, 26(10), 2897 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/molecules26102897

12. А. Камынина, Н. Эстерас, Д. Короев, П. Ангелова, И. Охрименко, А. Захарчев, Д. Буркатовский, О. Вольпина, А. Абрамов Activation of the membrane receptor RAGE by its fragment 60-76 stimulates calcium signal in neurons FEBS Open Bio, Volume 11 Supplement 1 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1002/2211-5463.13206

13. А. Урбан, К. Надеждин, О. Бочарова, П. Волынский, А. Арсеньев, Р. Ефремов, П. Кузьмичев, И. Охрименко, Д. Корнилов, Н. Денчер, Я. Куцше, Л. Гремер, В. Горделий, Д. Виллболд, Э. Бочаров Structural-dynamic studies of D3-peptide interaction with membrane bound Ab-peptide precursor FEBS Open Bio, Volume 11 Supplement 1 July 2021. page 174 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1002/2211-5463.13205

14. Э. Бочаров, П. Волынский, В. Бритиков, А. Урбан, Ю. Бершацкий, Д. Лесовой, Е. Бритикова, К. Павлов, Р. Ефремов, С. Усанов, А. Арсеньев Functioning mechanisms of bitopic membrane proteins revealed by structural-dynamic studies of intra- and intermolecular interactions of their transmembrane domains FEBS open bio, Volume 11 Supplement 1 July 2021, Talks (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1002/2211-5463.13206

15. Эдуард Бочаров, Иван Охрименко, Лотар Гремер, Жанин Кирхе, Павел Волынский, Анатолий Урбан, Кирилл Надеждин, Ольга Бочарова, Павел Кузьмичев, Даниил Корнилов, Юлия Загрядская, Анна Камынина, ..., Валентин Горделий, Дитер Виллболд NMR-based elucidation of the interaction of the Aβ monomer binding compound D3 to membrane-bound amyloid precursor protein (APP) fragment 2021 Düsseldorf-Jülich Symposium on Neurodegenerative Diseases. Aggregation, Fibrils, Autophagy, Prions and Biomarkers, Abstract booklet. October 04 - 06, 2021 (год публикации - 2021)

16. - Сделан существенный шаг к лечению болезни Альцгеймера сайт РНФ, 26 ноября, 2021 10:57 (год публикации - )

17. - Существенный шаг к лечению болезни Альцгеймера Журнал «За науку» - основное печатное издание Физтеха с конца 50-х годов, Автор Иван Охрименко и Эдуард Бочаров 25.11.2021 (год публикации - )

18. - Сделан важный шаг к лечению болезни Альцгеймера Naked Science, сетевое издание. Свидетельство о регистрации СМИ Эл № ФС77-70708 от 15.08.2017, 25 ноября ФизТех (год публикации - )

19. - Сделан существенный шаг к лечению болезни Альцгеймера Электронное периодическое издание «Научная Россия». Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС77-46778 от 30.09.2011, 25.11.2021 15:30 (год публикации - )

20. - Сделан существенный шаг к лечению болезни Альцгеймера Сетевое издание Научно-информационный портал “Поиск” Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС 77 – 75971, выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор) 13 июня 2019 года., 25.11.2021 (год публикации - )

21. - Сделан существенный шаг к пониманию болезни Альцгеймера http://neuronovosti.ru/, 25 ноября 2021 (год публикации - )

22. - Сделан важный шаг к лечению болезни Альцгеймера Рамблер, 25 ноября (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Болезнь Альцгеймера - самый распространенный в мире вид нейродегенеративного заболевания, которым ежегодно заболевает несколько миллионов человек, причем с возрастом вероятность развития этого вида деменции возрастает многократно. Детальная информация о структуре, динамике и разнообразных межмолекулярных взаимодействий для биомолекул, непосредственно вовлеченных в развитие болезни Альцгеймера, требуются для как для раскрытия фундаментальных механизмов патогенеза нейродегенеративных заболеваний человека, так и для рациональной разработки новых биологически активных соединений и скрининга существующих для получения наиболее эффективных кандидатов в лекарственные средства. Проект направлен на комплексные структурные, биофизические и биохимические исследования механизмов межмолекулярных взаимодействий для амилоидных β-пептидов (Aβ) и их предшественников (мембранных фрагментов белка предшественника β-амилоида, АРР) с разнообразными молекулярными и внутриклеточными мишенями (на примере прионного белка PrP, рецептора конечных продуктов гликозилирования RAGE и митохондрий), а также фармакологическими соединениями (такими как D-энантиомерные D3-подобные пептиды) перспективными для терапии болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний, связанных с амилоидогенезами в организме человека. Для решения задачи на отчетном этапе были использованы такие методы структурной биологии как белковая инженерия, микроскопический термофорез (MST, МСТ), флуоресцентная конфокальная микроскопия, электронная (ЭМ) и атомно-силовая микроскопии (АСМ), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения и компьютерное моделирование. В итоге 2022 года российским коллективом Проекта совместно с ведущими учеными из России профессором И.М. Кузнецовой и профессором К.К. Туроверовым были получены следующие основные научные результаты: На основе разработанных участниками проекта бесклеточных систем экспрессии и очистки для структурно-динамических исследований наработаны в препаративных количествах немеченые и 13C,15N изотопно-меченые препараты фрагментов белков человека PrP, APP и RAGE: i) растворимый фрагмент huPrP (остатки 23-144, huPrP-N), содержащий подвижную N-концевую последовательность с катион-связывающими участками; ii) трансмембранные фрагменты АРР (остатки 672-726, APPmc, Aβ1-55) с примембранным внеклеточным участком дикого типа и с патогенными мутациями (E693G/D694N-APPmc); iii) трансмембранный фрагмент RAGE (остатки 335-368, RAGEtm), содержащий ТМ домен RAGE с примембранным внеклеточным участком, С-концевая часть эктодомена. Мембранные фрагменты рецепторов были встроены в дейтерированные цвиттерионные мицеллы ДФХ. С помощью разработанной экспериментальной «платформы» проведен мониторинг взаимодействия фрагментов рецептора APP (изоформы Aβ) с фрагментами huPrP и RAGE в присутствии терапевтических D3-подобных пептидов. Используя спектроскопию ЯМР, были зарегистрированы взаимодействия растворимых фрагментов huPrP-N с примембранными участками фрагмента APPmc (Aβ1-55) характерные для гибких IDP/IDP-подобных взаимодействий высокозаряженных амфифильных белков вблизи поверхности мембраны. Методом МСТ обнаружена конкуренция D3 пептидов с huPrP-N при взаимодействии с мембраносвязанным APPmc, что подтвердилось PRE-уширением ряда сигналов от аминогрупп APPmc в спектрах ЯМР при добавлении спин-меченого аналога D3. Полученные данные подтверждают предыдущие структурные исследования комплексов APPmc/D3, Aβ/D3, Aβ/RD2 и huPrP/Aβ, проведенные коллективом вместе с ведущими учеными в рамках Проекта. Напротив, взаимодействия мембранносвязанных фрагментов APP с трансмембранным фрагментом RAGEtm и растворимым фрагментом RAGE(60-76) из V-части не были зарегистрированы в мембраноподобном окружении из ДФХ. Исследованы изменения во времени внутриклеточной локализации D-пептидов RD2 и D3, взаимодействующих с Aβ пептидами и их предшественниками. Показано различие влияния D-пептидов RD2 и D3 на внутриклеточную локализацию Aβ пептидов в SH-SY5Y в отсутствии и при наличии дифференцировки клеток ретиноевой кислотой, и при культивировании клеток в стандартных условиях и при пониженном содержании кислорода, что является более физиологически-релевантным. Также была доказана специфичность ингибирования влияния Aβ1-42 на работу комплексов окислительного фосфорилирования митохондрий кандидатом в фармакологические соединения на основе D-пептида с использованием высокочувствительного метода с регистрацией люминисценции. Дополнительно, в рамках тематики Проекта под руководством профессора Д. Вильбота и доктора Л. Гремера (ведущих ученых в 2020 году) продемонстрировано зависимое от дозы и времени элиминирование Aβ-олигомера перспективным терапевтическим соединением RD2 в гомогенатах головного мозга мышей и человека при БА в качестве источников нативных Aβ-олигомеров. Такой анализ взаимодействия с мишенями ex vivo с использованием олигомеров, полученных из мозга мышей и человека, может повысить трансляционную ценность от доклинических исследований, подтверждающих концепцию, до клинических испытаний. Помимо этого, для амилоидных отложений, состоящие из фибриллярных островковых амилоидных полипептидов (IAPP) в островках поджелудочной железы, продемонстрировано, что как человеческий, так и архейный ко-шаперон префолдин (PFD) сходным образом препятствуют удлинению фибрилл IAPP и путям вторичной нуклеации. Используя модель префолдина архей, на основе данных спектроскопии ЯМР, ЭМ и АСМ было установлено, что ингибирование образования фибрилл опосредовано связыванием coiled-coil спиралей префолдина с гибким N-концевым сегментом IAPP, доступным на поверхности фибрилл и концах фибрилл. Связь структурных моделей с наблюдаемыми процессами ингибирования фибрилляции открывает перспективы для понимания взаимодействия между естественными шаперонами и образованием амилоидов, ассоциированных с заболеванием. На основе результатов, полученных на всех этапах выполнения Проекта, были предложены молекулярные модели, детально описывающие специфические взаимодействия фрагментов рецептора APP различной длины (изоформы Aβ, в том числе имеющие в составе семейные мутации AD) с различными молекулярными мишенями, на примере функциональных фрагментов прионного белка huPrP, рецептора RAGE и митохондрий. Установлены молекулярные механизмы терапевтической активности D3-подобных пептидов, влияющие на молекулярные процессы, приводящие к накоплению альтернативных изоформ Aβ, их патогенную олигомеризацию и связыванию с различными молекулярными мишенями. Для создания новых эффективных фармакологических соединений выявлены структурно-функциональные детерминанты АРР, на которые можно селективно воздействовать для предотвращения токсичной олигомеризации Aβ, взаимодействия Aβ с молекулярными мишенями и аномального протеолиза рецептора АРР секретазами. Все значимые результаты Проекта были оформлены в публикации в высокорейтинговых научных изданиях, доложены на научных конференциях и освещены в научно-популярной прессе.

Публикации

1. Касс Б., Шеммерт С., Зафиу К., Пилс М., Баннах О., Куцше Дж., ... Вильбольд Д. Aβ oligomer concentration in mouse and human brain and its drug-induced reduction ex vivo Cell Reports Medicine, Volume 3, Issue 5, 17 May 2022, 100630 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2022.100630

2. Кёниг Анна С., Надин С. Рёзенер, Лотар Гремер, Даниэль Флендер, Вольфганг Хойер, Филипп Нойдекер, Дитер Вильбольд и Хенрике Хайзе Structural details of amyloid β oligomers in complex with human prion protein as revealed by solid-state MAS NMR spectroscopy J. Biol. Chem., Volume 296, 100499, January 2021 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.jbc.2021.100499

3. Р. Тернер, Татьяна Купрейчик, Лотар Гремер, Элиза Колас Деблед, Дафна Фенель, Сара Шеммерт, Пьер Ганс, Дитер Вильбольд, Гай Шон, Вольфганг Хойер и Жером Буавье Structural basis for the inhibition of IAPP fibril formation by the co-chaperonin prefoldin Nature communications, 13, 2363 (2022) (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1038/s41467-022-30042-y

4. Кузьмичев П. К., Охрименко И. С., Волынский П. Е., Лесовой Д. М., Корнилов Д. А., Загрядская Ю. А., Камынина А. В., Арсеньев А. С., Ефремов Р. Г., Бочаров Э. В. D-энантиомерный пептид, разработанный для терапии болезни Альцгеймера, динамически взаимодействует с амилоидогенным участком мембраносвязанного предшественником β-амилоида. IX Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков. Cб. тез. / АНО «Иннов. центр Кольцово». — Новосибирск. ИПЦ НГУ, 2022. — 764 с. ISBN 978-5-4437-1362-5. Стр. 561, Cб. тез. / АНО «Иннов. центр Кольцово». — Новосибирск. ИПЦ НГУ, 2022. — 764 с. ISBN 978-5-4437-1362-5. Стр. 561 (год публикации - 2022)

5. Охрименко И., Волынский П., Загрядская Ю., Камынина А., Кузьмичев П., Арсеньев А., ... и Бочаров Э. All-D-enantiomeric peptide designed for Alzheimer´s disease treatment dynamically interacts with amyloidogenic region of membrane-bound amyloid-β peptide precursor Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology (BGRS/SB-2022), 13-я Международная мультиконференция «Биоинформатика Геномной Регуляции и Структурной/Системной Биологии» – BGRS/SB-2022. 4 - 8 июля 2022 г., Новосибирск, Россия. Международная конференция , стр. 311 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.18699/SBB-2022-175

6. Охрименко И., Волынский П., Загрядская Ю., Камынина А., Кузьмичев П., Арсеньев А., Ефремов Р., Бочаров Э. Динамическое взаимодействие d-энантиомерного пептида, разработанного для терапии болезни Альцгеймера, с мембраносвязанным предшественником β-амилоида. X РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ «БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ» (Сочи, Дагомыс, 3–8 октября 2022) НАУЧНЫЕ ТРУДЫ. Том 3. – М.: Издательство «Перо», 2022. – с.129, Том 3. М.: Издательство «Перо», 2022. с.7 (год публикации - 2022)

7. Плащинская Д.Д., Бершацкий Я.В., Ракитина Т.В., Охрименко И.С., Арсеньев А.С., Бочаров Э.В.. Получение и очистка трансмембранного домена рецептора RAGE для структурных ямр-исследований. СБОРНИК ТЕЗИСОВ XXXIV МЕЖДУНАРОДНОЙ ЗИМНЕЙ МОЛОДЁЖНОЙ НАУЧНОЙ ШКОЛЫ, XXXIV МЕЖДУНАРОДНАЯ ЗИМНЯЯ МОЛОДЁЖНАЯ НАУЧНАЯ ШКОЛА "ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ" Москва, 8-11 февраля 2022 г. СБОРНИК ТЕЗИСОВ. стр. 32 (год публикации - 2022)

8. Э.В. Бочаров, Я.В. Бершацкий, А.C. Урбан, Д.М. Лесовой, О.В. Бочарова, К.В. Павлов, Н.В. Кузьмина, А.А. Можаев, И.С. Охрименко, А.С. Кузнецов, П.Е. Волынский, В.В. Бритиков, Е.В. Бритикова, С.А. Усанов, Р.Г. Ефремов, А.С. Арсеньев Конформационные перестройки и взаимодействия трансмембранных доменов битопных белков в норме и патологии. X РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ «БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ» (Сочи, Дагомыс, 3–8 октября 2022) НАУЧНЫЕ ТРУДЫ. Том 2. – М.: Издательство «Перо», 2022., III ОБЪЕДИНЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ ФИЗИОЛОГОВ, БИОХИМИКОВ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГОВ, X РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ «БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ». НАУЧНЫЕ ТРУДЫ. том 2, стр. 102 (год публикации - 2022)

9. - Выпуск #28 "Победить болезнь Альцгеймера и запуск нового российского автомобиля" Телепередача Наука. Наталья Попова., Телеканал Наука. Выпуск #28, 1:34 - 4:50 (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
В результате работ по проекту была сформирован научно-технологический задел, а именно членами коллектива был получен непосредственный опыт разработки препаратов нового класса на основе D-пептидов. Коллектив авторов был непосредственно вовлечён в передовые разработки, и, кроме того, предложил новую молекулярную мишень для перспективных фармакологических соединений - предшественник пептида бета-амилоида, трансмембранный фрагмент рецептора APP до его гидролиза гамма-секретазой. Таким образом, D-пептиды могут быть оптимизированы имея критерием эффективности взаимодействие не со «зрелым» пептидом бета-амилоида, но с его предшественником. С использованием этого критерия могут быть созданы препараты и не на основе D-пептидов, воздействующие на данную молекулярную мишень. Следовательно может быть создана новая продукция направленная на раннюю диагностику и лечение социально-значимого нейродегенеративного заболевания Альцгеймера. Данный подход может быть расширен и на другие заболевания в патогенез которых вовлечены 1TM рецепторы гидролизуемые гамма-секретазой. Нами была впервые получена экспериментально-установленная структура прототипа перспективного лекарственного средства (D-пептида) в комплексе с его мишенью, и, что примечательно, этот комплекс оказался динамически изменяющимся во времени. То есть эффективный и специфичный терапевтический агент вполне может быть IDP, а его взаимодействие с мишенью IDP-IDP взаимодействием. Что является новым установленым научным фактом имеющим непосредственное прикладное значение. Только детальное понимание структурной динамики IDP белков и их рецепторов способствует рациональному определению молекулярных мишеней при разработке перспективных лекарственных средств. Важно отметить, что институт Ведущих Учёных проекта позволил начать интенсивную совместную работу с несколькими учёными занимающимися исследованием IDP-белков и амилоидогенеза, установление рабочих связей между разработчиками работающими по смежным темам можно отнести к заделам для будущего развития. Современные высокотехнологичные методы позволяющие создавать новые эффективные и высокоспецифичные препараты требуют развития инфраструктуры, образования, приборостроения и вовлечения специалистов разного профиля. Разработка и внедрение новых препаратов обеспечивает экономический рост и социальное развитие не сколько за счёт продаж и создания рынка нового медицинского метода терапии, сколько посредством вовлечения в исследования, в разработку, во внедрение и в производство значительного числа высококвалифицированных специалистов, получения ими опыта и установления рабочих связей, которые формируют отрасль и будут использованы в будущем для реализации других инновационных проектов, создания новой и усовершенствования имеющейся продукции и применяемых технологий. Всё это является научным и технологическим заделом высокого порядка, обеспечивающим экономический рост и социальное развитие госудаства.