Аннотация результатов, полученных в 2020 году
По завершению первого года исследований участниками проекта из ПетрГУ получены первые данные о концентрации D-лактата в крови форели, выращиваемой в открытых водоемах. Проведен скрининг микроорганизмов, которых можно использовать для постановки модельного эксперимента, в контролируемых лабораторных условиях имитирующего развитие у форели инфекционного процесса. Выделен потенциально вирулентный для форели штамм E. coli и протестирована его способность вызывать воспаление и инфекционный процесс у форели in vivo. Закончены пуско-наладочные работы оборудования для содержания форели в лабораторных условиях и оборудования для ПЦР-анализа. Получены первые результаты анализа собранного материала молекулярно-генетическими методами. Продолжено накопление данных о вариабельности физиологических, биохимических и молекулярных параметров внутренней среды рыб с признаками инфекционных заболеваний из форелевых хозяйств Северо-Запада России. На первом году исследования был собран материал для микробиологического, биохимического и молекулярно-генетического анализа состояния рыб и их микробиоты с двух хозяйств на Ладожском озере и на Белом море. Для этих данных была проанализирована взаимосвязь маркеров физиологического состояния рыб и проявлениями бактериальной инфекции. На базе ИГУ участниками междисциплинарного проекта сконструированы, получены и частично протестированы векторные последовательности, необходимые для молекулярно-генетических манипуляций с микроорганизмами для целей проекта. Получен генно-модифицированный штамм E. coli, продуцирующий фермент D-лактатоксидазу, большая часть которого экспрессируется в нерастворимой форме. Произведена оценка некоторых видов полимерных пленок для иммобилизации на них ферментов метаболизирующих D-лактат как основы для тест-полосок. На основе патентного поиска отобраны наиболее перспективные подходы для создания тест-полосок на D-лактат. Отработаны методики иммобилизации флуоресцентных индикаторных красителей, необходимых для создания имплантируемых сенсоров на D-лактат. Частично отработаны методы полимеризации живых дрожжей в полиакриламидном геле, проведены работы по оценке иммуногенности полиакриламидных гелей как носителей имплантируемых микросенсоров. Начаты работы по внедрению генетической системы, чувствительной к D-лактату в дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Полученные данные позволяют перейти к основной части работы по созданию сенсоров на D-лактат, включая имплантируемые прижизненные сенсоры.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В 2021 году коллективом междисциплинарного проекта из ИГУ была продолжена работа по поиску подходов и технических решений для измерения D-лактата в формате тест-полосок, in vitro и с помощью имплантируемых микросенсоров. Был проведен скрининг колориметрических реакций для определения лактата в диапазоне концентраций, соответствующих физиологическим концентрациям D-лактата. На основе колориметрической реакции с гваяколом был предложен дизайн тест-полосок для определения D-лактата. Для осуществления этой реакции с помощью генетически модифицированного штамма Е. coli были получены разные варианты рекомбинантного фермента D-лактатоксидазы из дрожжей. Оценка способности фермента метаболизировать D-лактат показала, что данный белок обладает лактатдегидрогеназной, но не лактатоксидазной активностью. Был подобран дизайн сенсора на основе Ru(ddp) и силиконового носителя, чувствителеного к содержанию растворенного кислорода, а также позволяющего учитывать фоторазложение красителя при многократных измерениях. Принципиальная работоспособность предложенного кислородного сенсора в комбинации с D-лактатоксидазой для измерения D-лактата была подтверждена в системе глюкоза-глюкозооксидаза. Были продолжены работы по созданию живых биосенсоров для детекции D-лактата на основе генетически модифицированных дрожжей. Для этого был осуществлен перенос генетической системы, чувствительной к D-лактату из Pseudomonas fluorescens в дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Была проведена отработка иммобилизации дрожжей в гидрогелях на основе альгината, полигидроксиэтилметакрилата и полиакриламида. Показано, что 10-15% полиакриламидные гели являются перспективной основой для создания бионеразлагаемых имплантируемых дрожжевых биосенсоров. Показано, что жировой плавник форели является оптимальным местом для имплантации флуоресцентных микросенсоров. Данный орган до 4х раз лучше пропускает свет в диапазоне 440-1000 нм, чем кожа на других участках тела рыб, имеет достаточный объем для введения микросенсора, достаточно компактен для быстрой визуализацию датчика и является перспективным местом для оценки внутренних физиологических процессов лососевых. Была продолжена работа по оценке иммуногенности вводимых микросенсоров. В тканях рыб описан механизм экскреции микрочастиц из организма через слущивающийся эпителий кишечника и кожи. Иммуногенность флуоресцентных микрокапсул удалось значительно снизить путем их покрытия 2.5% полиакриламидным гелем. В итоге, в эксперименте in vivo были продемонстрированы преимущества 2.5% ПААГ как носителя для микросенсоров такие как: легкое введение, непроницаемость для иммунных клеток, низкая цитотоксичность, уменьшение реакции иммунного ответа на чужеродное тело, стабильность в физиологических условиях в течение нескольких недель, ткане-подобная структура, способность интегрироваться в ткани без фиброзной инкапсуляции. Коллективом междисциплинарного проекта из ПетрГУ были продолжены работы по изучению уровня D-лактата во внутренних средах форели, проницаемости кишечника рыб, а также состава кишечной микрофлоры под воздействием различных факторов в естественных и искусственных условиях. Для оценки влияния состава микробиоты кишечника на содержание D-лактата во внутренних средах был поставлен аквариальный эксперимент, в котором молодь форели кормили кормами с разным соотношением белка и углеводов. Показано повышение проницаемости кишечника при питании форели кормами с повышенным содержанием белка. Также показано, что основная продукция D-лактата приходится на микрофлору заднего отдела кишечника рыб. В рамках проекта были продолжены работы по изучению состава микробиома и биохимических и физиологических характеристик больных особей форели на форелевых хозяйствах Северо-Запада России. У форели, в разной степени пораженной инфекционным заболеванием, вызванным опасным патогеном Vibrio anguillarum, был произведен поиск потенциальных маркеров продромальной стадии бактериальной инфекции и общего состояния иммунитета рыб. Сделан вывод о возможном участии внеклеточных гистонов, антипротеаз и активаторов каскада свертывания крови в элиминации патогена на ранних стадиях заболевания у устойчивых к вибриозу рыб. Также выявлены белки, предположительно связанные с прогрессированием болезни. Не удалось выявить изменения в проницаемости кишечника рыб больных вибриозом по мере развития заболевания, однако была обнаружена тенденция к повышению экспрессии в кишечнике белка межклеточных контактов клаудина по мере увеличения тяжести инфекции. Для поиска новых маркеров, которые, наряду с D-лактатом, могут быть применены для оценки иммунологического статуса форели и прогноза течения бактериальной инфекции, был начат поиск и описание в крови здоровых рыб молекул, взаимодействующих с бактериями. Для этого был изучен эффект плазмы форели в ее нативном состоянии на рост и выживаемость патогенной бактерии Aeromonas hydrophila. С помощью различных микробиологических методов были изучены антимикробные свойства высокомолекулярной белковой фракция плазмы форели (>10 кДа). В результате был отобран материал для анализа состава белков плазмы форели, взаимодействующих с патогеном.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В 2022 году коллективом междисциплинарного проекта из ИГУ была продолжена работа по поиску подходов и технических решений для измерения D-лактата в сложных биологических смесях в формате тест-полосок, in vitro и in vivo. Был проведен скрининг белковых последовательностей, способных специфично распознавать изомер D-лактата. Для создания ферментативной тест-системы распознавания D-лактата в плазме рыб, были генетически модифицированы штаммы Е. coli и получен рекомбинантный белок GO-LOX из Gluconobacter oxydans. Полученный белок в присутствии D-лактата был способен восстанавливать 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид, однако не обладал оксидазной активностью. Таким образом, было показано, что описанные ранее ферменты семейства Dld3 не подходят для создания колориметрических тестов на D-лактат. Помимо этого было успешно осуществлено клонирование в E. coli другой белковой последовательности, потенциально распознающей D-лактат, - транскрипционного фактора Dlld-R из Pseudomonas fluorescens. Методом задержки (ретардации) в геле была проверена способность D-лактата специфически влиять на связывание Dlld-R с известной последовательностью промотора системы Pseudomonas fluorescens, чувствительной к D-лактату. В рамках проекта РНФ в ИГУ в 2022 г. были продолжены работы по созданию живых биосенсоров для детекции D-лактата на основе генетически модифицированных микроорганизмов. Для этого был успешно осуществлен перенос генетической системы, чувствительной к D-лактату, из P. fluorescens в E. coli и Pseudomonas putida. Полученные ГМО синтезировали флуоресцентный белок в присутствии D-лактата в концентрации от 12 мМ. Полученные штаммы были иммобилизованы в альгинате натрия для создания прототипа тест-полоски для измерения D-лактата. Коллективом проекта РНФ из ИГУ была протестирована стабильность и функциональность полиакриламидных гидрогелей высокой и низкой плотности в качестве основы для внедрения микросенсоров на основе ГМО чувствительных к D-лактату in vivo. Микросенсор на основе 13% полиакриламидного геля, чувствительный к рН среды, показал свою работоспособность в течение 9 дней в тканях живой форели. Для многократной регистрации оптического сигнала из живых рыб был подготовлен и апробирован прототип лабораторного ручного устройства, которое позволило снимать сигнал из культивируемой форели товарного размера без анестезии. Участниками междисциплинарного проекта со стороны ПетрГУ были продолжены работы по изучению уровня D-лактата во внутренних средах форели, проницаемости кишечника у рыб, а также состава кишечной микрофлоры форели под воздействием различных факторов в естественных и искусственных условиях. Для оценки влияния системного воспаления на проницаемость кишечника и содержание D-лактата во внутренних средах рыб, был проведен эксперимент, в котором форели вводили дозу инактивированных патогенных бактерий Aeromonas hydrophila. Был сделан вывод, что проницаемость кишечника незначительно влияет на уровень D-лактата в крови форели. В рамках задач проекта РНФ в ПетрГУ был продолжен сбор базы данных о биохимических и физиологических адаптациях форели при возникновении вспышек инфекционных заболеваний на форелевых хозяйствах. В частности, было показано, что хроническое инфекционное заболевание рыб в условиях форелевых хозяйств, вызванное бактерией Flavobacterium psychrophilum, не оказывает влияние на уровень D-лактата в крови рыб, тогда как грибковая инфекция вызывала существенное повышение уровня данного метаболита. Для поиска новых маркеров, которые, наряду с D-лактатом, могут быть применены для оценки иммунологического статуса форели и прогноза течения бактериальной инфекции, был продолжен поиск и описание белков в крови рыб, способных распознавать бактериальный антиген. Для этого методом масс-спектрометрии был проанализирован состав белков из плазмы форели, способных связываться с бактериальной стенкой A. hydrophila. В эксперименте бактерий инкубировали в плазме здоровых и иммунизированных рыб из двух популяций форели из хозяйств на р. Ангара и Онежском озере. В плазме иммунизированных рыб, обладающей бактериостатическим действием на A. hydrophila, помимо ожидаемого присутствия иммуноглобулинов были обнаружены изоформа актин-подобного белка с неизвестной функцией, неизвестный белок из семейства лектинов, липокалин и изоформа аполипопротеина B-100, которые эффективно связывались с бактериальной стенкой. Таким образом, впервые был исследован нативный комплекс, атакующий патоген в плазме иммунизированной форели и выявлена группа белков, предположительно обладающих непосредственным бактериостатическим действием. Соответственно, описанные белки можно рассматривать как маркеры резистентности форели к инфекционным заболеваниям бактериальной природы.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Глобальной целью междисциплинарного проекта являлось изучение возможностей для использования D-лактата в качестве маркера различных патологий у рыб в аквакультуре. Задачей Петрозаводского государственного университета в рамках междисциплинарного проекта, при этом, являлось изучение зависимости между уровнем D-лактата в крови и развитием разнообразных патологических процессов у радужной форели, вызванных изменением состава микробиоты. В свою очередь, задачей Иркутского государственного университета являлась разработка методов и подходов для быстрого определения содержания D-лактата в биологических средах в условиях рыбоводных ферм, в том числе с использованием химических и микробиологических методов in vitro и in vivo. В 2023 участниками проекта из ПетрГУ году был закончен сбор базы данных о биохимических и физиологических адаптациях форели при возникновении вспышек инфекционных заболеваний на форелевых хозяйствах. В частности, показано, что рыбы с нарушением роста и раннего развития больше подвержены различным кожным инфекциям. При этом обнаружено, что вялотекущие кожные инфекции не оказывают влияния ни на показатели реактивности системного иммунитета, ни на уровень D-лактата в крови и кишечнике форели. В текущем году коллективом проекта из ПетрГУ был завершен анализ данных, полученных в полевых и аквариальных экспериментах, о влиянии воспалительных процессов на проницаемость кишечного барьера у радужной форели. Был сделан вывод и том, что поступление экзогенных соединений из кишечника может зависеть от степени локального воспаления в заднем отделе кишечника, тогда как системное воспаление на уровне организма не влияет на барьерные функции кишечника, в том числе на поступление D-лактата в кровь рыб. Участники проекта из ИГУ закончили работы по генетической модификации микроорганизмов с целью получения рекомбинантных белков, имеющих химическое сродство к D-лактату, или получения штаммов микроорганизмов, чувствительных к присутствию D-лактата в среде. Охарактеризована химическая активность рекомбинантного белка SC-LOX (Dld3) из дрожжей S. cerevisiae, показано что фермент является функциональной D/L-лактатдегидрогеназой и не подходит для создания стерео-специфического сенсора на D-лактат. Также в рамках проекта изготовили и протестировали in vitro ряд модельных химических сенсоров на лактат на основе лактатоксидаз, распознающих L-, но не D-лактат, которые могут быть имплантированы непосредственно в ткани организма и не требуют забора биологических образцов для анализа. Закончена характеристика транскриптомного ответа дрожжей на изменение концентрации D-лактата в среде с целью потенциальных молекулярных систем для создания стерео-специфических генетических конструкций. Показано, что регуляция ответа дрожжей на высокие концентрации лактата и на высокую кислотность среды осуществляется перекрывающимися наборами генов. Методами микроскопии и гистологии оценили стабильность и функциональность имплантируемых гидрогелей разного состава как основы для внедрения микросенсоров, чувствительных к D-лактату in vivo и на тест-полосках. В экспериментах in vivo на молоди форели показана принципиальная возможность регистрировать флуоресценцию от живых генетически модифицированных дрожжей иммобилизованных в 13% полиакриламидном геле и имплантированных подкожно в жировой плавник форели.