Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проведен ретроспективный анализ микробиологических посевов биоматериала от пациентов с поражением слизистой ротовой полости. Определены следующие две основные группы согласно классификации возрастов, принятой Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ): пациенты молодого возраста 18 - 44 лет и пациенты среднего возраста 45-59 лет. Дополнительно каждая основная группа разделена на две подгруппы: 1) с поражением слизистой поверхности ротовой полости, в острой и 2) хронической формами. Удельный вес бактериальной микрофлоры для группы пациентов молодого возраста составлял более половины от числа выделенных культур микроорганизмов. У пациентов с хроническими формами, подавляющее большинство было представлено грамположительными кокками (85 %), 28,5 % являлись представителями рода Staphylococcus и 71,4 % Streptococcus spp. Стафилококки были представлены 2 видами, среди которых превалировали Staphylococcus aureus (26,9 % - от числа грамположительных кокков и 22,9 % от общего количества бактериальных изолятов). Среди Streptococcus spp наиболее часто у пациентов с хроническими формами выделялись гемолитические виды 49,2%, в количествах от 102 до 103 КОЕ/тамп. Кроме того, в микробном пейзаже часто встречались и грамотрицательные бактерии (16,2% от общего количества бактериальных изолятов). Среди них преобладали Klebsiella spp. (58,3% от числа грамотрицательных), причем в четырех случаях в этиологических значимых количествах 103-105 КОЕ/тамп. Находки E. coli были редкими, выделены единичные культуры, всего 27,3% от числа грамотрицательных кокков и 1,3% - от общего числа, в количестве менее 101-102 КОЕ/тамп. У хронических пациентов во всех образцах со слизистых присутствовала грибковая микрофлора, где основным представителем являлся дрожжевой грибок Candida albicans (86,8% от количества грибковых изолятов). Высевались также C. parapsilosis, C. tropicalis. В 62% случаях количество выделяемых грибов составило <102 КОЕ/тамп. У пациентов первой группы, обратившихся в острый период удельный вес бактериальной микрофлоры, составлял также более половины от числа выделенных культур микроорганизмов. Однако, в микробном пейзаже полностью отсутствовали грамотрицательные бактерии, а подавляющее большинство грамположительных кокков было представлено Streptococcus spp. Кроме того, грибковая микрофлора, была представлена 3 видами (C. albicans, C. tropicalis, C. krusei) и составила 27,6% от общего числа всех изолятов. У пациентов с хроническими и острыми формами, в целом не выявлены различия в составе встречаемости изолятов. Ведущими грамположительными видами были Streptococcus spp., среди грамотрицательных - Klebsiella spp. и частым представителем грибковой флоры - C. albicans. Проведено моделирование смешанной биопленки in vitro. Получены стабильные двувидовые биопленки S. aureus – E. coli, S. aureus – K. pneumonia, S. aureus и P. aeruginosa. Получены модели смешанных грибково-бактериальных биопленок C. albicans с S. aureus, E. coli, K. pneumonia и P. aeruginosa. Показаны различия состава моно- и двувидовых биопленок. Так, в матриксе биопленок S. aureus и E. coli преобладают белки, а в случае же смешанной биопленки возрастают α-полисахариды. В биопленке S. aureus – K. pneumonia увеличивается содержание β-полисахаридов почти в 2 раза по сравнению с моновой биопленкой K. pneumonia. В составе матрикса биопленки P. aeruginosa преобладают α-полисахариды, тогда как в смешанном сообществе S. aureus – P. aeruginosa повышается количество β-полисахаридов. В матриксе смешанных грибково-бактериальных биопленках С.albicans-S.aureus и С.albicans –E.coli преобладают как α и β –полисахариды, так и белки примерно в равном количестве. Однако, в биопленках С.albicans – K.pneumonia содержание белков преобладает над содержанием α-полисахаридов, а в биопленках С.albicans – P.aeruginosa, наоборот. Было исследовано действие различных антибиотиков на моно- и полимикробные биопленки S.aureus и P. aeruginosa. Анализ распределения S. aureus и P. aeruginosa в толще биопленки после 24-часовой обработки ванкомицином показал, что, в отличие от контроля, где S. aureus в основном находился в верхних слоях биопленки, в условиях терапии ванкомицином большинство клеток перемещались в нижний и средний слои биопленки. С помощью конфокальной микроскопии также было установлено значительное перераспределение S. aureus из верхнего к нижним слоям биопленки в присутствии антимикробных препаратов. Полученные данные свидетельствуют о том, что в условиях антимикробной терапии золотистый стафилококк изменяет свою локализацию в структуре полимикробной биопленки, погружаясь в нижние слои, и при этом становится нечувствительным к большинству противомикробных препаратов узкого спектра действия, используя фенотипическую устойчивость P. aeruginosa к этим антимикробным препаратам. Интересно, что в случае полимикробных биопленок, для достижения аналогичного снижения жизнеспособных клеток P. aeruginosa концентрация ципрофлоксацина снижалась почти в 10 раз. Кроме того, при обработке смешанной биопленки ципрофлоксацином в концентрации 8×МБК наблюдалась полная гибель как P. aeruginosa, так и S. aureus, чего не было отмечено в случае монокультур. Аналогичные результаты были получены при использовании аминогликозидов (амикацин и гентамицин). В полимикробной биопленке при концентрации 1-2×МБК наблюдалась полная гибель клеток как S. aureus, так и P. aeruginosa, тогда как в мономикробных биопленках даже в концентрации 8×МБК происходило снижение КОЕ лишь на 2-3 порядка. При этом S. aureus доминировал в верхних слоях биопленки, тогда как клетки P. aeruginosa находились в нижних слоях и практически все идентифицировались как нежизнеспособные. Следовательно, золотистый стафилококк не способен предотвратить проникновение антибиотика к клеткам P. aeruginosa. Подобные результаты были получены для димикробных бипленок S. aureus и K. pneumoniae, S. aureus и E. сoli. Таким образом, в случае смешанных биопленок требуется использование антибиотиков широкого спектра действия. В этом случае их эффективность в 2-4 раза выше по сравнению с монокультурами бактерий, вероятно, за счет антагонистических взаимодействий S. aureus с грамотрицательными бактериями в полимикробной биопленке. Использование антибиотиков, эффективных только в отношении S. aureus, приводит к перемещению бактерии в нижние слои смешанной биопленки и повышению устойчивости стафилококка к терапии за счет протекции со стороны матрикса биопленки грамотрицательных бактерий. Рассмотренный эффект может быть связан с тем, что S. aureus способен синтезировать метаболиты, которые негативно влияют на клетки P. aeruginosa и тем самым повышают их чувствительность к антибиотикам. Действительно, при добавлении антибиотиков с культуральной жидкостью S. aureus наблюдалась гибель открепившихся клеток и клеток в составе биопленки P. aeruginosa и K. pneumonia уже при концентрации антибиотиков 0.03×МБК, тогда как внесение аминогликозидов в питательную среду не влияло на жизнеспособность P. aeruginosa в биопленке и в открепившемся состоянии даже при концентрации антибиотиков равной их 8×МБК. С целью определения наиболее перспективного для дальнейшей модификации соединения был протестирован широкий ряд терпенов и терпеноидов. Структуры всех новых соединений были подтверждены с использованием спектроскопии ЯМР (1D и 2D) и масс-спектрометрии высокого разрешения. Наиболее перспективными соединениями с точки зрения их антимикотических свойств оказались структуры миртенол (соединение 15) и 2-(((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гептан-2-ил)тио)этан-1-ол (соединение 17). Следует отметить, что соединение 15 было протестировано в виде отдельных энантиомеров, и в биологической части имеет шифр «S-15+» и «S-15-». Соединению 17 был присвоен шифр KS-1. Были синтезированы соли 20 (соль миртеновой кислоты) и 21 (соль миртановой кислоты). Структуры соединений 17А и 17Б были детально изучены при помощи различных методов ЯМР спектроскопии, для соединения 17Б удалось сделать РСА . С целью изучения биологических свойств продуктов окисления терпенсульфида 17 были получены его соответствующие сульфоксиды 23а,b и сульфон 24. Структура полученных соединений была доказана с использованием методов ЯМР, масс-спектрометрии и РСА. Терпен 15 показал одну из наилучших активностей по отношению к микроорганизмам, поэтому было полученое его fusion-соединение с BODIPY-флуорофором. Следующим этапом работы стало получение гибридной структуры 27, которая представляет из себя бета-гидроксисульфид с терпеновым фрагментом от соединения 15 и гудроксисульфидным фрагментом от соединения 17. Для лучшего понимания зависимости активности соединений от их структуры, были так же получены вещества 26 и 28, отличающиеся от сульфида 27 лишь одним атомом в бета-положении к гидроксильной функции. Таким образом, один и тот же терпеновый кор удалось модифицировать этиленгликолем, меркаптоэтанолом и моноэтаноламином. По аналогии с предыдущими соединениями 15 и 17, структура 27 была модифицирована флуоресцентной меткой на основе флуорофора Б. Проведена оценка антимикробной активности терпенов S15 и S15+, а также миртеновой кислоты и ее четвертичной соли. Среди протестированных соединений, наиболее активным было соединение S15, минимальная подавляющая концентрация которого в отношении планктонных клеток S. aureus составила 512 мкг/мл, тогда как для других соединений МПК был равен 2048 мкг/мл, тогда как в отношении грамотрицательных бактерий исследованные соединения были неактивны и их минимальные подавляющие концентрации были выше предела обнаружния. Показан синергизм S15 и S15+ с антибиотиками. При комбинировании S15 и S15+ значения иФИК были равны 0.31 и 0.50 соответственно, что подтверждает синергетический эффект антимикробных препаратов. В комбинации с другим антибиотиком аминогликозидного ряда, гентамицином, значения иФИК составляли 0.75 and 0.625 соответственно, в то время как сочетанное использование производных терпена с ванкомицином проявляло аддитивный эффект и значения индекса варьировали в диапазоне 1.125-1.5. В отличие от бактерий, рост грибов C.albicans подавлялся всеми исследованными соединениями в относительно низких концентрациях. Клетки Fusarium оказались более устойчивы к соединениям. Индекс фракционной ингибирующей концентрации (иФИК) соединения (S15) в комбинации с флуконазолом составлял 0.3744-0.4992, что свидетельствовало о наличии синергизма в отношении клеток кандиды. Аддитивный эффект был показан в отношении фузариума для сочетанного применения S15 с флуконазолом. При фиксированной концентрации терпенов (128 мкг/мл) МПК бензалкония хлорида биоцида снижается в 2-8 раз в отношении смешанной культуры стафилококка и кандиды. С помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и S15-lum2 показано, что соединение S15 равномерно распределяется внутри клеток S. aureus, тогда как в случае грамотрицательных E. coli и P. aeruginosa флуоресценция идентифицируется лишь на поверхности клеток. Вероятно, соединение не способно проникнуть внутрь клеток, в связи со сложным строением мембраны, чем и объясняется низкая антимикробная активность исследуемых соединений в отношении грамотрицательных бактерий. При внесении S15-lum к клеткам S. aureus время для полумаксимального проникновения вещества внутрь клетки t1/2 составило 12±1.3 мин, тогда как для проникновения S15-lum в клетки P. aeruginosa требуется 60±1.6 мин. Таким образом, низкая эффективность исследуемых производных терпенов против клеток грамотрицательных бактерий объясняется низкой скоростью проникновения соединений внутрь клеток. Также с помощью конфокальной микроскопии исследовали проникновение S15, несущего BODIPY-флюорофор (S15-lum), в клетки дрожжевых и мицеллиальных грибов. Микроскопия показала также высокую скорость проникновения соединения в клетки грибов с последующим накоплением в органоидах клетки. Путем оценки мебранного потенциала клеток показано, что механизм действия S15 и S15+, как и для четвертичных аммонийных солей, заключается в повреждении мембраны.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Анализ микробиома слизистой ротовой полости в норме (группа «условно здоровых лиц») и при патологии (пациенты с диагнозом бронхиальная астма) что в норме подавляющее большинство бактерий представлено грамположительными кокками (96 %), 51,0 % являлись представителями рода Staphylococcus (S. aureus и S. epidermidis) и 49,0 % Streptococcus spp. с единичными случаями встречаемости грамотрицательных бакетрий. В 45% образцов присутствовала грибковая микрофлора, где основным представителем являлся дрожжевой грибок Candida albicans (81,8% от количества грибковых изолятов), но только в 18,2% случаях количество выделяемых грибов составило >103 КОЕ/тамп. У пациентов с диагнозом «бронхиальная астма» ведущими грамположительными видами были Streptococcus spp., среди грамотрицательных - Klebsiella spp. и частым представителем грибковой флоры - C. albicans. В 81% случаях условно-патогенные микроорганизмы высевались в микробиологических посевах в этиологически значимых количествах >104 – 105 КОЕ/тамп. При этом содержание C. albicans и C. tropicalis значимо коррелировало с повышением содержания лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и нейтрофилов. Проанализирован эффект внеклеточной культуральной жидкости различных штаммов золотистого стафилококка в отношении E. coli в составе зрелых биопленок. Внесение жидкости в концентрации 12.5% приводила к снижению дыхательной активности клеток E. coli, погруженных в биопленку, на 55%. Сочетание амикацина и ципрофлоксацина с культуральной жидкостью стафилококка усиливало действие антибиотиков в 4-8 раз. Проведен подбор оптимальных условий для максимального выхода антимикробных метаболитов из культуральной жидкости стафилококка. Оптимизированная схема получения фракции антимикробных пептидов из культуральной жидкости золотистого стафилококка включает снижение рН до 3.0, удаление клеток центрифугированием, ультрафильтрацию с MWCO 10 кДа, твердофазную экстракцию со ступенчатой элюцией раствором ацетонитрила с сохранением фракции элюции 20-40% ацетонитрила с последующей очисткой на ВЭЖХ на колонке С-18. Исследована способность микроскопических грибов Candida аlbicans и Fusarium solani формировать моно- и полимикробные биопленки. Показано, что максимальная биомасса биопленки образуется у клинических изолятов грибов. При этом у референс штаммов грибов C. albicans и F. solani в монопленках изначально в составе преобладают β - полисахариды. У клинического штамма C. albicans в монопленке преобладали белки и β – полисахариды, при этом количество белков в 5 раз выше чем у референс штамма. Количество белка в полимикробных пленках (C. albicans + F. solani) в первые сутки инкубации статистически достоверно выше, чем в монопленках. Показано, что моновидовые биопленки, образованные клиническими изолятами F. solani и C. albicans характеризуются высокой плотностью, плотно прикреплённые к поверхности микропланшета по сравнению с референс - штаммом. В смемшанной культуре на 5 сутки дрожжевые клетки C. albicans густо обвивали гифальные структуры F. solani. Гифы F. solani F – 417 в биопленке обеспечивали архитектурную устойчивость и выступали в качестве каркасной структуры дрожжевых клеток и псевдогифов. В то же время референс культуры C. albicans и F. solani не формируют зрелой полимикробной биопленки. Дана характеристика чувствительности микромицетов к противокрибковым препаратам. Клетки C. albicans в составе биопленок проявляли резистентность ко всем исследуемым группам препаратов, причем МИК в отношении биопленок превышала МИК планктонных микроорганизмов в 25 - 100 раз, для F. solani, в отношении биопленок, сформированных на микропланшетах, значения МИК оказались значительно выше в 25 раз. В отношении полимикробных биопленок C. albicans + F. solani показано увеличение значений МИК по сравнению со значениями для монобиопленок более чем в 2 раза. Получен ряд структурных аналогов мирамистина с использованием фрагментов различных терпенов как в качестве гидрофильной “головки”, так и в качестве липофильного “хвоста”. Среди всех протестированных соединений только одно вещество обладало активностью, сопоставимой с препаратом сравнения и представляет интерес для дальнейших исследований. Концентрации соединений, приводящие к полумаксимальному подавлению дыхательной активности на клетках HEK были значительно ниже МПК, вероятно, за счет четвертичной аммонийной группы. Проведена оценка синергизма миртенола с амикацином и хлоридом бензалкония против клеток S. aureus методом шахматной доски. При сочетании амикацина с миртенола (-) с наблюдался выраженный синергизм (иФИК 0.3-0.5) в отношении 5 штаммов из 12, с миртенолом (+) – в отношении 9 штаммов, не зависимо от их статуса (MRSA или MSSA). По подавлению образования биопленки S. aureus, в сочетании амикацина с миртенолом (-)синергизм показан в отношении 5 штаммов из 12, с миртенолом (+) - в отношении 4 штаммов. При сочетании хлорида бензалкония синергетического эффекта с миртенолом в отношении планктонных клеток S. aureus не наблюдалось и был показан аддитивный эффект, синергизм антисептика и миртенола (-) показан для 1 штамма, и в отношении 4 штаммов для миртенола (+). Относительно биопленок, синергизм был показан в отношении 6 штаммов из 12. Против C. albicans, синергизм флуконазола и миртенола (+) показан для 7 штаммов из 11. Для миртенола (-)в 4 случаях наблюдался синергизм. По подавлению биопленки, синергизм флуконазола и миртенола (-) показан в отношении 6 штаммов. В случае же миртенола (+) синергизм наблюдался в 4 случаях из 11. Миртенол (-)показал синергизм с хлоридом бензалкония на пяти штаммах, а миртенола (+) – в отношении 9 штаммов. В отношении биопленок, большинство штаммов (7 из 11) были более чувствительны к комбинации антисептика с миртенолом (+), в то время как использование миртенола (-) с хлоридом бензолкония проявляло синергизм только по отношению к 4 штаммам. Показана способность миртенола повышать эффективность хлорида бензалкония против грибково-бактериального сообщества. При комплексном использовании хлорида бензалкония с миртенолом (+) и (-) наблюдалось значительное повышение эффективности антимикробного препарата (в 8-16 раз), и полная гибель свободноплавающих клеток C. albicans наблюдалась при его концентрации 0.5 мкг/мл, гибель S. aureus наблюдалась при концентрации антисептика 0.5 мкг/мл в комплексе с миртенолом (+) и 1 мкг/мл в комплексе с миртенолом (-). В отношении клеток в составе смешанной биопленки наблюдалось повышение , комплексное использование хлорида бензалкония с терпенами приводила к гибели только клеток S. aureus. Оценено влияние терпенов на целостность мембраны бактерий. В присутствии миртенола (-) и миртенола (+), как и в случае хлорида бензалкония, наблюдалось дозозависимое падение потенциала мембраны клеток S. aureus, определяемое по интенсивности флуоресценции DioC2 в клетках, что говорит о повреждении мембраны. Падение потенциала клеток C. albicans в присутствии миртенола (-) было сопоставимо с флуконазолом. В то же время внесение миртенола (+) при максимальной концентрации способствует значительному снижению потенциала, что говорит о серьезных повреждениях мембраны клеток. Вероятно, именно из-за столь сильного воздействия на мембраны клеток миртенол (+) демонстрировал высокий процент синергизма с противомикробными препаратами в отношении C. albicans. Время полупроникновения вещества в клетку составило t½=24±1.3 мин и t½=26±1.5 мин для миртенола (-) и миртенола (+) соответственно. В случае клеток C. albicans, время полупроникновения миртенола (+) составляет 18 минут, миртенола (-) - 24 минуты. Эти данные согласуются с полученными ранее результатами о синергетическом характере взаимодействия миртенола (+) с противомикробными препаратами. С помощью ЯМР-спектроскопии исследовано взаимодействие между модельной клеточной мембраной и соединениями 30-32 (получены на предыдущем этапе работы). Так, соединения 29 и 31 связывается с поверхностью мицелл DPC, в то время как соединения 30 и 32 не связываются с мицеллами DPC. Отдельно следует подчеркнуть, что в обоих случаях это были терпенсульфиды.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Показано, что внесение культуральной жидкости S. aureus к P. aeruginosa в концентрации 1/16-1/4 объема повышает эффективность аминогликозидных антибиотиков в отношении планктонных клеток P. aeruginosa в 2 раза, а ципрофлоксацина и гентамицина в отношении клеток в биопленке - в 4 раза. Максимальный эффект наблюдался для амикацина, где эффективность антибиотика возрастала в 32 раза. Молекулярный механизм этого феномена заключается в увеличение количества β-полисахаридов и белков, что способствует образованию пористой структуры биопленки, в результате чего проницаемость для антимикробных препаратов значительно повышается. 2. Проведен комплексный анализ микробиоты мазков из зева и гематологии условно здоровых людей и пациентов, имеющих диагноз бронхиальная астма. У пациентов с бронхиальной астмой значимо снижаются индексы микробного разнообразия и отличается содержание бактерий семейств Micrococcaceae, Porphyromonadaceae, Prevotellaceae, Fusobacteriaceae, Neisseriaceae. Также в группе с бронхиальной астмой обнаружено повышение клинически значимых родов Streptococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Actinomyces, Fusobacterium, Prevotella, Porhyromonas, Treponema и снижение Actinomyces, Fusobacterium, Neisseria, Treponema. Далее на основе частных корреляций между факторами («Бронхиальная астма» и в отсутствии её, и с данными метагеномного анализа микрофлоры полости рта, индексов биоразнообразия, микробиологического посева и гематологии) основные связи между отдельными факторами были обобщены в общей графической схеме, представляющей байесовскую сеть. Была выявлена взаимосвязь между между повышением нейтрофилов и бактерий: Peptostreptococcaceae; Fusobacteriaceae; Prevotellaceae; Campilobacteraceae. Полученные нами данные показывают, что фактор-микроскопические грибы Candida albicans также был связан с астмой косвенно через фактор-моноциты. Также были составлены наиболее значимые связи между микроскопическими грибами и бактериями. Так, между фактором-Candida parapsilosis и бактериями Micrococcaceae, Carnobacteriaceae Veillonellaceae прослеживаются положительные связи и отрицательные с Coriobacteriacea; Porphyromonadaceae; Lactobacillaceae; Peptostreptococcaceae. Множественные показатели микробиома ассоциированы с количеством лейкоцитов, моноцитов, базофилов, нейтрофилов. Одна из возможностей для этого наблюдения состоит в том, что микробиом может влиять на болезнь через механизмы, опосредованные системными иммунными реакциями. В противном случае, воспалительные процессы вызывают изменения микробиома. 3. Синтезировано 10 новых производных терпеноидов. Соединения Е2, Е4 и Е11 в отношении клеток S. aureus обладали МПК и МБК 2 мкг/мл, что превышает МПК и МБК мирамистина в 2 и 4 раза. Соединения Е1, Е2 и Е4 приводили к подавлению образования биопленок клетками S. aureus при 4 мкг/мл. Таким образом соединения Е1, Е2, Е4 и Е11 могут служить перспективными соединениями для борьбы со стафилококковыми инфекциями. В отношении клеток P. aeruginosa соединения Е7 и Е11 обладают активностью сравнимую с мирамистином. Соединение Е8 также имело МПК до 8 раз ниже, чем у мирамистина. Таким образом, соединения Е7, Е8 и Е11 могут служить перспективными соединениями для борьбы с инфекциями, ассоциированными с P. aeruginosa. Соединения Е1, Е4, Е11 имели МПК 12, 94 и 47 мкг/мл в отношении Candida albicans, Aspergillus niger, Fusarium solani соответственно, что ниже МПК флуконазола в 4 раза. Для соединений Е5 и Е7 МПК были сопоставимы таковым у флуконазола. Соединение Е8 оказывало фунгицидное и фунгистатическое действие в отношении всех видов грибов. Таким образом, соединения Е8 и Е11 являются перспективными препаратами. 4. Для новых терпеноидов были получены коньюгаты с флуорофорами и оценена степень их проницаемости в грибковые и бактериальные клетки и в матрикс моно- и двувидовых бактериальных биопленок. Соединение D4 проникало в S. aureus, но не в клетки P. aeruginosa в составе биопленок. Однако быстро проникало в клетки Candida и Fusarium и связывалось с цитоплазматическими мембранами органелл. Вещество D5 обладало низкой способностью к проникновению в клетки кандиды и биопленки S. aureus, при этом в составе сообщества S. aureus-P. aeruginosa данное соединение проникало как в S. aureus, так и в P. aeruginosa. Вероятно, в составе смешанного сообщества S. aureus становится более восприимчивым к действию данного соединения. Также D5 проникал внутрь мицелиальных грибов связываясь с внутренними мембранами. Соединения с условными номерами D8 и D9 обладали высокой проникающей способностью в матрикс биопленок S. aureus, но не внутрь клеток. В случае биопленок P. aeruginosa и S. aureus-P. aeruginosa соединение D8 проявляло аналогичный эффект, в то время как для D9 проникал только в толщу смешанного сообщества. Вещества D10, D13 и D15 обладали высокой проникающей способностью в отношении клеток золотистого стафилококка как в составе моно-, так и двувидовых биопленок, при этом D10 и D15 не проникали в клетки P. aeruginosa. D10 прочно связывалось с клеточной стенкой дрожжевых грибов Candida, не проникая внутрь клетки, и слабо связывалось с клеточной стенкой мицелиального гриба. Соединения D9 и D15 проявляли повышенную проникающую способность по сравнению с контрольными соединениями. Аналогичные результаты были получены для моно- и двувидовые биопленок S. aureus и K. pneumoniae 5. В ходе выполнения данного этапа был синтезирован серосодержащий терпеноид на основе борнеола - борнансульфид, обозначенный KS1, обладающий как антимикотической активностью, так и синергетическим эффектом с флуконазолом в отношении микромицетов. Схема синтеза и формула пока не раскрывается, так как в настоящее время проводится патентный поиск и подготовка заявки на патент его способа применения в качестве антибактериального и антимикотического препарата. In vitro, KS1 оказывало антимикотическое действие при концентрациях ниже, чем стандартные антимикотические препараты Была выявлена способность соединения проявлять синергизм с флуконазолом, повышая чувствительность к препарату резистентных штаммов. С помощью конъюгата KS1 сшитого с BODIPY флуорофором показано, что KS1 способен проникать внутрь клетки, не связываясь с цитоплазматической мембраной. Результаты проведенной ЯМР-спектроскопия показали, что соединение KS1 взаимодействует с мицеллами DPC в основном своим борнановой частью молекулы. Аналогичные эксперименты миртенолом показали, что молекулы миртенола, в отличие от борнансульфида, «проваливаются» внутрь мицеллы, тогда как борнансульфид обладает в значительной степени мембранотропными свойствами.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В рамках междисциплинарного Проекта совместно с научной группой под руководством д.б.н. Каюмова А.Р. (КФУ, г. Казань) впервые выполнен синтез водорастворимых форм конъюгатов на основе мезо-бутановой и мезо-пентановой BODIPY кислот и миртенола с мирамистиновой заряженной четвертичной аммонийной группой. Для получения конъюгатов нового типа, изучения их спектральных и биологических свойств научной группой под руководством д.х.н. Антиной Е.В. (ИХР РАН, г. Иваново) наработано необходимое рабочее количество BODIPY красителей, содержащих в мезо-спейсере остатки бутановой или пентановой кислот и их сложные эфиры, руководствуясь методиками, разработанными и апробированными в предыдущие отчетные периоды Проекта. Научными группами проведен цикл совместных синтетических работ по получению конъюгатов миртенола и тиотерпеноида с BODIPY альфа-пропановой кислотой. Для синтеза соответствующих конъюгатов научной группой под руководством д.х.н. Антиной Е.В. (ИХР РАН, г. Иваново) наработано рабочее количество альфа-пропановой кислоты BODIPY. С целью разработки на основе галогензамещеных эфиров BODIPY новых эффективных фотосенсибилизаторов для антибактериальной и антимикотической фотодинамической терапии научной группой под руководством д.х.н. Антиной Е.В. (ИХР РАН, г. Иваново) за отчетный период апробированы методики синтеза и получены рабочие количества 4,4′-дибром- и 4,4′-дийодзамещенных BODIPY люминофоров со сложноэфирной –(СН2)3СООСН3 группой в мезо-спейсере. Идентификация всех синтезированных соединений за четвертый отчетный период Проекта проведена с привлечением Н1, С13 ЯМР-, масс- и электронной спектроскопии, элементного анализа. Обобщены и проанализированы результаты молекулярного докинга и спектральных исследований, полученные за отчетный период научной группой под руководством д.х.н. Антиной Е.В. (ИХР РАН, г. Иваново). Установлено, что процесс образования молекулярных комплексов альфа- и мезо-функционализированных BODIPY и их терпеновых конъюгатов с сывороточными альбуминами является самопроизвольным и протекает за счёт водородных и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий. При этом альфа-замещение атомов водорода в пиррольных ядрах BODIPY сложноэфирными группами с терпенами и бэтта галогенирование дипиррометенового остова увеличивает аффинность люминофоров к сывороточным белкам крови. Результаты спектральных исследований показали, что введение в альфа- и мезо-положение дипиррометенового остова BODIPY люминофора остатков карбоновых кислот и их сложноэфирных групп с миртенолом и тиотерпеном, в том числе с мирамистиновой заряженной четвертичной аммонийной группой, не снижает флуоресцентные характеристики люминофоров (до φ ~96%) по сравнению с исходными BODIPY прекурсорами. Введение в альфа-положение пиррольных ядер остатков пропановой кислоты и, особенно, бэтта-галогенирование люминофоров значительно (до ~50 нм) смещает максимумы полос поглощения и флуоресценции в красную область по сравнению с BODIPY мезо-карбоновыми кислотами и их сложными эфирами. Наиболее заметное понижение флуоресценции наблюдается для дибром- и дийодзамещенных BODIPY эфиров. Квантовые выходы флуоресценции галогенированных красителей составляют не более ~2–32% в зависимости от молекулярной структуры и свойств среды, что обусловлено проявлением эффекта «тяжелого» атома. Важным достоинством дибром- и дийодзамещенных BODIPY эфиров является высокий квантовый выход генерации синглетного кислорода: ΦΔ = 50–61% и 65–78% соответственно, что представляет интерес при разработке на их основе новых тераностиков с функциями ФДТ, AФДТ-агентов и флуоресцентных красителей. Важно отметить, что, в отличие от большинства гидрофобных сложных эфиров BODIPY со спиртами, конъюгаты, содержащие в мезо- или альфа-сложноэфирные заместители, включающими наряду с терпеновым радикалом положительно заряженную четвертичную аммонийную группу, демонстрируют удовлетворительную для биологических исследований растворимость (до с ~10-5 моль/л) в воде и буферных растворах с рН от 1.65 до 9.18. При этом, как в кислых, так и в щелочных водных средах красители химически фотостабильны и сохраняют высокую флуоресценцию (до φ ~83%). Отмечено, что мезо-замещение протона метинового мостика BODIPY на остатки карбоновых кислот и их сложных эфиров почти в ~2 раза увеличивает фотостабильность хромофорной системы красителей по сравнению с мезо-незамещенными аналогами. Заметное понижение (до ~ 2–4 раз) фотостабильности красителей наблюдается у 2,6-дибром- и дийоддипиррометеновых эфиров BODIPY по сравнению с негалогенированными аналогами. Увеличению скорости процессов фотодеструкции галогензамещенных хелатов при УФ облучении может способствовать эффективная генерация синглетного кислорода красителями за счет эффекта «тяжелого» атома. Установлено, что введение положительно заряженной аммонийной группы в мезо-заместитель BODIPY конъюгатов увеличивает почти в ~9–14 раз сродство красителя к гидрофильным средам по сравнению с незаряженными аналогами, что вызвано ростом гидратационного вклада в сольватацию люминофора. Напротив, сочетание галогенирования и мезо-замещения увеличивает в ~1.3 раза сродство эфиров BODIPY к липидным биоструктурам и способствует эффективному транспорту люминофоров через слой клеточной мембраны по сравнению с карбоновыми кислотами дипиррометенатов бора(III). Научной группой под руководством д.б.н. Каюмова А. Р. (ФГАОУ ВО КФУ, г. Казань) проведены биологические исследования in vitro по изучению эффективности транспорта и локализации конъюгатов BODIPY в клеточных органеллах патогенных микроорганизмов. Установлено, что конъюгация BODIPY флуорофора и миртенола, содержащего мирамистиновый фрагмент, благоприятствует проникновению красителей в мицелиальные грибы Fusarium solani, но ухудшает их связывание с S. aureus, K. pneumoniae и P. aeruginosa. Обнаружено, что введенная между миртеноловым и флуорофорным фрагментами заряженная группа четвертичного аммония восстанавливает окрашивание бактериальных клеток, но не влияет на окрашивание грибов. Показано, что альфа-функционализированные конъюгаты BODIPY с миртенолом и титерпеноидом в отличие от структурно родственной карбоновой кислоты способны эффективно проникают в цитоплазму клеток грибов C. albicans. При этом конъюгат с титерпеновым остатком наиболее интенсивно окрашивает мембранные структуры органелл (мембраны ядер и митохондрий), по сравнению с миртеноловым конъюгатом. В результате определения чувствительности планктонных клеток эталонного и клинического штаммов дрожжевых грибов к противогрибковым препаратам, установлено, что альфа-замещенные монотерпеновые конъюгаты BODIPY проявляют эффективную противогрибковую активность, в отличии от карбоновой кислоты. Совокупность результатов теоретических (молекулярный докинг) и экспериментальных (in vitro) исследований показала, что конъюгация BODIPY с монотерпеноидами является перспективным способом увеличения сродства красителей к биоструктурам. Кроме того, конъюгаты BODIPY с монотерпенами представляют интерес при использовании их в качестве флуоресцентных маркеров в оценке мембранных структур клеток патогенов, а также при определении эффекторов и модулировании in vitro метаболических путей грибковой клетки, что представляет интерес в исследовании транспорта лекарственных препаратов in vivo. Результаты исследований, полученные в рамках междисциплинарного Проекта за четвертый отчетный период при участии двух научных групп (руководитель д.х.н. Антина Е.В. (ИХР РАН, г. Иваново) и руководитель д.б.н. Каюмов А.Р. (КФУ, г. Казань)), отражены в 9 статьях, опубликованных в соавторстве и по отдельности.