КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 20-65-47031

НазваниеСтруктурные основы белоксинтезирующего аппарата Candida albicans

РуководительВалидов Шамиль Завдатович, кандидат наук (признаваемый в РФ PhD)

Организация финансирования, регионфедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет", Республика Татарстан

Года выполнения при поддержке РНФ2020 - 2023

КонкурсКонкурс 2020 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации (междисциплинарные проекты)»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-403 - Медицинская микробиология и вирусология

Ключевые словамеханизм синтеза белка, рибосома, структура, белок, РНК, антибиотик, структурная биология, Криоэлектронная микроскопия, Рентгеноструктурный анализ

Код ГРНТИ34.15.00


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Одним из наиболее распространенных патогенов человека является Candida albicans –вид дрожжеподобных грибов, вызывающий заболевания кожи, слизистых оболочек, различных органов и систем человека и животных. Штаммы C. albicans выделяются у 80% индивидуумов, при этом многие носители не страдают от присутствия этого микроорганизма. Однако, при нарушении собственной микрофлоры хозяина, например, при лечении методом химиотерапии, при проведении антибиотикотерапии, а также при изменении иммунного баланса в организме хозяина, C. albicans эффективно колонизирует макроорганизм, что приводит к развитию кандидозов различной степени тяжести. Лечение возникшего кандидоза требует применения дорогостоящих препаратов и, как правило, мало эффективно из-за серьезных побочных эффектов: препараты, воздействующие на клеточные мишени C. albicans, часто воздействуют на похожие клеточные мишени в организме человека. За последние десятилетия достигнут существенный прогресс в изучении структуры и механизма белкового синтеза в клетке. Во многом успехи в исследованиях были достигнуты в результате гибридного применения подходов структурной биологии и медицинской микробиологии. Методом кристаллографии с атомным разрешением была определена структура рибосомы и нескольких рибосомных функциональных комплексов, моделирующих различные стадии белкового синтеза: инициацию, элонгацию и терминацию, когда рибосома взаимодействует с многими белковыми факторами. Последние разработки в области криоэлектронной микроскопии позволяют определить структуру рибосомы и ее комплексов с белковыми факторами с высоким разрешением и интерпретировать механизм взаимодействия и структурную организацию на молекулярном уровне. А современные методы спектроскопии ЯМР и малоуглового рассеяния позволяют исследовать структуру и динамику биомолекул в растворе – естественной (нативной) среде живых организмов. Данные, полученные этими биофизическими методами создали основу для моделирования в трехмерном пространстве биохимических реакций, протекающих при белковом синтезе. Комплексные знания о структуре рибосомы и других молекулярных составляющих аппарата трансляции позволяют изучать регуляцию этих процессов посредством небольших молекул, например: антибиотиков. Это обуславливает важность расширения данных знаний в области изучения патогенных организмов и поиска специфических различий в организации аппарата белкового синтеза патогенных организмов. В рамках данного проекта методами структурной биологии планируется изучение компонент аппарата синтеза белка с атомарным разрешением и выявление специфических молекулярных механизмов обеспечивающих патогенность C. albicans. Полученная информация о структурных особенностях строения рибосомы и факторов регуляции трансляции C. albicans позволит исследовать специфичность свойств патогена, взаимоотношения его с организмом человека, откроет возможность для разработки высокоселективных антибиотиков, обладающих низкой токсичностью для человека.

Ожидаемые результаты
В краткосрочной перспективе целью проекта является определение с высоким разрешением структуры рибосомы Candida albicans и ее функциональных комплексов. Для достижения указанной цели и создания с атомарным разрешением модели рибосомы будут использованы методы рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии. Полученная модель рибосомы эукариотического патогена C. albicans может быть использована для анализа ко-кристаллизации рибосомы с разрабатываемыми ингибиторами. Долгосрочной целью проекта является изучение механизмов регуляции трансляции C. albicans за счет связывания белковых факторов. В частности, будет исследована пространственная структура фактора элонгации eIF5a и ферментов, модифицирующих этот фактор: DHS (deoxyhypusine synthase) и DOHH (deoxyhypusine hydroxylase), а также их комплексов в процессе модификации. Структурные исследования компонент белок синтезирующего аппарата C. albicans позволят выявить специфические механизмы обусловливающие резистентность Candida albicans к антибиотикам, поскольку eIF5a необходим для синтеза мембранных белков с большим количеством поли-пролинов. Для функционального анализа белков eIF5a, DHS и DOHH будут получены делеционные мутанты нарушающие синтез и гипузинирование eIF5a. Делеции фактора элонгации и модифицирующих его белков значительно снижает жизнеспособность культуры дрожжей, кроме того, уровни экспрессии eIF5a в разных физиологических состояниях культуры C. albicans (в гифах и в отдельных клетках) значительно различаются. Белки eIF5a, DHS и DOHH менее консервативны чем рибосома, поэтому, в результате изучения структуры этих белков могут быть выявлены сайты для разработки ингибиторов модификации eIF5a у C. albicans, но неспецифичные к аналогичным структурам в клетках человека.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Согласно планам реализации проекта были подобраны условия и разработан протокол экспрессии и очистки 80S рибосомы гаплоидного штамма C. albicans GZY81. При этом качество выделенных препаратов было достаточным для исследования 80S рибосомы C. albicans методами рентгено-структурного анализа и крио-электронной микроскопии. Основные изменения в протоколе очистки касались концентрации хлорида калия, количества добавляемых ингибиторов протеаз и РНКаз, а также использования ацетата аммония для хранения рибосом и улучшения формы кристаллов. Кроме того, были оптимизированы условия дегидратации и заморозки кристаллов. Данные рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением были получены на линиях Proxima1 синхротрона Soleil (Франция) и на линии PX синхротрона SLS (Швейцария). После обработки наилучший набор данных для кристаллов рибосом C. albicans имеет разрешение 4,0 Å, что позволяет исследовать центры связывания антибиотиков (КФУ). Для исследований с помощью крио-электронной микроскопии в МФТИ были выбраны условия витрификации, позволяющие автоматизировать процесс и получать воспроизводимый результат. Оценка качества образцов производилась с помощью негативного контрастирования на микроскопе Polara G2 (МФТИ). Для подбора условий витрификации мы сосредоточились на нескольких переменных, а именно на материале сеток, наличии или отсутствии подложки, продолжительность плазменной очистки сеток, продолжительность и сила блоттинга при нанесении образца на сетку. Наиболее воспроизводимые результаты были получены при использовании золотых сеток с углеродной подложкой, при этом время для очистки составляло 60 секунд. Приготовленные сетки после блоттинга погружались в жидкий пропан для витрификации. В дальнейшем готовые сетки либо помещались для хранения в жидкий азот, либо непосредственно загружались в микроскоп для исследований. На финальном этапе экспериментов первого года был проведен сбор данных с оптимизированных образцов 80S рибосом из C.albicans на базе Нидерландского центра электронной наноскопии (NeCEN). Подготовка образцов была произведена, используя отлаженные в МФТИ протоколы витрификации. Образцы наносились на золотые сетки R 1.2/1.3 с углеродной подложкой, толщиной 10нм. Сбор данных производился на топовом микроскопе Титан Криос, оборудованным камерой прямой детекции электронов К3 в режиме считывания электронов (counting mode). Было собрано около 10 тысяч микроскопических изображений. Предварительный анализ во время сбора данных показал, что минимальное ожидаемое разрешение с полученных изображений около 3 Å, соответственно после обработки данных мы ожидаем получить карту с разрешением выше 3 Å. Для получения комплексов 80S рибосом из C.albicans с фактором eIF5a необходимо выделение свободных 80S, не содержащих белок Stm1. Данный белок встраивается в рибосому и может препятствует ее взаимодействию с факторами элонгации. Для удаления гена stm1 был использован метод CRISPR/Cas согласно протоколу предложенному в статье (https://doi.org/10.1038/s41596-018-0122-6). Поскольку редактирование с помощью CRISPR/Cas лучше всего проходит на гаплоидных штаммов было решено использовать штамм C.albicans GZY815. С этим же штаммом были проведены работы по оптимизации выделения рибосом (см. выше) как для кристаллизации, так и для исследований с помощью крио-электронной микроскопии. Кассета FlΔstm1:sgRNA, содержащая фланги, окружающие stm1 и sgRNA нацеленные на 5’- и 3’-концевые последовательности stm1, была субклонирована в составе вектора pJK-caCas9-NatMX-Neut5L. Результирующая плазмида pJK-caCas9-NatMX-Neut5L:FlΔstm1:sgRNA была использована для трансформации гаплоидного штамма C.albicans GZY815. Клоны устойчивые к антибиотику нурзеотрицину были отобраны и проверены на наличие гена stm1 с помощью системы праймеров использованных для амплификации фланговых регионов. Клоны с отсутствующим геном stm1 были отобраны для работы. Один из клонов C.albicans GZY815 (Δstm1), обозначенный как C.albicans SB22, будет использован для выделения рибосом, поскольку комплексы нетранслирующей рибосомы C.albicans и элонгационного фактора eIF5a могут быть образованы в отсутствии продукта гена stm1. Материалы работы по получению штамма C.albicans SB22 готовятся для публикации.

 

Публикации

1. Згадзай Ю., Колосова О., Стеценко А., Усачев К., Валидов Ш., Рогачев А., Гуськов А., Юсупов М. Initial characterization of the 80S C. albicans ribosome by single particle cryogenic electron microscopy Сборник тезисов XXVIII Российской конференции по электронной микроскопии, Т.2, C. 178-179 (год публикации - 2020).