Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Согласно планам реализации проекта были подобраны условия и разработан протокол экспрессии и очистки 80S рибосомы гаплоидного штамма C. albicans GZY81. При этом качество выделенных препаратов было достаточным для исследования 80S рибосомы C. albicans методами рентгено-структурного анализа и крио-электронной микроскопии. Основные изменения в протоколе очистки касались концентрации хлорида калия, количества добавляемых ингибиторов протеаз и РНКаз, а также использования ацетата аммония для хранения рибосом и улучшения формы кристаллов. Кроме того, были оптимизированы условия дегидратации и заморозки кристаллов. Данные рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением были получены на линиях Proxima1 синхротрона Soleil (Франция) и на линии PX синхротрона SLS (Швейцария). После обработки наилучший набор данных для кристаллов рибосом C. albicans имеет разрешение 4,0 Å, что позволяет исследовать центры связывания антибиотиков (КФУ). Для исследований с помощью крио-электронной микроскопии в МФТИ были выбраны условия витрификации, позволяющие автоматизировать процесс и получать воспроизводимый результат. Оценка качества образцов производилась с помощью негативного контрастирования на микроскопе Polara G2 (МФТИ). Для подбора условий витрификации мы сосредоточились на нескольких переменных, а именно на материале сеток, наличии или отсутствии подложки, продолжительность плазменной очистки сеток, продолжительность и сила блоттинга при нанесении образца на сетку. Наиболее воспроизводимые результаты были получены при использовании золотых сеток с углеродной подложкой, при этом время для очистки составляло 60 секунд. Приготовленные сетки после блоттинга погружались в жидкий пропан для витрификации. В дальнейшем готовые сетки либо помещались для хранения в жидкий азот, либо непосредственно загружались в микроскоп для исследований. На финальном этапе экспериментов первого года был проведен сбор данных с оптимизированных образцов 80S рибосом из C.albicans на базе Нидерландского центра электронной наноскопии (NeCEN). Подготовка образцов была произведена, используя отлаженные в МФТИ протоколы витрификации. Образцы наносились на золотые сетки R 1.2/1.3 с углеродной подложкой, толщиной 10нм. Сбор данных производился на топовом микроскопе Титан Криос, оборудованным камерой прямой детекции электронов К3 в режиме считывания электронов (counting mode). Было собрано около 10 тысяч микроскопических изображений. Предварительный анализ во время сбора данных показал, что минимальное ожидаемое разрешение с полученных изображений около 3 Å, соответственно после обработки данных мы ожидаем получить карту с разрешением выше 3 Å. Для получения комплексов 80S рибосом из C.albicans с фактором eIF5a необходимо выделение свободных 80S, не содержащих белок Stm1. Данный белок встраивается в рибосому и может препятствует ее взаимодействию с факторами элонгации. Для удаления гена stm1 был использован метод CRISPR/Cas согласно протоколу предложенному в статье (https://doi.org/10.1038/s41596-018-0122-6). Поскольку редактирование с помощью CRISPR/Cas лучше всего проходит на гаплоидных штаммов было решено использовать штамм C.albicans GZY815. С этим же штаммом были проведены работы по оптимизации выделения рибосом (см. выше) как для кристаллизации, так и для исследований с помощью крио-электронной микроскопии. Кассета FlΔstm1:sgRNA, содержащая фланги, окружающие stm1 и sgRNA нацеленные на 5’- и 3’-концевые последовательности stm1, была субклонирована в составе вектора pJK-caCas9-NatMX-Neut5L. Результирующая плазмида pJK-caCas9-NatMX-Neut5L:FlΔstm1:sgRNA была использована для трансформации гаплоидного штамма C.albicans GZY815. Клоны устойчивые к антибиотику нурзеотрицину были отобраны и проверены на наличие гена stm1 с помощью системы праймеров использованных для амплификации фланговых регионов. Клоны с отсутствующим геном stm1 были отобраны для работы. Один из клонов C.albicans GZY815 (Δstm1), обозначенный как C.albicans SB22, будет использован для выделения рибосом, поскольку комплексы нетранслирующей рибосомы C.albicans и элонгационного фактора eIF5a могут быть образованы в отсутствии продукта гена stm1. Материалы работы по получению штамма C.albicans SB22 готовятся для публикации.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
За отчетный период был произведен полный цикл обработки данных полученных с использованием метода крио-электронной микроскопии для образцов как вакантной рибосомы 80S из C.albicans, так и ее комплексов с антибиотиками. Обработка данных производилась на вычислительных мощностях МФТИ. Полученные реконструкции высокого разрешения (2.3-2.7 Å) были использованы для построения модели рибосомы 80S из C.albicans в присутствии и отсутствии антибиотиков с помощью программного обеспечения Coot. Уточнение полученных моделей было произведено с помощью Phenix.real space refinement. Так же была произведена обработка данных, полученных с помощью рентгеноструктурного анализа для вакантной рибосомы, но поскольку разрешение в этом случае было около 4 Å, нами было принято решение сфокусироваться на использовании для дальнейшего анализа результатов, полученных с помощью крио-электронной микроскопии. Был произведен сравнительный анализ полученных моделей рибосомы 80S из C.albicans с опубликованными ранее моделями рибосом из H.sapiens и S.cerivisae. Созданы генетические конструкции, позволяющие экспрессировать белки DHS, DOHH и eIF5A из C. albicans в гетерологичной системе E.coli, а также разработана кассета коэкспрессирующая гены белков DHS, DOHH и eIF5A из C. albicans для изучения механизма посттрансляционной модификации и выделения модифицированного фактора eIF5A из C. albicans. Для белков DOHH, DHS, eIF5a определены условия, при которых в кристаллизационных каплях был детектирован гранулярный преципитат или микрокристаллы, а также получены монокристаллы эукариотического фактора трансляции eIF5A C. albicans.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В отчетном периоде коллективами КФУ и МФТИ были достигнуты следующие результаты: Получена кристаллографическая модель эукариотической рибосомы 80S рибосомы патогенных дрожжеподобных грибов Candida albicans с разрешением 3.0 Å не содержащая тяжелых атомов (таких как осмий гексамин), что существенно увеличивает возможности для скрининга ингибиторов трансляции по сравнению с существующей кристаллографической моделью эукариотической рибосомы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Методом просвечивающей криоэлектронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа показано, что синтезированный ингибитор хлоролизоклимид не связывается с рибосомой патогенных дрожжеподобных грибов Candida albicans, что также подтверждалось на экспериментах в бесклеточной системе трансляции. Методом просвечивающей криоэлектронной микроскопии получена структура 80S рибосомы патогенных дрожжеподобных грибов Candida albicans с антибиотиком генитицином с разрешением 3 Å. Методом просвечивающей криоэлектронной микроскопии получена структура 80S рибосомы патогенных дрожжеподобных грибов Candida albicans с антибиотиком цефаэлином связанным с мРНК тунелем рибосомы с разрешением 2.43 Å. Методом просвечивающей рентгеноструктурного анализа получена структура 80S рибосомы патогенных дрожжеподобных грибов Candida albicans с антибиотиком айлайтоном с разрешением 3,0 Å. Установлено ингибитор айлайтон из семейства квассиноидов с противораковой активностью ингибирует трансляцию патогенных дрожжеподобных грибов Candida albicans путем связывания с А-сайтом центра пептидилтрансферазы на 60S субъединице рибосомы. Методом рентгеноструктурного анализа получена структура 80S рибосомы патогенных дрожжеподобных грибов Candida albicans с антибиотиком гигромицин Б с разрешением 3,0 Å. Ранее получение этого комплекса методом РСА для эукариотической рибосомы считалось невозможным из-за наличия тяжелых атомов в растворах криопротекции. Разработан протокол in vitro реконструкции функционального комплекса 80S рибосомы патогенных дрожжеподобных грибов Candida albicans с лигандами (тРНК и мРНК). Методом просвечивающей криоэлектронной микроскопии получена структура комплекса 80S рибосомы дрожжеподобных грибов Candida albicans с тРНК и мРНК с разрешением 2,8 Å. Методом малоуглового рентгеновского рассеяния рентгеновский лучей (МУРР или SAXS) установлена структура тетрамера белка DHS (Deoxyhypusine Synthase) из дрожжеподобных грибов Candida albicans в растворе. Разработан протокол получения комплекса белков DHS с eIF5a из дрожжеподобных грибов Candida albicans. На основе метода спектрофотометрии разработан подход для контроля протекания реакции пост-трансляционной модификации белка eIF5a из дрожжеподобных грибов C. albicans в присутствии белков DHS спермидина и NAD. Методом диффузии водяных паров в модификации “висячая капля” найдены условия кристаллизации белка eIF5a из дрожжеподобных грибов Candida albicans, в которых образуются монокристаллы. Разработана плазмидная конструкция для гетерологичной коэкспрессии генов eif5a, dhs и dohh из Candida albicans в Escherichia coli.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
На итоговом этапе реализации проекта был разработан протокол выделения и очистки индивидуальных рибосом из патогенных дрожжеподобных грибов Candida auris и методом просвечивающей криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ) была получена структура 80S рибосомы Candida auris с разрешением 2,8 ангстрема. Сравнение с полученной нами ранее методами криоЭМ и рентгеноструктурного анализа структуры рибосомы Candida albicans, а также известными другими структурами эукариотических рибосом дрожжей Saccharomyces cerevisiae и человека Homo sapiens, выявило характерные для Candida auris отличия как на уровне рРНК так и на уровне рибосомных белков. Выявлены изменения в геометрии некоторых рибосомальных элементов, что может указывать на различия у Candida auris во взаимодействиях рРНК с рибосомальными белками. Кроме структуры вакантной рибосомы Candida auris мы также методом криоЭМ с разрешением 2 Å установили структуру комплекса 80S рибосомы Candida auris с антибиотиками бластицидином и анизомицином и показали, что связывание антибиотиков привело к стабилизации некоторых мобильных элементов рибосомы Candida auris. Методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 2.2 Å была установлена пространственная структура N-концевого домена белка eIF5a (c Met1 по Val63) из дрожжеподобных грибов Candida albicans, в которой наблюдается плотность для боковой цепи аминокислотного остатка Lys32, который в эукариотах модифицируется гипузином. Вместе с разработанным нами подходом по проведению реакции гипузинирования белка eIF5a из Candida albicans in vitro, возможна дальнейшая оптимизация протокола выделения для получения модифицированного белка в достаточном количестве для кристаллизации, что в свою очередь позволит визуализировать гипузинирование в структуре eIF5a.