Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Выделение внеклеточных нановезикул (ВН) является одним из самых важных этапов, который значительно влияет на дальнейший анализ, является по сегодняшний день не стандартизированным процессом, и преимущества использования различных методов активно обсуждаются (Salmond N., Nanoscale Adv., 2021). Ввиду отсутствия стандартного метода выделения ВН из культуральной среды и плазмы, в первую очередь было сделано сравнение наиболее часто использованных на сегодняшний день подходов: дифференциальное ультрацентрифугирование (Witwer K., J Extracell Vesicles, 2013), эксклюзионная хроматография (Baranyai., PLoS One, 2015) и ультрафильтрация (Kornilov R., . J Extracell Vesicles, 2018). Так как известно, что популяция ВН гетерогенна и состоит из разных субпопуляций (Crescitelli R., J Extracell Vesicles, 2020), которые отличаются между собой в биофизических свойствах и молекулярных сигнатурах, помимо выделения ВН, целью также было рассмотреть подходы для фракционирования ВН на субпопуляции по размеру. Итогом этого этапа проекта стал финальный протокол выделения и фракционирования ВН по размеру, который основан на комбинации фильтрации и эксклюзионной хроматографии. Используя этот подход, были выделены ВН из клеточных линий MCF7, MDA-MB-231, SKOV3, и MCF10, а также из плазмы здорового донора и фракционированы по размеру. Всего было получено 3 фракции, насыщенных ВН, из каждой клеточной линии и плазмы. На сегодняшний день не существует одного метода для проверки количества и качества изолированных ВН (Hartjes T., Bioengineering (Basel), 2018). Из-за этого была проведена детальная характеризация полученных образцов ВН комбинацией ключевых методик, в которую входили: анализ траекторий наночасиц (АТН), динамическое рассеяние света (ДРС), сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), атомно-силовая микроскопия (АСМ), иммуно-электронная микроскопия, вестерн-блот, спектрофотометрический анализ белка А280 и использование бицинхониновой кислоты (BCA) для определения общего количества белка. Средний гидродинамический диаметр ВН, который был определен АТН, находился в диапазоне 90-140 нм с концентрацией 2Е10-4Е12 частиц/мл. ДЛС анализ показал средний размер ВН 73-140 нм, распределение по размерам содержало один пик и отсутствие пиков в диапазонах <20 нм и >1 мкм. Также, используя ДЛС и АТН удалось подтвердить различие размера ВН между полученными фракциями. Как ожидалось, ВН с наибольшим размером элюировались в ранних фракциях, в то время как ВН с наименьшим размером элюировались в более поздних фракциях. Структура ВН была визуализирована, используя СЭМ и АСМ, и было подтверждено, что анализируемые АТН и ДРС частицы были ВН. Вестерн-блот анализ подтвердил присутствие мембранных сигнатур ВН, включая мембранный белок CD9, CD63 и EpCAM, а отсутствие Calnexin чистоту полученных фракций. Была найдена зависимость относительного количества мембранных белков CD9 и CD63 от времени элюции, подчеркивая гетерогенность популяции ВН. Иммуноэлектронная микроскопия позволила подтвердить присутствие мембранного белка CD63, меченного золотыми наночастицами. BCA и АТН анализ показали прямую корреляцию между общего количества белка и концентрации ВН. Спектрофотометрический анализ белка (А280) позволил подтвердить благополучное разделение ВН, используя эксклюзионную хроматографию, от присутствующих в изначальном образце макромолекул, не связанных с ВН. Были выбраны три фракции, насыщенные ВН, для последующего изучения их поверхностной активности. Научной новизной и целью предлагаемого проекта на первый год являлось изучение поверхностной активности ВН и динамики адсорбции на границах раздела газ-жидкость и жидкость-жидкость. В качестве подхода планировалось использовать динамическое поверхностное натяжение для изучения диффузии и адсорбции ВН на границах раздела газ-жидкость и жидкость-жидкость. Для проведения данного эксперимента был разработан прибор, который позволил измерить поверхностное/межфазное натяжение почти в реальном времени, используя решения уравнения Юнга-Лапласа и теорию идентификации, чтобы найти поверхностное натяжение, которое минимизирует ошибки наименьших квадратов между теоретическими и экспериментальными формами границы фаз. Первоначально во время измерений, поверхностное натяжение было близким к поверхностному натяжению фосфатного буфера (~73 мН/м), но через короткое время поверхностное натяжение всех образцов, содержащих ВН, было динамическим и варьировалось от образца к образцу, особенно через 4 часа после образования висячей капли. Динамическое поверхностное натяжение (𝛾) со временем уменьшалось на 10-37% и результаты показали, что эти изменения ∆𝛾 линейно коррелируют с количеством ВН и общим количеством белка. Изменения межфазного натяжения фракций, насыщенных ВН, также присутствовали и линейная зависимость была найдена в системе ВН в фосфатном буфере-изопропилмиристат. Зависимость динамического поверхностного натяжения от концентрации ВН показала, что ВН поверхностно-активны. Предполагается, что поверхностная-активность ВН по большей мере связана с присутствием поверхностно-активных мембранных макромолекул (особенно мембранных белков) на их поверхности, так как была показана линейная зависимость поверхностного/межфазного натяжения от общего количества белка. Однако, в полученных фракциях популяции ВН, прямой зависимости поверхностной активности от размера ВН найдено не было. Линейная корреляция между поверхностным натяжением и квадратным корнем времени (𝛾 и √𝑡 для раннего времени; 𝛾 и 1/√𝑡 для позднего времени), подтвердила, что адсорбция ВН на разделе фаз ограничена диффузией. Представленная математическая модель адсорбции ВН на разделе фаз показала, что энергия адсорбции ВН (~6,44𝐸4*𝑘_𝐵*𝑇) значительно превышает энергию тепловых флуктуаций, которая находится ближе к 𝑘_𝐵*𝑇. Также было показано, что в исследованном здесь диапазоне концентраций ВН нет значительной разницы в поверхностном натяжении, когда время после создания висячей капли приближается к бесконечности. Эти данные позволили сделать вывод, что адсорбция ВН на границе раздела более термодинамически предпочтительна. Таким образом, адсорбция ВН на границе раздела является необратимым процессом и после длительного периода времени покрытие поверхности границы раздела фаз в итоге приблизится к максимуму 0,91. Также необратимая адсорбция означает, что при концентрации ВН ниже, чем ~3,4E-10 моль/м3, концентрация ВН в основном объеме капли начнет уменьшаться после создания монослоя ВН на разделе фаз. Результат также показал, что через 4 часа после формирования висячей капли, процент покрытой ВН поверхности варьирует от 20 до 80%, означая, что покрытие поверхности капли монослоем ВН потребует больше 4 часов.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Поверхность раздела жидкость-твердое тело часто встречается во время исследований и клинических работ. Например, взаимодействие белков с твердыми поверхностями очень распространено во многих природных процессах и биомедицинских технологиях (Hlady V. & Buijs J., Curr. Opin. Biotechnol. 1996). Адсорбция белка на твердой поверхности зависит от множества параметров, таких как размер белка, заряд, конформация, тип и текстура поверхности и другие. (Dee et al., An Introduction to Tissue - Biomaterial Interactions, John Wiley & Sons: Hoboken, N.J., 2003; Hlady V. & Buijs J., Curr. Opin. Biotechnol. 1996). В дополнение к границам раздела газ-жидкость и жидкость-жидкость ВН являются поверхностно-активными при наличии границы раздела жидкость-твердое тело. Было показано, что со временем хранения ВН при температуре 4°С и выше снижается их концентрация в объеме, что, как полагают, в первую очередь связано с их адсорбцией на поверхности раздела фаз (Evtushenko E.G. et al., PLoS one, 2020). Это адсорбционное свойство является одним из важнейших после выделения ВН из биожидкостей и должно учитываться при разработке диагностических платформ, препаратов или проведении экспериментальных работ. Изучение поверхностной активности ВН при наличии границы раздела жидкость-твердое было основной задачей второго года проекта. Помимо изучения поведения ВН в присутствии раздела фаз газ-жидкость, в последнее время также проводились исследования адсорбции ВН в присутствии раздела фаз жидкость-твердое тело. Было показано, что со временем хранения ВН при температуре 4°С и выше происходит уменьшение их концентрации в объеме. Гипотетически уменьшение концентрации ВН со временем может происходить из-за нескольких различных процессов: деградация белков ВН (Kumeda N. et al., Biol Pharm Bull., 2017); распад везикул на более мелкие фрагменты (Baranyai T. et al., PLoS One. 2015), сопровождающийся выходом их содержимого в окружающий раствор; агрегация (Bosch S. et al., Sci Rep., 2016) или слияние ВН (Maroto R., J Extracell Vesicles, 2017); адсорбция ВН к поверхности материала при хранении. Однако в рецензируемых статьях не были показаны экспериментальные доказательства последнего механизма (адсорбции), но многие исследователи заявляли, что этот процесс может происходить во время хранения ВН (Witwer K.W. et al., J Extracell vesicles, 2013, Richter et al., J Vis Exp., 2019; Zarvoni N. et al., Methods, 2015). В некоторых исследованиях и протоколах сообщалось об использовании пробирок с низким связыванием белка для хранения или работы с ВН (Enderle D. et al., PLoS One, 2015; Gaspar L.S. et al., Mol Ther-Methods Clin Dev., 2020) без экспериментальной основы для такого выбора. Недавно были представлены более подробные данные о влиянии поверхности пробирок и их покрытия на адсорбцию ВН (Evtushenko E.G. et al., PLoS One, 2020). Адсорбция ВН на поверхности материала протекает по-разному. Если концентрация высока и общее количество вещества намного больше, чем способность связывания с поверхностью, относительных потерь почти не происходит. Если концентрация достаточно низкая, то общее количество вещества мало по сравнению с поверхностной связывающей способностью, в итоге практически все ВН могут быть потеряны из объема раствора. Это свойство адсорбции исходит из поверхностной активности ВН. Это свойство после выделения ВН из биожидкостей является одним из наиболее важных и должно учитываться при разработке диагностических платформ, лекарственных препаратов или проведения экспериментальных работ. Изучение поверхностной активности ВН в присутствии раздела фаз жидкость-твердое тело являлось основной задачей второй части проекта. В результате исследований были получены новые данные об особенностях поведения поверхностно-активных ВН в присутствии границы раздела фаз жидкость-твердое тело. В отличие от уже опубликованных работ, твердым телом являлась поверхность различных материалов, таких как полипропилен, стекло, золото и кремний, которые часто используются при работе с ВН. Концентрация ВН, которая использовалась в данном исследовании, варьировалась от 4Е8 до 8Е10 #/мл. Результаты Анализа Траекторий Наночастиц (АТН) показали присутствие разной степени неспецифической адсорбции ВН (от 2 до 36% ВН, изначально присутствующих в образце) ко всем не модифицированным материалам. Было определено, что использование стекла и полипропилена, модифицированного БСА, приводит к наименьшим потерям ВН в объеме, в то время как кремний приводит к наибольшим потерям ВН из-за их неспецифической адсорбции к поверхности после 6 и 24 часов хранения при 4°C и 20°C. Неспецифическая адсорбция к использованным в этом проекте поверхностям материалов без или с модификацией БСА была также впервые подтверждена, используя Сканирующую Электронную Микроскопию, Атомно-Силовую Микроскопию, Рамановскую спектроскопию, Темнопольную Лазерную Ультрамикроскопию (ТЛУ), Кварцевый Микробаланс, оптический сенсор, состоящий из интерферометра Маха-Цендера в микрофлюидном чипе и Биослойный Интерферометр. Модификация поверхности, используя БСА, позволяет уменьшить количество неспецифически адсорбированных ВН примерно в 2 раза. Также было выявлено, что при низкой температуре (4°C) и после инкубации не более 6 часов происходила наименьшая адсорбция и потеря ВН. Если сравнивать температуру хранения 4°C и 20°C после 24 часов инкубации, разницы в количестве адсорбированных ВН к поверхности не наблюдалось. При сравнении ВН клеточных линий, которые использовались в данном проекте, после 6 часов инкубации в полипропиленовых пробирках наблюдалась разница между ВН клеточных линий MCF7, MDA-MB-231, SKOV3 и ВН клеточных линий MCF10A и ВН, выделенные из Плазмы. ВН MCF10A и Плазмы показали наименьшую потерю из-за адсорбции к поверхности полипропилена по сравнению с ВН клеточных линий рака молочной железы и яичника. Предполагается, что эта разница основана на большей поверхностной активности ВН раковых клеток именно с этим полимером, которая может исходить из характерных мембранных белков или других макромолекул ВН. Была также разработана математическая модель адсорбции ВН к твердым телам, используя программу Comsol Multiphysics, и проведено сравнение с результатами, которые были получены экспериментально на основе АТН. Моделирование адсорбции ВН к поверхности твердых тел позволило определить коэффициенты адсорбции, которые варьировали от 4 до 44 [м3/(с·мол)] и зависели от температуры и поверхности материала. Наибольший коэффициент адсорбции показала модель с кремнием (41-44 м3/(с·мол) при 20°С), в то время как наименьшее количество ВН адсорбировалось к полипропилену, покрытому БСА, и стеклу (коэффициент адсорбции 7.5-11 м3/(с мол) при 20°С). При температуре 4°C коэффициент адсорбции ВН к кремнию был в 1.5-2 раза меньше, чем при 20°C. Сравнивая коэффициенты адсорбции ВН к полипропилену была также отмечена разница между клеточными линиями рака (молочной железы - MCF7, MDA-MB-231 и яичника - SKOV3 имели диапазон коэффициента адсорбции 18-25 м3/(с мол) при 20°С и 11-26 м3/(с мол) при 4°С) и контролями (MCF10A и плазма здорового донора имели диапазон коэффициента адсорбции 12-17 м3/(с мол) при 20°С и 10-11 м3/(с мол) при 4°С). Это сново подчеркивает, что поверхностная активность ВН раковых клеток может быть выше в присутствии определенных поверхностей, что может также влиять на их активность в биологических системах. Полученные данные модели соответствовали экспериментальным данным АТН c относительно высокими коэффициентами детерминации, что позволяет сделать вывод, что разработанная модель с высокой точностью описывает процесс адсорбции ВН к поверхности. Результаты, полученные в этой части проекта позволили определить зависимость поверхностной активности от типа границы раздела, что в будущем позволит найти оптимальную составляющую поверхности для выделения и квантификации максимального количества ВН, принадлежащих к нужной субпопуляции, с высокой специфичностью.