Аннотация результатов, полученных в 2020 году
При реализации исследований в первый год продления проекта проведена оптимизация методики трансдермальной доставки антимикотика, иммобилизованного в ватеритную (CaCO3) матрицу-носитель. А именно, осуществлен подбор растворителя для приготовления суспензии контейнеров с антимикотиком, применение которого позволяет снизить раздражающее воздействие на поврежденную поверхность кожи и, таким образом, усилить эффект от применения разработанного подхода. Исследование выполнено на лабораторных крысах in vivo. Отбор растворителя для приготовления топической суспензии полученных частиц осуществлялся из ряда применяемых для создания дерматологических композиций (ланолин и смеси глицерин/этанол и пропиленгликоль/этанол) на базе результатов in vivo мониторинга состояния волосяных фолликулов методом оптической когерентной томографии (ОКТ) при нанесении суспензии частиц на кожу белой лабораторной крысы с последующим их трансдермальным внедрением при помощи терапевтического ультразвука (УЗ). Необходимым требованием к растворителю, помимо смягчения кожного покрова, являлась возможность достижения глубокого и обильного заполнения волосяных фолликулов при его использовании. Оптимальной дисперсионной средой для приготовления топической формы иммобилизованного в частицы ватерита антимикотика гризеофульвина (Gf) в результате была признана смесь пропиленгликоль/этанол (3:1), поскольку ее применение обеспечило обильное заполнение фолликулов контейнерами на всю глубину. Верификация доставки частиц в фолликулы была проведена путем экстракции волос из области внедрения с последующим разрушением их волосяных мешочков при помощи пинцета и исследованием методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Изучен терапевтический эффект от применения оптимизированной методики трансдермальной доставки антимикотика в ватеритной матрице с использованием смеси пропиленгликоль/этанол на морских свинках с моделью трихофитии, обусловленной Trichophyton mentagrophytes. Эффект от применения ватеритных контейнеров с Gf (группа 2) был изучен в сравнении с лечением при помощи растворов Gf (группа 3) и изоконазола (группа 4) в смеси пропиленгликоль/этанол, а также с контролем без лечения (группа 1). Трансдермальная доставка контейнеров и раствора Gf в группах 2 и 3 осуществлялась при помощи терапевтического УЗ один раз в три дня в течение 16 дней (6 процедур). Нанесение раствора изоконазола на кожу свинок в группе 4 выполнялось по классической схеме: без УЗ-воздействия, путем однократной ежедневной аппликации в течение 16 дней (16 процедур). Установлено, что применение разработанной нами топической формы Gf на основе частиц CaCO3, привело к наиболее быстрому и эффективному излечению животных. Для животных этой группы уже после трех процедур лечения (10-й день терапии) отмечалось существенное улучшение клинической картины, выражающееся в уменьшении показателей эритемы и площади корковых образований в очаге поражения. В то время, как в группах 3 и 4 к таким показателям удалось прийти только после двух недель лечения. Кроме того, только в группе 2 по завершении курса лечения отмечалось полное снижение показателей проявления инфекционного процесса, а также отсутствие роста микромицета при посеве патологического материала на питательную среду для всех животных группы, что свидетельствовало об их излечении. Таким образом, при том, что лечение животных с применением ватеритных контейнеров, нагруженных Gf, осуществлялось почти втрое реже, чем лечение препаратом сравнения, удалось добиться максимально выраженного терапевтического эффекта и полного излечения животных за этот период. Полученные результаты обладают особой ценностью в связи с тем, что для Gf на сегодняшний день не существует коммерчески доступной топической формы. Проведена оптимизация протокола оценки захвата ватеритных контейнеров, содержащих антимикотик, клетками дермальных фибробластов L929 и макрофагов RAW-264.7 in vitro методом визуализирующей проточной цитометрии (ВПЦ). А именно, осуществлена апробация флуоресцентного красителя перидинин-хлорофилл-протеина (PerCP) для мечения контейнеров с Gf. Иммобилизация PerCP в СaCO3 контейнеры, содержащие Gf, проводилась путем адсорбции на их поверхность. Использование данного красителя (675/488nm) для окраски контейнеров позволило осуществлять одновременную прокраску клеток витальным красителем Calcein AM (495/515 нм) для визуализации методом ВПЦ с помощью цитометра, оснащенного лазером с длиной волны 488 нм, и разводить флуоресценцию жизнеспособных клеток и захваченными ими частиц по разным каналам регистрации эмиссии: канал №2 (480-560 нм) и канал №5 (640-745 нм). В результате данного исследования были получены данные о количестве частиц, захваченных клетками L929 и RAW-264.7. Оценка захвата контейнеров, проведенная параллельно методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ), подтвердила полученные данные, что свидетельствовало о возможности применения оптимизированного протокола с использованием красителя PerCP для быстрого анализа интернализации CaCO3 контейнеров c антимикотиком методом ВПЦ. Проведено расширенное in vivo исследование с помощью растровой сканирующей оптоакустической мезоскопии (РСОМ) проникновения и скорости выведения флуоресцентного красителя (Fd) из кожи мышей при его трансдермальном внедрении в свободном виде и после иммобилизации в частицы ватерита, в том числе при их покрытии полиэлектролитной оболочкой или при наличии УЗ пост-воздействия на область внедрения. Исследование было выполнено на мышах линии BALB/c in vivo. Установлено, что внедрение Fd в свободном виде приводило к мгновенному нарастанию оптоакустического сигнала (ОС) в капиллярах и мелких сосудах, благодаря проникновению в них флуоресцентных молекул Fd под действием УЗ, использованного для внедрения. Через сутки сигнал от Fd в коже практически полностью спадал, что свидетельствовало о его быстрой элиминации. При применении частиц CaCO3 c Fd интенсификация сигнала наблюдалась в промежуток времени от 4 до 24 часов после внедрения, УЗ пост-воздействие на область внедрения таких контейнеров привело к увеличению уровня ОС в период 0.5-24 часа после внедрения. Замедление процесса высвобождения Fd из контейнеров при их модификации оболочкой привело к формированию более устойчивого во времени ОС, детектируемого от сосудов кожи мышей. Продемонстрирована корреляция между изменениями ОС на РСОМ-изображениях кожи мышей и состоянием ватеритных контейнеров внутри фолликулов на СЭМ-изображениях мешочков волос, экстрагированных в разные промежутки времени после их внедрения. С целью расширения области применения разработанной системы трансдермальной доставки лекарств по ряду новых перспективных направлений, проведены работы по изучению депо-системы для чрезкожной вакцинации на ее основе, а также возможности создания внутрикожных сенсоров. Проведено расширенное исследование эффективности трансдермальной иммунизации мышей с использованием ватеритных контейнеров, нагруженных гриппозной вакциной Флю-М, в сравнении с трансдермальной и внутримышечной иммунизациями с использованием свободной вакцины. Исследование выполнено на мышах линии BALB/c in vivo. Контроль иммобилизации вакцины в частицы осуществлялся путем измерения ξ-потенциала полученных контейнеров. Показано, что электрокинетический потенциал контейнеров до загрузки вакцины составлял +8.3 ± 3.8 mV, после загрузки вакцины он составил -16.5 ± 3.8 mV, что свидетельствовало об успешности ее включения в частицы, поскольку ξ-потенциал исходного раствора вакцины Флю-М соответствовал -14.4 ± 7.0 mV. Количественная оценка содержания вакцины в контейнерах осуществлялась путем калориметрического исследования супернатантов от синтеза по методу Брэдфорда. По результатам данного исследования была определена доза для внедрения контейнеров (эквивалентная 1 дозе свободной вакцины). Иммунизация мышей проводилась двукратно с интервалом 2 недели. Успешность внедрения CaCO3 контейнеров, содержащих Флю-М, в волосяные фолликулы мышей была продемонстрирована с помощью ОКТ. При исследовании сывороток крови иммунизированных мышей по реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и методом иммуноферментного анализа (ИФА) установлено, что внутримышечная и трансдермальная иммунизация вакциной Флю М привели к формированию антител к штаммам вируса гриппа подтипа A/(H1N1) и A/(H3N2). Наибольшие значения средней геометрической титра (СГТ) IgG и подклассов IgG были получены в контрольной группе мышей, иммунизация которым проводилась по классической схеме (внутримышечно). Однако, трансдермальная иммунизация животных с применением ватеритных контейнеров, нагруженных вакциной Флю-М, также вызвала выраженный иммунный ответ, поскольку уровень антител к H1N1-вирусу через 14 дней после второй иммунизации в 2.8 раз превосходил СГТ в группе интактных мышей и в 1.4 СГТ в группе животных с трансдермальной иммунизацией свободной вакциной. Уровень антител к H3N2-вирусу по РТГА в 11 раз превосходил уровни антител у интактных животных. При исследовании подклассов IgG установлено, что трансдермальная иммунизация с применением разработанного протокола обеспечивает формирование более высокого уровня IgG2а антител, чем классическая внутримышечная иммунизация. Выработка высокого уровня IgG2a антител свидетельствует о запуске иммунного ответа Th1-типа (клеточного) и обеспечивает более длительную противовирусную защиту, чем IgG1 антитела. В связи с этим, ожидается, что применение такого подхода позволит добиться пролонгации защитного действия применяемой вакцины. С учетом неинвазивности предлагаемого протокола, полученные результаты представляют большой интерес и создают предпосылки для усовершенствования подходов к сезонной вакцинации от гриппа. Осуществлена апробация методики трансдермального внедрения мезопористых частиц для создания внутрикожных сенсоров. А именно, проведено исследование возможности внедрения субмикронных контейнеров-платформ для гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) в волосяные фолликулы мыши in vivo, согласно разработанному протоколу трансдермальной доставки, с целью формирования внутрикожной (интрафолликулярной) депо-системы. Исследование выполнено in vivo на мышах линии BALB/c. В качестве ГКР-платформ были использованы структуры ядро-оболочка на основе микрочастиц диоксида кремния, модифицированных наночастицами золота и углеродными нанотрубками. В ходе мультимодального исследования с применением методов ОКТ, СЭМ и спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) была продемонстрирована успешность применения разработанного протокола трансдермальной доставки для их внедрения в волосяные фолликулы. Было показано, что данные структуры сохраняли целостность в волосяных фолликулах в течение 24 часов, обеспечивая возможность детектирования интенсивного КР-сигнала в течение этого периода. Хотя через 48 часов начиналось выведение сенсоров из волосяных фолликулов, их присутствие в сальной железе сохранялось в течение 192 часов после интрадермального внедрения, обеспечивая возможность формирования внутрикожной депо-системы. Результаты, полученные в ходе выполнения работ по проекту, опубликованы в виде 3 научных статей в журналах [Gusliakova O. et al. Mater. Sci. Eng. C. 2021, 119, 111428], [Lengert E.V. et al. Skin Pharmacol Physiol. 2020, 33, 261–269] и [Svenskaya Yu. I. et al. Izvestiya of Saratov University. New series. Series: Physics. 2021, 21(1), 80-85], индексируемых базами WOS и Scopus, из которых 2 относятся в первому квартилю (Q1). А также представлены на конференциях Saratov Fall Meeting (SFM-2020), UK-Poland Conference on Bioinspired Materials и Всероссийский конгресс по медицинской микробиологии, эпидемиологии, клинической микологии и иммунологии (XXIII Кашкинские чтения) в 1 устном и 4 постерных on-line докладах.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Получены данные о токсичности ватеритных (CaCO3) контейнеров, содержащих антимикотик гризеофульвин (Gf), по отношению к клеткам дермальных фибробластов мыши (L929) при приложении ультразвукового (УЗ) воздействия низкой интенсивности (1 МГц, 0.5 Вт/см2). Длительная предварительная инкубация клеток с контейнерами (24 ч), добавляемыми в количестве 5, 10 и 50 штук на клетку, обеспечила интернализацию большого количества (>50%) добавленных частиц. Токсический эффект от дальнейшего УЗ-воздействия на клетки, захватившие частицы, был исследован методом визуализирующей проточной цитометрии (ВПЦ). Показано, что такое воздействие привело к небольшому снижению выживаемости клеток в группах с концентрацией 50 частиц/клетку и эквивалентной концентрацией свободного Gf. Однако, выживаемость клеток во всех экспериментальных группах при этом была выше 70%, что указывает на отсутствие выраженного цитотоксического эффекта. Проведена оценка токсического действия CaCO3-контейнеров на клетки L929 при применении УЗ с параметрами, используемыми для внедрения частиц (1 МГц, 0.5 Вт/см2), и дополненного УЗ пост-воздействием (1 МГц, 1 Вт/см2). Оценку осуществляли методом ВПЦ. Установлено, что дополнительное УЗ пост-воздействие не оказывает влияния на выживаемость клеток. Отмечались незначительные колебания выживаемости при совместном применении контейнеров и УЗ-воздействия в целом (по сравнению с группой без воздействий), однако даже при максимальной концентрации частиц, отличия показателей выживаемости от контроля не являлись статистически значимыми. Выживаемость клеток во всех экспериментальных группах вновь была выше 70%. Проведена оценка концентрации препарата, доставляемого в кожу с помощью ватеритных контейнеров. С этой целью, по завершении процедуры внедрения (CaCO3+Gf) контейнеров лабораторным крысам, с помощью отрывов липкой лентой был проведен сбор Gf с поверхности кожи для последующего спектрофотометрического исследования. Чтобы оценить вклад CaCO3-носителей в транспортировку антимикотика в придатки кожи, осуществляли также внедрение спиртовой суспензии Gf. Установлено, что при применении свободного Gf 36±5% наносимого препарата осталось не внедренным и было собрано липкой лентой с поверхности кожи. Использование (CaCO3+Gf)-формы позволило снизить этот процент до 5±1%. Это указывает на важность использования ватеритных носителей для повышения топической биодоступности Gf. Методом гомогенизации биоптата определена концентрация флуоресцентного красителя цианина 7 (Cy7) в более глубоких слоях кожи при его доставке с помощью частиц CaCO3. Поcле внедрения контейнеров CaCO3+Cy7 мышам избыток суспензии смывали с кожи. Затем с помощью отрывов липкой лентой удаляли роговой слой, чтобы исключить влияние красителя в поверхностном слое и волосяных воронках. Наличие выраженного пика флуоресценции Cy7 в гомогенатах, полученных после внедрения контейнеров, при одновременном отсутствии данного пика в контрольных образцах, свидетельствовало о его успешной интрадермальной доставке. Установлено, что доза непосредственно внедренного в кожу Cy7 составила 2.0±0.5 мкг/см2. Получены данные о кинетике экскреции Gf из организма белой лабораторной крысы с мочой при его трансдермальном внедрении в свободной форме и в виде (CaCO3+Gf) контейнеров. Анализ профилей выведения свободного Gf не выявил статистически значимых изменений уровня флуоресценции мочи в течение всего периода наблюдений (216 часов). Применение (CaCO3+Gf)-контейнеров привело к появлению статистически значимого пика экскреции Gf через 24 часа после внедрения. Таким образом, применение ватеритных контейнеров для доставки Gf в кожу обеспечило более выраженный системный захват препарата вследствие доставки к более глубоким областям волосяных фолликулов, испещренным кровеносными сосудами. Далее, начиная с 48 часов статистически значимых изменений уровня флуоресценции мочи в этой группе не было обнаружено. Проведено иммуногистохимическое исследование образцов кожи с целью оценки эффектов, возникающих в ответ на внедрение CaCO3-контейнеров. О наличии негативных эффектов в рамках данного исследования судили по увеличению числа волос в фазе катагена. В качестве маркера выступало появление апоптотических клеток в волосяном корне, корневом влагалище и луковице. С этой целью был проведен TUNEL анализ гистологических срезов биоптата кожи мыши. Показано, что применение CaCO3 контейнеров в сочетании с разработанным протоколом их доставки в волосяные фолликулы не приводит к росту числа апоптотических клеток и увеличению доли волос, перешедших в фазу катагена, ни сразу после внедрения частиц, ни через 14 дней. Доля волос в фазе анагена превышала 85% во всех исследуемых группах, что говорит об отсутствии выраженного негативного влияния контейнеров на волосы. Проведено исследование расширенной острой токсичности разработанной платформы для интра- и трансдермальной доставки лекарств с целью подтверждения безопасности ее применения при однократном нанесении на кожу. Работы были выполнены на базе лаборатории биологических испытаний ФИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, аккредитованной в соответствии с принципами GLP. Данное исследование было направлено на выявление возможных побочных эффектов при нанесении тестируемого объекта в трех концентрациях, сопровождаемом УЗ-воздействием на область нанесения, в остром периоде (в течение 24 ч после введения), а также спустя две недели после нанесения для выявления отсроченных токсических признаков в периоде восстановления. По результатам данного токсикологического исследования был сделан вывод об отсутствии неблагоприятных эффектов, связанных с однократным применением разработанной платформы, даже в максимально возможной для внедрения дозе – 100 мг/жив (10% от площади поверхности тела крыс). Сверх плана в ходе выполнения работ было проведено сравнительное исследование эффективности трансдермальной иммунизации с использованием гриппозной вакцины FluM в свободной форме и в виде (CaCO3+FluM)-контейнеров. Целью исследования было отделить вклад УЗ-воздействия, применяемого для внедрения ватеритных контейнеров в волосяные фолликулы и также играющего роль усилителя чрезкожного проникновения веществ, от вклада самих контейнеров. Исследование проводилось на базе НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева. Оценку формирования иммунного ответа при внедрении (CaCO3+FluM)-контейнеров проводили в сравнении с группами мышей с внутримышечной (IMI) и трансдермальной (TCI) иммунизациями с использованием свободной вакцины. Контроль внедрения контейнеров в волосяные фолликулы осуществляли с помощью ОКТ. Оценка эффективности транспортировки вакцины с помощью CaCO3-контейнеров в кожу была проведена методом отрывов липкой лентой. Анализ титров антител, выработанных в результате введения разных форм вакцины, позволил сделать вывод о том, что поверхностное применение раствора FluM вызвало самый низкий иммунный ответ среди экспериментальных групп, даже несмотря на то, что ее внедрение было усилено сонофорезом. Уровень антител в большинстве случаев был значительно ниже, чем в IMI-группе. Кроме того, статистически значимая разница была зарегистрирована для вирус-специфичных IgG2a, выработанных в организме мышей в ответ на TCI-введение свободной и иммобилизованной в частицы ватерита вакцины. Данный факт свидетельствует о важности применения вакцины в ватеритных контейнерах. Полученные результаты опубликованы в виде 3 научных статей в журналах Biomaterials Science (Q1, IF 6.843), Advanced drug delivery reviews (Q1, IF 15.47) и Reviews on Clinical Pharmacology and Drug Therapy, индексируемыми RSCI, из которых 2 индексируются базами WOS и Scopus и относятся к первому квартилю. Результаты работ также были представлены на конференциях Saratov Fall Meeting (SFM-2021), UK-Russia Conference Advanced biomaterials, Vth Sechenov International Biomedical Summit (SIBS 2021) и Всероссийский конгресс по медицинской микробиологии, эпидемиологии, клинической микологии и иммунологии (XXIV Кашкинские чтения) в 4 устных и 2 постерных докладах.