Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проведено сравнительное исследование электрохимических характеристик акридиновых и феназиновых красителей при их включении в суспензии углеродных наноматериалов и нанесении на стеклоуглеродный электрод. В качестве основного носителя использовали углеродную чернь, которую диспергировали с помощью ультразвуковой обработки в присутствии различных стабилизаторов и пленкообразователей – хитозана и диметилформамида (ДМФА). Аликвоту суспензии далее наносили на электрод, высушивали и регистрировали вольтамперограммы красителей. В некоторых случаях использовали дополнительные процедуры закрепления слоя углеродной черни на электроде, например, обработку слоя с включением хитозана раствором щелочи для нейтрализации кислоты и перевода хитозана из солевой (растворимой) в нейтральную форму. Введение молекул ДНК в состав слоя осуществляли путем ее физической адсорбции поверх слоя электроактивного компонента или путем ее введения в суспензию углеродного носителя и красителя. 1. Система Акридиновый желтый - углеродная чернь – ДМФА (хитозан). Проведено сравнение результатов стабилизации суспензии путем введения хитозана и диспергирования суспензии в ДМФА. Второй способ продемонстрировал лучшую воспроизводимость электрохимических параметров покрытия. Установлена зависимость тока пика окисления красителя в зависимости от состава суспензии и рН. Замена хитозана на ДМФА кратно увеличивала ток пика окисления в связи с влиянием растворителя на распределение красителя между агрегатами и частицами углеродной черни. Дополнительная обработка уже сформированного поверхностного слоя новой порцией ДМФА увеличивала регистрируемый сигнал сенсора. Аналогичный эксперимент с обработкой органическим растворителем поверхностного слоя красителя в хитозане дал противоположный результат: при обработке ДМФА сигнал снижался в 7 раз, при обработке этанолом - в 3 раза, хлороформом - на 20%. Влияние ДНК на пики на вольтамперограммах увеличивалось с ростом ее концентрации до 2 мг/мл. Включение ДНК в состав слоя было независимо подтверждено с помощью сканирующей электронной микроскопии. Определена природа лимитирующей стадии и стехиометрия переноса электрона и ионов водорода в слое акридинового желтого в присутствии и в отсутствие ДНК. Впервые установлено появление новой обратимой пары пиков при регистрации нескольких последовательных циклов сканирования потенциала при +0.17 - +0.29 В. Многократное циклирование потенциала сохраняло высоту и форму пиков, что исключало возможность десорбции или олигомеризации форм красителя, участвующих в электронном обмене в условиях эксперимента. Установлены количественные характеристики пиков при изменении абсолютной концентрации акридинового желтого и соотношения объемов суспензии и раствора акридинового желтого в аликвоте, наносимой на электрод. Наибольшее значение токов обратимой пары пиков регистрировали при пост-обработке модифицированного ДНК электрода ДМФА. Проведено предварительное тестирование ДНК-сенсора на основе акридинового желтого при регистрации различных повреждений ДНК. Термическая денатурация ДНК вызывала увеличение тока пика окисления при 1.1 В при рН 3.0 и его снижение при рН 5.0. Окислительное повреждение ДНК пероксидом водорода, реактивом Фентона, смесью сульфата меди и пероксида водорода вызывало аналогичное изменение пиков красителя. Проведено сравнение токов пика акридинового желтого на вольтамперограммах в присутствии полиэлектролитов вместо ДНК (полистиролсульфонат, полиэтиленимин и ПЭГ) и выявлено влияние указанных добавок на стабильность молекулярных агрегатов акридинового желтого и их электрохимическую активность до и после введения ДНК в состав слоя. Катионные добавки на вольтамперные характеристики акридинового желтого значимо не влияли, влияние ДНК при ее введении одновременно с полиэтиленимином и ПЭГ снижалось. Аналогичные измерения проводили с модельным интеркалятором - доксорубицином. Инкубирование ДНК в растворе препарата приводило к увеличению сигнала в области кислых рН и его снижению - при нейтральных значениях. 2. Система Азур А – углеродная чернь – хитозан. Электрополимеризацию проводили после нанесения суспензии на электрод в отсутствие диффузионно свободного красителя. На вольтамперограмме наблюдали две пары обратимых пиков, относящихся к мономерной и полимерной формы Азура А, и необратимый пик его окисления при высоком анодном потенциале. Присутствие углеродной черни повысило токи за счет увеличения эффективной поверхности электрода, стабилизировало покрытие при хранении и многократных измерениях. Определена природа и стехиометрия лимитирующих стадий процесса. Для мономера процесс имел квазидиффузионный характер с переносом равного числа электронов и ионов водорода, для полимера - смешанный сорбционно-диффузионный характер с переносом двух электронов и одного иона водорода. Рассчитаны коэффициенты переноса электрона. Введение ДНК путем инкубирования сенсора в растворе ДНК или его высушивания на электроде увеличивало токи пика мономерной формы красителя (до 2.5 раз) и снижало токи пика поли(Азура А). Влияние полистиролсульфоната было подобно влиянию ДНК, что говорит о том, что изменение активности форм Азура А связано с электростатическими взаимодействиями, но не интеркалированием ДНК молекулами красителя. Для контроля работоспособности ДНК-сенсоров были получены предварительные результаты по определению модельного интеркалятора - доксорубицина. Его непосредственное влияние на сигналы Азура А было невелико, поэтому был использован прием конкурентного взаимодействия с молекулами ДНК доксорубицина и Метиленового синего. Высота пиков последнего снижалась при инкубировании ДНК-сенсора в растворе доксорубицина в интервале от 0.1 пМ до 0.1 мкМ. Это связано с тем, что доксорубицин вытесняет Метиленовый синий из аддукта с ДНК, последний удаляется с поверхности электрода. В дальнейшем планируется использовать данный подход для определения доксорубицина в биологических жидкостях и лекарственных формах и оценить возможное негативное компонентов пробы на сигнал биосенсора. 3. Система поли(Азур А) – хлороформ. Рассмотрено влияние хлороформа на процесс электрополимеризации Азура А и возможность одновременного включения ДНК в состав образующейся пленки. Рабочий фосфатный буферный раствор насыщали хлороформом и далее использовали для растворения Азура А до его концентрации 0.2 мг/мл и ДНК. Присутствие хлороформа несколько снижало абсолютные токи пика, но улучшало разделение сигналов мономера и полимера Азура А. Эффективность полимеризации и включения в растущую пленку ДНК нашли подтверждение с помощью электрохимического варианта пьезокварцевого микровзвешивания. Присутствие хлороформа увеличивало массу покрытия независимо от присутствия в реакционной смеси ДНК, влияние последней было отрицательным и проявлялось в основном при большом числе циклов сканирования потенциала. Также свидетельства изменения состава и морфологии покрытия электрода при введении в систему хлороформа и ДНК были получены методами сканирующей электронной и атомно-силовой микроскопии. 4. Система поли(Азур Б) – вода (хлороформ). Отличаясь от Азура А одной метильной группой, Азур Б существенно хуже растворим в воде и в силу этого приводит к искажению вольтамперограмм. Водный раствор насыщали хлороформом перед проведением электрохимических измерений. Поскольку растворимость в воде органического растворителя зависела от ионной силы раствора, вместо фосфатного буфера, традиционно применяемого для таких экспериментов, использовали HEPES. Электрополимеризацию проводили аналогично описанному выше процессу с участием Азура А – путем многократного сканирования потенциала. Пики, относящиеся к продуктам полимеризации и исходному мономеру красителя, в присутствии хлороформа были меньше по высоте, но лучше выражены. При переносе модифицированного электрода в раствор HEPES, не содержащий мономера Азура Б, на вольтамперограммах наблюдались две пары сглаженных пиков, отнесенных к полимерной и мономерной форме красителя. Определены рН-области устойчивости сигналов и стехиометрия электродной реакции. Образование продуктов электрополимеризации Азура Б в присутствии хлороформа также изучали с помощью пьезокварцевого микровзвешивания. Масса осаждающегося продукта была больше при проведении электросинтеза в присутствии хлороформа. Модифицированные поли(Азуром Б) электроды были использованы как преобразователи сигнала ДНК-сенсоров. ДНК наносили, инкубируя сенсор в растворе ДНК определенной концентрации. Проведена оптимизация условий нанесения ДНК по количеству вносимого биополимера и продолжительности инкубирования. В качестве модельного анализа – интеркалятора ДНК – использовали идарубицин, вносимый в раствор совместно с Метиленовым синим. Зависимость относительного изменения тока пика Метиленового синего от логарифма концентрации идарубицина линеаризуется в интервале от 1 фМ до 0.1 нМ. В дальнейшем планируется продолжить оптимизацию состава поверхностного слоя ДНК-сенсора и протокола измерения сигнала, включая проведение анализа реальных объектов и учет влияния компонентов матрицы. 5. Система углеродное нановолокно – тионин. Нами были исследованы прессованные углеродные нановолокна, изготовленные из многостенных углеродных нанотрубок. Печатный графитовый электрод сначала обрабатывали углеродсодержащей термоотверждаемой пастой, к которой приклеивали спрессованный слой углеродных нановолокон. С использованием уравнения Рэндлса-Шевчика установлена эффективная площадь поверхности электрода, превышавшая геометрическую площадь в 5.6 раз. Электроды, модифицированные углеродными нановолокнами, были опробованы в реакции электрополимеризации тионина. Предварительное накопление мономера в пленку углеродных нановолокон показало значительное увеличение регистрируемых токов. В процессе циклирования потенциала происходило появление большого широкого пика при -50 - +250 мВ, отнесенного к политионину. Определена сорбционная природа пиков полимера при сканировании потенциала и высокая обратимость переноса электрона в слое политионина. В дальнейшем планируется расширить перечень соединений, подвергаемых полимеризации в слое углеродных нановолокон, и примененять полученные сенсоры как преобразователи сигнала ДНК-сенсоров для определения лекарственных препаратов противоракового действия. 6. Другие рассмотренные системы. Установлены условия получения устойчивых дисперсий оксида графена и других углеродных наноматериалов: многостенных углеродных нанотрубок, углеродной черни. Показано, что применение органических растворителей влияет на эффективную поверхность модифицированных ими электродов и устойчивость дисперсий в растворе при хранении. Определены условия катодного восстановления оксида графена и последующего определения окисляющихся органических соединений. Проведен скрининг полученных материалов по соотношению масс компонентов дисперсий, присутствию в них наночастиц металлов и их оксидов, а также органических соединений кобальта как потенциальных медиаторов электронного переноса. Получены предварительные эксперименты по электрохимической полимеризации в таких системах нейтрального красного, метиленового синего, тионина. Охарактеризованы условия измерения обратимого редокс-сигнала подобных материалов. Тем самым получены предварительные данные по последующей сборке ДНК-сенсоров на основе гибридных материалов с включением электрополимеризованных красителей и углеродных материалов. Показано, что использование ДМФА, этанола и хлороформа позволяют добиться требуемой стабильности дисперсий без дополнительного введения в их состав поверхностно-активных веществ и полиэлектролитов. Определены последовательность модификации электродов компонентами указанных композитов и возможность проведения электрополимеризации сорбированных в поверхностном слое мономерных форм вышеприведенных красителей. Проведен обзор существующих подходов к получению и применению в составе биосенсоров металлокаркасных супрамолекулярных структур, определены условия синтеза и включения металлокаркасных полимеров в состав ДНК-сенсоров. Определены возможные пути применения указанных материалов в рамках выполнения настоящего проекта. Обобщение полученной информации опубликовано в виде обзора.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Изучено влияние природы углеродного наноматериала на полимеризацию Азура А из адсорбированного состояния. Предложен протокол модификации электрода, включающий нанесение суспензии углеродного компонента и мономерной формы красителя с последующей электрополимеризацией в растворе, мономера не содержащем. Повышена эффективность полимеризации по сравнению с традиционным способом, где процесс был ограничен низкой растворимостью мономера в воде. Циклическая вольтамперометрия показала присутствие обратимой пары пиков, отвечающей обратимым редокс-переходам фенотиазинового ядра молекулы. Высота токов пика отвечала количеству адсорбированного красителя и была выше для углеродной черни по сравнению с углеродными нанотрубками. В случае углеродной черни при непрерывном сканировании потенциала высоты пиков снижались в силу заполнения пространства между частицами продуктами полимеризации. Для функционализированных карбоксильными группами углеродных нанотрубок пики красителя с числом циклов росли и смещались в сторону большей разности потенциалов пиков. После стабилизации покрытия более высокую активность демонстрировали композиты на основе углеродных нанотрубок. Проведено отнесение вольтамперометрических сигналов к продуктам полимеризации и мономеру, захваченному в слой полимера. Присутствие карбоксилатных групп носителя электростатически удерживало окисленные (катионные) формы красителя и приводило к более высокому току их окисления-восстановления. Замена углеродной черни на углеродные нанотрубки увеличивала рН-чувствительность тока пика мономера и не влияла на сигналы полимерного красителя. Зависимость токов пика от скорости сканирования потенциала для покрытий на основе углеродной черни показала формальный диффузионный контроль для окисления мономерной формы, включение химической лимитирующей стадии в механизм переноса электрона для восстановления мономера и смешанный сорбционно-диффузионный контроль для полимерных форм красителя. Замена углеродной черни на углеродные нанотрубки привела к смешанному сорбционно-диффузионному контролю для всех пиков на вольтамперограммах за исключением окисления полимера, показавшего формально диффузионный контроль реакции. По данным сканирующей электронной микроскопии нанесение смеси углеродной черни и Азура А на электрод приводило к образованию сплошной пленки с равномерно расположенными округлыми агрегатами размера 200-300 нм. Электрополимеризация сопровождалась исчезновением агрегатов в силу их перехода в пленку полимера более регулярного строения. При использовании карбоксилированных углеродных нанотрубок покрытие с Азуром А содержало большое количество пор, размер которых был сопоставим с размером агрегатов красителя. Электрополимеризация частично заполняла поры, а дополнительная стабилизация покрытия путем циклирования потенциала увеличивала их число при сохранении равномерного распределения по пленке покрытия. Полученные покрытия были использованы для адсорбции ДНК из ее водного раствора. Влияние ДНК на характеристики покрытия на основе углеродной черни было незначительным, в случае углеродных нанотрубок изменения были значимыми и зависели от времени инкубирования в растворе ДНК. Полученные ДНК-сенсоры были испытаны в определении интеркалятора ДНК – доксорубицина. Для повышения чувствительности использовали дополнительный медиатор (метиленовый синий), связывающийся с ДНК. Относительное изменение тока пика окисления-восстановления линейно зависело от логарифма концентрации доксорубицина в интервале 0.1 пМ – 100 нМ для покрытия на основе углеродной черни и 0.3 пМ – 0.1 нМ – на основе углеродных нанотрубок. В области низких концентраций ход калибровочной зависимости практически не зависел от природы углеродного наноматериала, при концентрациях выше 0.1 нМ изменение сигнала ДНК-сенсора на основе углеродных нанотрубок прекращалось, а при использовании композита с углеродной чернью – продолжало снижаться. Впервые рассмотрены условия получения полимерных композитных покрытий поли(Азура А) и электрохимически восстановленного оксида графена. Перед электрополимеризацией красителя электрод выдерживали в течение 300 с при 1.2 В для накопления первичных продуктов окисления, инициирующих полимеризацию. Оценена стабильность покрытия в потенциодинамическом режиме получения и при комбинации потенциостатического и динамического режимов. Полученные покрытия были охарактеризованы традиционными методами для выявления природы лимитирующей стадии электродной реакции. По сравнению с аналогичными экспериментами, проведенными с углеродной чернью и функционализированными углеродными нанотрубками, применение восстановленного оксида графена показало следующие преимущества: стабильность модифицирующих покрытий без использования пленкообразующих компонентов, быстрая стабилизация сигналов при многократном сканировании потенциала, большие токи пика полимерной формы. Разработанные ДНК-сенсоры прошли апробацию на искусственных и реальных объектах контроля (раствор Рингера-Локка, бычий сывороточный альбумин, синтетическая урина и образцы урины здоровых доноров). Для акридинового желтого, адсорбированного в слое углеродной черни, альбумин в концентрации от 1 мкМ оказывал незначительное синергетическое действие на сигнал ДНК-сенсора на доксорубицин, вызывая систематическую положительную ошибку его определения. Анализ доксорубицина в лекарственных формах (доксорубицин-ЛАНС и доксорубицин-ТЕВА) показал небольшое мешающее влияние стабилизаторов, присутствующих в препаратов (лактоза и маннит). Сенсор на основе поли(Азура Б), полученного в присутствии хлороформа, использовали совместно с метиленовым синим. Установлена невозможность проведения определения доксорубицина из неразбавленной урины, по-видимому, вследствие адсорбции препарата на субклеточных элементах урины. Количественную оценку проводили для разведения буферным раствором в соотношении 1:1. Степень открытия для 1 пМ препарата (с учетом разбавления растворов) составила 110%. При определении идарубицина в коммерческом препарате Заведос вольтамперометрическая регистрация показала значительное снижение токов относительно стандартных растворов. Мешающее влияние связано с присутствием в препарате лактозы, а высокие концентрации электролитов крови снижали открытие до 67%. При импедиметрической регистрации сигнала степень открытия идарубицина составила 92-97%. Результаты убедительно показали, что измерение электрохимического импеданса более устойчиво к компонентам биологических жидкостей и имеет преимущества перед вольтамперометрией при прямом определении медицинских препаратов – интеркаляторов ДНК – в биологических жидкостях. Аналогичный протокол измерения сигнала был использован в сенсоре на основе поли(Азура А) в слое углеродной черни. Измерение доксорубицина в реальных образцах урины потребовало разведения 1:5. Определение доксорубицина в образцах мочи разных доноров показало сходные результаты и одинаковые значения оптимального разбавления биологических образцов. В оптимизированных для каждой из модельных и реальных систем условиях определения степень открытия была близка к 100 %. При получении того же полимера на функционализированных углеродных нанотрубках альбумин на уровне среднего содержания в крови здорового человека определению доксорубицина не мешал. Рассмотрена возможность дискриминации сигнала ДНК-сенсоров при включении в их состав ДНК, поврежденной в результате термического воздействия или окисления. Повреждение ДНК влияло на сопротивление переноса заряда, степень влияния зависела от морфологии получаемого покрытия. При полимеризации в присутствии хлороформа сопротивление переноса заряда значительно сильнее реагировало на изменение нативной структуры ДНК, вызывало уменьшение предэкспоненциального фактора n, что говорило об увеличении пористости слоя полимер-ДНК. Наблюдения изменений параметров импеданса в перспективе могут быть использованы для независимой оценки степени повреждения ДНК.