Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Разработка органоидоподобных 3D-моделей злокачественных опухолей молочной железы (ЗОМЖ), состоящих из опухолевых, стромальных и иммунных клеток, обеспечивает как этические, так и экономические преимущества для прогнозирования ответа опухоли на лечение (химиотерапию, таргетную и клеточную терапию), устраняя разрыв между 2D культурами и исследованиями in vivo, тем самым сокращая количество животных, умерщвленных в доклинических исследованиях (Langhans, 2018). Опухолевые сфероиды являются широко используемой трехмерной моделью in vitro в доклинических исследованиях терапии злокачественных опухолей молочной железы (ЗОМЖ), воспроизводя важные особенности опухолевой ткани, такие как наличие градиента кислорода и питательных веществ, а также субпопуляции покоящихся клеток (Millard, et. al., 2017). Однако большинство современных моделей in vitro состоят только из одного типа клеток, в то время как для того, чтобы быть физиологически релевантными, модель должна также учитывать сложные клеточные взаимодействия в микроокружении опухоли (Wang, et. al., 2019). Для решения этой проблемы в первый год выполнения проекта были получены гетерогенные 3D-2 модели ЗОМЖ, на основе комбинации опухолевых и стромальных клеток, имитирующих три типа ЗОМЖ (ER+/PR+; HER2+; ER-/PR-/HER2-). В качестве эпителиальных клеток использовали охарактеризованные иммортализованные (MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-231) и персональные (BrC3e, BrCCh2e, BrCCh4e) культуры клеток ЗОМЖ. В качестве моделей стромальных клеток были выбраны персональные культуры фибробластов ЗОМЖ BrC4f и BrC120f, полученные авторами проекта из опухолевых образцов от пациентов с подтвержденным диагнозом ЗОМЖ, и фибробласты, полученные из здоровой ткани молочной железы – BN120f. Подобраны и оптимизированы условия культивирования, которые позволили получить 3D-культуры из опухолевых эпителиальных клеток и гетерогенные 3D-2- культуры, имитирующие три типа ЗОМЖ. Со-культивирование опухолевых и стромальных клеток в подобранных условиях в 3D-2 модели позволяет получать сфероиды с формированием стромальных прослоек среди эпителиальных долек, подобных строению опухолевой ткани ЗОМЖ in vivo. Показано, что персональные культуры клеток молочной железы эффективно образуют сфероиды вне зависимости от представленности рецепторов факторов роста (EGFR/HER2/HER3). Показано, что культуры ЗОМЖ с высокой дольней CD44+ клеток эффективно образуют сфероиды, вне зависимости от представленности CD24 и активности ALDH1. Стимуляция 17β-эстрадиолом и TGF-β опухолево-стромальных сфероидов увеличивает жизнеспособность клеток в 3D-2-модели ЗОМЖ вне зависимости от типа фибробластов в составе сфероида. TGF-β при концентрации 5 нг/мл оказывает позитивное влияние на жизнеспособность клеток опухолево-стромальных сфероидов гормон-независимых иммортализованных культур клеток SK-BR-3 и MDA-MB-231 и персональных культур клеток BrC3e, BrCCh2e и BrCCh4e, что вероятно связано с экспрессией в них HER2 и EGFR и реализацией TGF-β/HER2/EGFR сигналинга. Показано, что 3D-2-модели ЗОМЖ, состоящие из HER2+-клеток и опухоль-ассоцированных фибробластов (ОАФ) проявляют повышение миграционного потенциала при стимуляции 17β-эстрадиолом. Стимулирование миграции согласно литературным данным, может быть связано с тем, что ОАФ за счет паракринной секреции цитокинов и факторов роста осуществляют регуляцию метаболизма между клетками различного гистологического происхождения. Со-культивирование опухолевых клеток в 3D-2 модели ЗОМЖ, имитирующей гормон-зависимый (MCF-7) и трижды негативный (MDA-MB-231) типы, с культурой ОАФ BrC4f повышает миграционный потенциал опухолевых клеток, что согласно литературным данным может быть связано с тем, что ОАФ повышают подвижность опухолевых клеток за счет взаимодействия клеток через сигнальный путь hedgehog (Liu, et.al., 2019). Стимуляция 17β-эстрадиолом повышает инвазивный потенциал клеток гормон-независимой культуры MDA-MB-231 при со-культивировании со стромальными клетками, а TGF-β, наоборот, снижает инвазивный потенциал клеток 3D-2 культур. При со-культивировании опухолевых и стромальных клеток в 3D-2 модели сфероидов гормон-независимой культуры MDA-MB-231 вне зависимости от типа фибробластов и гормон-зависимой культуры MCF-7 с ОАФ BrC4f в сфероидах происходит накопление белков внеклеточного матрикса коллагена 1-го типа и фибронектина. Со-культивирование опухолевых клеток персональных культур BrC3e, BrCCh2e, BrCCh4e и стромальных клеток сопровождается снижением коллагена 1-го типа и повышением фибронектина в составе сфероидов 3D-2-модели ЗОМЖ, что, возможно, связано с тем, что процессы, происходящие при росте 3D-2-сфероидов ЗОМЖ, моделируют формирование внеклеточного матрикса в опухоли. Показано перекрестное влияние опухолевых и здоровых фибробластов на пластичность молекулярного фенотипа опухолевых клеток культур ЗОМЖ. Опухолевые фибробласты при со-культивировании с опухолевыми клетками усиливают агрессивность фенотипа эпителиальных клеток гормон-независимой культуры. Таким образом, выявлены стимулирующие и ингибирующие факторы формирования и роста 3D-2 сфероидов ЗОМЖ. Изучено взаимодействие между опухолевыми клетками и клетками микроокружения опухоли в 3D-2-моделях в ответ на гормональные стимулы, ростовые факторы/цитокины. Полученные результаты, в совокупности с данными литературы позволяют заключить, что 3D-2-модели, состоящие из опухолевых и стромальных клеток являются репрезентативной моделью опухоли in vitro для исследований взаимодействия между опухолевыми и стромальными клетками. В результате выполнения первого этапа проекта получены все необходимые клеточные 3D-2-модели для исследования киллерной активности CAR-NK клеток, несущих CAR к HER2 на следующем этапе проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Перекрестные взаимодействия между опухолевыми клетками и другими клетками, присутствующими в микроокружении опухоли, такими как стромальные и иммунные клетки, сильно влияют на поведение и прогрессирование заболевания (Nyga, et. al., 2016). Понимание механизмов, лежащих в основе взаимодействия между различными по происхождению клетками является необходимым условием для разработки новых стратегий лечения и уменьшения неэффективности терапии в будущем. Создание моделей in vitro с использованием клеточных линий позволяет маркировать отдельные типы клеток. Эти модели могут быть дополнены визуализацией отдельных клеток для отслеживания реакции конкретных клеточных компартментов на заданные стимулы или для оценки динамического взаимодействие между опухолевым, стромальным и иммунным клетками (Rebelo, et. al., 2020). В ходе выполнения проекта были получены линии клеток злокачественных опухолей молочной железы (ЗОМЖ), продуцирующие флуоресцентные белки mKate2 (иммортализованные MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-231 и персональные (BrC3e, BrCCh2e, BrCCh4e), eGFP (опухолевые стромальные BrC4f и BrC120f, здоровые фибробласты BN120f) и линии NK-клеток (BFP), в том числе клетки NK-CAR, несущие CAR к белку HER2 или PSMA для визуализации отдельных клеток при со-культивировании в совместной 3D-3 модели. В совместной 3D-2 модели стромальные клетки могут выступать в роли внутреннего каркаса для формирования внешнего опухолевого эпителиального слоя, способствуя получению более крупных и оформленных гетерогенных клеточных структур, что согласуется с данными из литературы (Yakavets, et. al., 2020; Pal, 2020). Опухоль-ассоциированные фибробласты (ОАФ) - BrC4f, активированные гипоксией усиливают инвазивный и метастатический потенциал клеток при трижды-негативном типе ЗОМЖ (MDA-MB-231) по сравнению с не активированными ОАФ в совместной 3D-2 культуре ЗОМЖ. CAR-NK клеточные системы на основе клеточных линий NK-92, KHYG-1, YTS и YT были детально охарактеризованы доклинически и показана их активность в отношении целого ряда опухолей человека, ксенотранспланированных иммунодефицитным мышам (Waeckerle-Men, et. al., 2017). В данной работы была использована культура NK-клеток человека- YT для конструирование рекомбинантных CAR-NK клеток, несущих CAR к HER2. Однако, клетки Cyto-CAR-YT-HER2 не проявляли специфичность цитотоксической активности клеток по отношению к HER2-положительным опухолевым клеткам в 2D-модели культивирования. В связи с недостаточностью перенаправления цитотоксичности клеток линии YT по отношению к HER2-положительным опухолевым клеткам при помощи CAR такой конструкции и необходимости проведения дополнительной оптимизации последовательности такого рецептора мы приняли решение выбрать другую опухолевую модель. В качестве такой мишени был выбран белок PSMA - простат-специфический мембранный антиген, характерная для большинства видов рака простаты, а уровень экспрессии PSMA коррелирует со степенью тяжести заболевания, в том числе с метастатическими формами. В недавнем исследовании Kasoha с соавторами оценивали экспрессию PSMA у большого числа пациентов с раком молочной железы и показали, что PSMA экспрессируется в высоко агрессивных формах опухолей молочной железы и ее отдаленных метастазах (Kasoha et. al., 2018), что обосновывает потенциальную полезность разработки Cyto-CAR-YT-PSMA в качестве терапевтической мишени. Ранее авторы проекта принимали участие в разработке, дважды модифицированной человеческой NK-клеточной линии YT - клеток Cyto-CAR-YT-Lact, несущих CAR к белку PSMA и экспрессирующих проапоптотический белок лактаптин. Такой CAR значимо перенаправляет цитотоксическую способность клеток линии YT на опухолевые клетки, экспрессирующие PSMA, что было показано ранее (Беловежец и др., 2018; Коваль и др., 2019). Поскольку основная цель проекта состоит в получении гетерогенной 3D-3 модели ЗОМЖ и подборе условий культивирования данной модели, а NK-HER2 являются вспомогательной моделью иммунных клеток, то мы считаем, что замена на модель Cyto-CAR-YT-PSMA с несущим CAR к белку PSMA является обоснованной. Чтобы оценить эффективность цитотоксической активности клеток модифицированных CAR-NK-клеток к PSMA были получены линии эпителиальных клеток ЗОМЖ с гиперэкспрессией PSMA. Показано, что почти все модифицированные линии клеток ЗОМЖ, гиперэкспрессирующих PSMA, были высокочувствительными к клеткам Cyto-CAR-YT-PSMA, несущих CAR к белку PSMA по сравнению с опухолевыми эпителиальными клетками ЗОМЖ без вставки к PSMA и NK-клеткам линии YT дикого типа в 2D-модели культивирования. Эпителиальные опухолевые клетки MDA-MB-231 как с гиперэкспрессией PSMA, так и без, проявляют чувствительность к NK-клеткам линии YT дикого типа и Cyto-CAR-YT-PSMA в 2D-, 3D- и 3D-2-модели ЗОМЖ. Высокая чувствительность клеток MDA-MB-231 к NK-клеткам может быть объяснена тем, что при совместном культивировании секретируется значительное количество IFNγ, который в свою очередь может изменять «иммунопептидом» клеток MDA-MB-231, усиливая презентацию антигена МНС-I и МНС II, что в конечном итоге приводит к высокой чувствительности опухолевых клеток к иммунным (Chen, et. al., 2016; Goncalves, et. al., 2021). Предварительная активация NK-клеток ИЛ-15 (50 нг/мл) незначительно повышала киллерную активность линии YT дикого типа и значительно Cyto-CAR-YT-PSMA по сравнению с не активированными NK-клетками только в 3D-модели из опухолевых клеток BrCCh4e вне зависимости от типа. Опухоль-ассоциированные фибробласты могут способствовать проникновению NK-клеток в опухолево-стромальный сфероид ЗОМЖ, усиливая киллерную активность NK-клеток. ОАФ могут секретировать SDF-1 (De Boeck, et al., 2013), который, в свою очередь является лигандом рецептора CXCR4. Экспрессия этого рецептора в значительной степени характерна как для Т, так и для NK-клеток (Kulemzin, et al., 2021), что может объяснять усиленный таксис NK-клеток именно в сфероиды, образованные на ядре из фибробластов. В результате выполнения второго этапа проекта получилось реализовать сложную трехмерную модель ЗОМЖ (3D-3) из клеток человека, позволяющей исследовать динамического взаимодействие между опухолевым, стромальным и иммунным клетками. Публикации: 1. Опубликована экспериментальная статья: «EGFR Transgene Stimulates Spontaneous Formation of MCF7 Breast Cancer Cells Spheroids with Partly Loss of HER3 Receptor». Int. J. Mol. Sci. (2021). Рейтинг журнала: Q1. IF=5.924. 2. Опубликована обзорная статья: «Опухоль-ассоциированные фибробласты и их роль в опухолевой прогрессии». Вавиловский журнал генетики и селекции (2022 г.). Рейтинг журнала: Q4. IF=1.02. 3. Тезисы конференции: «3D-клеточные модели, гетерогенные 3D-2-модели, опухолевые клетки, стромальные клетки, злокачественные опухоли молочной железы». Успехи молекулярной онкологии, T.8, №4, приложение материалы VI Всероссийской конференции по молекулярной онкологии 21–23 декабря 2021 г., Москва. IF=0.535. 4. Принята к печати: «Клетки рака молочной железы изменяют чувствительность к гормональным и ростовым стимулам при 3D культивировании». Журнал Цитология 2022. Выходные данные: том 64, № 4. УДК 57.085.23: 616-006.66. Рейтинг журнала: Q4. IF=0.734. 5. Публикации в СМИ: 5.1. Наука в Сибири от 18.01.2022. Новая 3D-модель поможет в разработке препаратов для лечения поздней стадии рака груди. Публикация. 5.2. Газета “Поиск” от 17.01.2022. Новая 3D-модель поможет в разработке препаратов для лечения поздней стадии рака груди. Публикация. 5.3. Вести Новосибирск от 25.01.2022. Новосибирские учёные разработали 3D-модель рака молочной железы. Видеорепортаж. 5.4. Новости РНФ от 26. 01. 2022. Новосибирские учёные разработали 3D-модель рака молочной железы (видео). Публикация. 5.5. Новости ОТС от 25.01. 2022. Новосибирские учёные разработали новый способ тестирования препаратов против рака молочной железы. Видеорепортаж.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Иммунотерапия солидных опухолей сталкивается с дополнительными трудностями по сравнению с гематологическими видами рака поэтому сложные трехмерные модели из клеток человека in vitro являются предпочтительными моделями. Сфероиды – это распространенная система культивирования клеток многоклеточной опухолевой модели in vitro для имитации трехмерности опухоли. Новые подходы к получению и культивированию 3D культур делают возможным создавать релевантные физиологические клеточные модели. В ходе выполнения в отчетном периоде работ был произведен сравнительный анализ формирования сфероидов из стромальных клеток рака молочной железы (далее 3Df) с применением простых гидрогелей, таких как агароза, желатин и MatrigelTM, а также при использовании культурального пластика с низкими адгезивными свойствами. Использование гидрогеля на основе 2% агарозы способствовал формированию 3Df наиболее эффективно по сравнению с другими используемыми в работе подходами Подобные 3D-модели только из стромальных клеток способны имитировать фиброзный. очаг в опухоли, что позволяет их рассматривать как модель для исследования противофиброзных препаратов и исследования взаимодействия клеток иммунной системы со стромальным очагом в микроокружении опухоли. Все используемые в эксперименте культуры стромальных клеток BrC4f, BrC120f и BN120f были высоко чувствительными к NK-клеткам линии YT дикого типа и Cyto-CAR-YT-PSMA в 2D-модели и не чувствительны в 3Df-модели. При оценке проникновения и локализации NK-клеток линии YT дикого типа и Cyto-CAR-YT-PSMA в опухолево-стромальных сфероидах NK-клетки локализуются непосредственно рядом с популяцией стромальных клеток, выступающих в роли внутреннего каркаса для внешнего опухолевого слоя, без проявления киллерной через 24 часа совместного культивирования. Balsamo и коллеги в своей работе показали, что NK-клетки обнаруживаются в непосредственной в близости от фибробластов, окружающих метастатическое поражение (по крайней мере, при метастазах в лимфоузлы) (Balsamo, et. al., 2009). Поскольку NK-подобная клеточная линия YT не является IL-2-зависимой и лишена ряда других признаков NK-клеток, например, экспрессии CD16, для дальнейших исследований мы использовали первичные NK-клетки, выделенные из периферической крови (далее PB-NK) с фенотипом CD56+/CD16+, которые активировали для дальнейших экспериментов добавлением 300 ед/мл ИЛ-2 и 7 нг/мл ИЛ-15. Для визуализации PB-NK клеток в 3D-3-модели использовали клетки с флуоресцентной меткой eFluor450. Показан опосредованный PB-NK клетками лизис клеток MCF7, SK-BR-3, MDA-MB-231 в дозо- и времязависимой манере. Наиболее чувствительными опухолевыми клетками к PB-NK была линия MDA-MB-231 и чувствительность клеток изменялась в ряду MDA-MB-231≥MCF7>SK-BR-3 в 2D-модели. Культуры стромальных клеток BrC4f, BrC120f и BN120f были также чувствительными к PB-NK вне зависимости от количества добавленных иммунных клеток в 2D-модели. PB-NK-клетки при высоком соотношении способны атаковать опухолево-стромальные сфероиды (3D-2), выраженное через разрушения структуры сфероида, в первые сутки совместного культивирования. Дополнительное стимулирование TGFβ1 (5 нг/мл) не оказывает ингибирующее действие на киллерную активность PB-NK-клеток и скорее стимулирует их активность в случае 3D-2-модели на основе опухолевых эпителиальных клеток линия MCF7 и SK-BR-3 с опухолевыми (BrC120f) и здоровыми (BN120f) фибробластами, но не с ОАФ (BrC4f). Для сфероидов на основе опухолевых клеток линии MDA-MB-231, TGFβ оказывает ингибирующее действие на киллерную активность PB-NK-клеток как в 3D, так и в 3D-2-модели. Сфероиды, сформированными культурой ОАФ BrC4f, наиболее чувствительны к активированным PB-NK-клеток ИЛ-15 или TGFβ1. Мы предполагаем, что ко-стимуляция NK-клеток с помощью цитокинов IL2, IL15 или TGFβ может представлять собой потенциальную схему для повышения киллерной активности NK-клеток и инфильтрации клеток в опухоль, но требует дальнейшего тщательно анализа. Foltz и др. показали, что активация NK-клеток IL-2 и TGFβ1 приводит к провоспалительному фенотипу и индуцирует гиперсекрецию NK-клетками гамма-интерферона (IFNγ) и фактора некроза опухоли-альфа (TNFα) в ответ на опухолевые мишени (Foltz, et.al., 2018), что может потенциально объяснить отсутствие ингибирования активности PB-NK-клеток. При добавлении PB-NK-клеток к 3D-2 происходит незначительное (2-3%) увеличение популяции CD56bright NK-клеток вне зависимости от типа используемых фибробластов в составе модели по сравнению с 3D-моделью MCF7. При дополнительной стимуляции ИЛ-15 происходит увеличение CD56+- клеток для всех экспериментальных моделей, а при добавлении TGFβ1 наоборот происходит снижение общего количества CD56+- клеток и CD56dim NK-клеток. Дополнительная стимуляция ИЛ-15 и TGFβ1 значительно повышает CD56bright NK-клеток при со-культивировании ОАФ и снижает CD56dim NK-клеток, увеличивая CD56- NK-клетки со здоровыми фибробластами BN120f. Стимуляция TGFβ увеличивает процент CD56- NK-клеток с BrC120f и увеличивает CD56dim NK-клетки с BN120f и BrC4f. Дополнительная стимуляция ИЛ15 или TGFβ1 влияет на активацию CD57, CD62L и KIR PB-NK-клеток и в зависимости от типа стромальных клеток в составе 3D-2 повышает (ОАФ) или понижает ее (опухолевые и здоровые). В совокупности со всеми данными мы предполагаем, что эти изменения характерные для высокой степени дифференцировки также могут быть связаны с развитием пула адаптивных NK-клеток. Фенотип NK-клеток изменяется во время дифференцировки и активации, образуя субпопуляции с различной функциональностью, что также может быть приемлемо для NK-клеток в микроокружении опухоли. Мы обнаружили, что различные фенотипы фибробластов ЗОМЖ оказывают влияние на фенотип и функции NK-клеток. Таким образом, модели, подобные представленной здесь, могут быть чрезвычайно ценными инструментами для разработки новых подходов к иммунотерапии солидных опухолей. Публикации: 1. Принята к печати экспериментальная статья: М.М. Абдурахманова, М.С. Ермаков, В.А. Рихтер, О.А. Коваль, А.А. Нуштаева «Оптимизация подходов формирования гетерогенных трехмерных моделей рака молочной железы» Гены и клетки, 2022, T.17, №4 Q4, IF=0.12 принята к печати. 2. Опубликована экспериментальная статья: Nushtaeva A, Ermakov M, Abdurakhmanova M, Troitskaya O, Belovezhets T, Varlamov M, Gayner T, Richter V, Koval O. "Pulsed Hypoxia" Gradually Reprograms Breast Cancer Fibroblasts into Pro-Tumorigenic Cells via Mesenchymal-Epithelial Transition. Int J Mol Sci. 2023 Jan 27;24(3):2494. DOI: 10.3390/ijms24032494. Q1, IF=6.208 3. Принята к печати экспериментальная статья: Новак Д.Д., Троицкая О.С., Нуштаева А.А., Жильникова М.В., Рихтер В.А. Мещанинова М.И. Коваль О.А. «Подавление EGFR ингибирует сферообразование клеток культуры MCF7 сгиперэкспрессией EGFR». Acta Nature, 2023, T2, IF=0.44 принята к печати. 4. Совместно с Абдурахмановой М.М. проведена онлайн-лекция с викториной для школьников на фестивале «NAUKA 0+, 2022» 18 ноября 2022 г. на тему «Клетки наше все».