КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 20-74-10099

НазваниеМеханизмы действия метилтрансфераз EZH2 и DOT1L – перспективных мишеней для диагностики и терапии онкологических заболеваний

РуководительЕрохин Максим Максимович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2020 - 06.2023  , продлен на 07.2023 - 06.2025. Карточка проекта продления (ссылка)

Конкурс№50 - Конкурс 2020 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика

Ключевые словаEZH2, DOT1L, метилтрансферазы, репрессия транскрипции, активация транскрипции, рак, онкология

Код ГРНТИ34.15.23

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Одной из самых быстроразвивающихся областей знаний в фундаментальных и прикладных биологических исследованиях является регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции. Прогресс в изучении регуляции транскрипции генов на сегодняшний день привел к разработке большого числа принципиально новых терапевтических препаратов и диагностических методов. Дальнейшее развитие молекулярной медицины обещает еще большие перспективы и успехи. В процессах регуляции транскрипции участвует множество белковых факторов, функции которых заключаются в усилении (активаторы) или подавлении (репрессоры) активности генов. Одним из механизмов такой регуляции является ферментативное внесение химических модификаций (эпигенетических меток) в состав белков, в том числе гистонов, формирующих нуклеосомы. Среди модифицирующих гистоны ферментов важную роль занимают метилтрансферазы, активные в отношении лизиновых остатков. Настоящий проект направлен на исследование двух лизин-специфичных метилтрансфераз – EZH2 и DOT1L, которые являются перспективными мишенями в терапии и диагностике онкологических заболеваний. Белок EZH2 относится к репрессорам группы Polycomb, ответственных за подавление транскрипции генов-мишеней. EZH2 обеспечивает моно-, ди- и триметилирование в позиции K27 гистона H3 (H3K27me1/2/3). Белок DOT1L ответственен за метилирование в позиции K79 гистона H3 (H3K79me1/2/3) и ассоциирован с активной транскрипцией генов. При этом факторы EZH2 и DOT1L высоко консервативны в процессе эволюции и имеют прямых гомологов в геномах всех многоклеточных. Это позволяет применять в исследованиях различные модельные организмы, в том числе удобный модельный организм плодовую мушку дрозофилу, на котором были открыты белки группы Polycomb. Многочисленные исследования показали, что нарушение функций EZH2 и DOT1L связано с высокими рисками возникновения социально значимых заболеваний, и прежде всего онкологических. Было показано, что подавление активности данных факторов приводит к ингибированию роста ряда опухолей. Это послужило основой для создания низкомолекулярных ингибиторов, подавляющих метилтрансферазные активности EZH2 и DOT1L, некоторые из которых в настоящий момент проходят клинические испытания. Первый такой препарат – таземетостат – в январе 2020 года получил одобрение для применения в медицинской практике в США. Однако необходимо отметить наличие многих побочных эффектов у таземетостата, как и у многих других ингибиторов эпигенетических факторов. В том числе это связано с тем, что подавление активности вовлеченных в многообразные ядерные процессы метилтрансфераз приводит к тотальному нарушению регуляции транскрипции. Более полное понимание механизмов действия EZH2 и DOT1L приведет к улучшению применяемых для подавления их активности препаратов. Несмотря на большое количество работ, связывающих активность EZH2 с репрессией, а DOT1L – с активацией транскрипции, ряд имеющихся данных указывает на то, что регуляторные пути EZH2 и DOT1L тесно связаны друг с другом. Так, мутации белка dDOT1L в геноме дрозофилы приводят к нарушению Polycomb-зависимой репрессии генов. Осуществленный нами анализ общедоступных баз данных показал, что похожая ситуация наблюдается и в геноме человека. Деплеция гена EZH2, также как и его кофакторов SUZ12 и EED, приводят к изменениям в транскриптомах раковых клеток, очень похожим на изменения при деплеции DOT1L. Аналогично, деплеция DOT1L приводит к изменению транскрипции тех же генов, что и при деплециях EZH2, SUZ12 и EED. Кроме того, в экспериментах по иммунопреципитации ранее было установлено, что белковые партнеры DOT1L соосаждаются вместе с белками группы Polycomb. Однако конкретные регуляторные пути, связывающие активности EZH2 и DOT1L, на сегодняшний день не известны. В ходе выполнения предлагаемого проекта будут исследованы молекулярные механизмы взаимозависимости функций EZH2 и DOT1L. Будут изучены интерактомы данных факторов и профили их полногеномного связывания на примере модельного объекта дрозофилы и в клеточных линиях человека. Одним из возможных объяснений похожих изменений в транскриптомах клеток при мутациях EZH2 и DOT1L является наличие общих негистоновых мишеней метилирования, существование которых недавно было показано для EZH2. Для исследования этого вопроса будет разработан и применен метод комплексной детекции негистоновых мишеней EZH2 и DOT1L. Дополнительной задачей проекта станет исследование интерактома белкового партнера EZH2 – белка HOXB13 – одного из ключевых факторов, необходимых для роста и пролиферации трансформированных клеток при раке простаты. Полученная в ходе выполнения проекта информация будет крайне важна, так как низкомолекулярные ингибиторы EZH2 и DOT1L уже применяются в клинической практике. Мы предполагаем, что ингибирование активности EZH2 также нарушает активность DOT1L, и наоборот. Полученные результаты позволят смоделировать терапевтическую ситуацию, которая происходит в организме пациентов при приеме ингибиторов EZH2 и DOT1L в лекарственных целях и определить целесообразность применения разработанных ингибиторов в каждом конкретном случае.

Ожидаемые результаты
Достигнутый за последние годы прогресс в изучении транскрипционных процессов позволил внедрить ряд новейших разработок в медицинскую практику. В ходе реализации проекта будут изучены механизмы взаимосвязи в активностях двух ключевых эпигенетических факторов, являющихся важными мишенями для онкотерапии, – метилтрансфераз DOT1L и EZH2. На модели дрозофилы будут установлены белковые партнеры фактора dDOT1L и его полногеномная локализация. Будут определены изменения в распределении меток H3K27me3 и H3K79me3 при мутациях генов dDOT1L и EZH2, соответственно. Будут исследованы изменения в связывании белков групп Polycomb/Trithorax на фоне мутации гена dDOT1L. Это позволит определить молекулярные механизмы, которые приводят к нарушению Polycomb-зависимой репрессии при мутации dDOT1L. Полученные на дрозофилиной модели данные будут проверены на клеточных линиях человека. В клеточных линиях человека изменения в распределении модификаций H3K27me3 и H3K79me3 будут, в частности, исследованы с применением низкомолекулярных ингибиторов dDOT1L и EZH2, что будет отражать ситуацию с применением данных ингибиторов в терапевтической практике. На следующем этапе будут определены негистоновые мишени метилтрансфераз DOT1L и EZH2 в протеомах дрозофилы и человека. Это позволит лучше понять механизмы регуляции транскрипции, используемые исследуемыми метилтрансферазами, и наметить пути моделирования низкомолекулярных ингибиторов активностей dDOT1L и EZH2 для создания терапевтических препаратов следующего поколения. Наконец, будет исследован интерактом фактора HOXB13 в клеточных линиях человека, происходящих из образцов рака простаты. Белок HOXB13 необходим для пролиферации клеток рака предстательной железы. Установленные взаимодействия будут подтверждены дополнительными методами, таким как двугибридный анализ и эксперименты pull-down для выявления прямых белковых партнеров HOXB13. Полученные данные в дальнейшем послужат основой для создания специфических ингибиторов активности HOXB13.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Представленный проект направлен на исследование двух лизин-специфичных метилтрансфераз – EZH2 и DOT1L, перспективных мишеней в терапии и диагностике онкологических заболеваний. EZH2 является каталитической субъединицей PRC2 (Polycomb repressive complex 2), опосредующей репрессию транскрипции посредством метилирования лизина 27 по гистону 3 (H3K27me1/2/3). PRC2 комплекс опосредует репрессию за счет рекрутирования на специализированные регуляторные элементы ДНК, называемым Polycomb Response Elements (PRE, элементы ответа Polycomb). Белок DOT1L ответственен за метилирование в позиции K79 гистона H3 (H3K79me1/2/3); было показано, что он связан с активной транскрипцией генов. Мы обнаружили, что мутация гена gpp (кодирует dDOT1L у дрозофилы) приводит к значительному росту модификации H3K27me3, указывая на существование функциональной взаимосвязи между H3K79me/H3K27me модификациями или белками EZH2/ DOT1L. В ходе осуществления проекта на модели дрозофилы было показано, что нарушение активности dDOT1L не приводит к нарушению ассоциации Polycomb-факторов с протестированными PRE-элементами. Были получены поликлональные антитела, специфичные против триметил-лизина (antiKme3). Было продемонстрировано, что полученные антитела эффективно преципитируют триметилированные гистоны (H3K4me3, H3K27me3) из ядерных экстрактов клеток дрозофилы. Методом иммунопреципитации с последующим высокопродуктивным масс-спектрометрическим анализом (LC-MS/MS) проведен предварительный анализ распределения модификации Kme3 на полно-протеомном уровне. Выявлен ряд белков, показывающий значительно более высокий уровень обогащения при иммунопреципитации с антителами Kme3 в сравнении с гибридизацией с контрольными IgG неиммунизированного животного. В частности, обнаружено, что Kme3 преципитат сильно обогащен гистонами (наиболее известные мишени метил-трансфераз), а также белками теплового шока, для которых ранее было продемонстрировано лизин-специфичное метилирование. Таким образом, разработана система для поиска негистоновых мишеней метилирования факторами EZH2 и DOT1L, что является одной из основных целей проекта.

 

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
За отчетный период были получены качественные поликлональные антитела против белка dDOT1L дрозофилы и субъединиц комплекса PRC2 (факторы SUZ12 и EED) человека. Методом иммунопреципитации с последующим высокопродуктивным масс-спектрометрическим анализом с использованием полученных антител против белка SUZ12 был детально проанализирован состав PRC2-комплекса в раковой линии лимфоидного происхождения Raji. В результате были обнаружены ряд новых, не описанных ранее партнеров PRC2-комплекса, в частности, ДНК-связывающий белок GTF2I. Завершены работы, направленные на разработку программы для поиска мутаций в клетках раковых линий, опосредующих высокую чувствительность к ингибированию активности PRC2-комплекса. Вычислительными методами были установлены гены, мутации в которых приводят к гиперчувствительности опухолевых клеток при делеции как гена DOT1L, так и компонентов комплекса PRC2. Проведены эксперименты по изучению механизма регуляции активности PRE-элементов (области посадки репрессорных комплексов PRC1/2 на хроматин) с использованием модельной трансгенной системы основанной на PhiC31-зависимой интеграции трансгенов в геном. Продемонстрировано, что хорошо охарактеризованные (GA)n-связывающие факторы GAF и Psq способны взаимодействовать с PRE только в присутствии расположенных рядом сайтов архитектурных белков Su(Hw), CTCF либо Pita. Полученные результаты демонстрируют, что архитектурные факторы, определяющие трехмерную структуру хроматина в ядре, могут играть важную роль в регуляции активности PRE и в рекрутировании белков PcG, в том числе PRE ДНК-связывающих факторов. Кроме того, используя альтернативную систему интеграции, основанную на CRISPR/Cas9-опосредованной гомологичной репарации, мы продемонстрировали, что сайты связывания Su(Hw) способны индуцировать bxdPRE-зависимую репрессорную активность и индуцировать рекрутирование репрессоров Polycomb независимо от присутствия дополнительных элементов ДНК, остающихся в месте интеграции после PhiC31-зависимой вставки трансгена.

 

Публикации

1. Ерохин М., Четверина О., Джорфи Б., Татарский В., Могила В., Штиль А., Ронинсон И., Моро Д., Георгиев П., Кавалли Д., Четверина Д. Clinical Correlations of Polycomb Repressive Complex 2 in Different Tumor Types Cancers, Номер 13, Том 13, стр. 3155 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/cancers13133155

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Установлено наличие прямого взаимодействия между ДНК-связывающим фактором GTF2I и белком SUZ12, компонентом комплекса PRC2. С помощью полученных поликлональных антител и метода коиммунопреципитации с последующей масс-спектрометрией (IP/LC-MS) были установлены интерактомы белков DOT1L, Zelda и HOXB13. Показано эффективное взаимодействие между белками DOT1L и Zelda. В случае HOXB13 ДНК-связывающий белок TBX3 был идентифицирован как один из главных партнеров. Используя доступные базы данных обнаружено, что TBX3, как и HOXB13, является критически важным для выживания клеток рака простаты. В целом интерактомы обоих белков, Zelda и HOXB13, содержат большое количество ДНК-связывающих факторов. Мы предполагаем, что эти ДНК-связывающие белки могут быть важны для рекрутирования Zelda и HOXB13 на хроматин. В ходе проекта мы показали, что нарушение сайтов связывания PRE ДНК-связывающего белка Crol снижает эффективность привлечения PRC1-комплекса на хроматин. На примере PRE ДНК-связывающего белок Pho, было продемонстрировано, что эффект нарушения его сайтов связывания зависит от размера PRE, а также от правильного геномного окружения. C использованием баз данных проведена идентификация генов (названных нами Супертаргетами, Supertargets), активность которых имеет решающее значение для определенного типа опухоли. Всего было проанализировано 27 различных типов рака, представленных в ресурсе DepMap (6 типов рака крови и 21 тип солидных опухолей), для которых определялось минимальное значение T-статистики. Всего был получен список из 135 генов (5 Супертаргетов для каждого из 27 типов рака). Из них 9 генов повторялись дважды и один трижды. Важно отметить, что для большинства Супертаргетов, выделенных в нашем анализе, ранее была показана роль в соответствующем типе рака, что подтверждает адекватность используемой стратегии. В то же время анализ выявил 29 ранее не опубликованных пар ген-тип рака. GO-анализ показал, что более 40% выявленных Супертаргетов представлены генами, кодирующими ДНК-связывающие транскрипционные факторы. Наличие большого количества ДНК-связывающих факторов среди Супертаргетов подтверждает актуальность разработки химических инструментов (таких как PROTAC), нацеленных на факторы транскрипции для оптимизации лечения опухолей. Разработка селективных инструментов, которые блокируют специфические регуляторы транскрипции, поможет выяснить функциональную роль идентифицированных генов. В свою очередь, эти инструменты послужат прототипами специализированных ингибиторов для персонализированной терапии в будущем.

 

Публикации

1. Браун Л., Прайс Д., Ерохин М., Кассис Д. Context dependent recruitment of Polycomb complexes in the absence of Pho GENETICS, - (год публикации - 2023)

2. Головнина А.А., Четверина Д.А., Ерохин М.М. Амплификация и повышенная экспрессия гена ZNF281 при раке поджелудочной железы коррелируют с негативным прогнозом Вестник КазНУ. Серия биологическая, Том 93 № 4 (2022) (год публикации - 2022) https://doi.org/10.26577/eb.2022.v93.i4.08

3. Ерохин М. М., Горбенко Ф. В., Ломаев Д. В., Четверина Д. А. САЙТЫ СВЯЗЫВАНИЯ АРХИТЕКТУРНОГО БЕЛКА Su(Hw) СТИМУЛИРУЮТ РЕКРУТИРОВАНИЕ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕГУЛЯТОРОВ PcG/TrxG НА ХРОМАТИН: CRISPR/Cas9-ТЕСТ ГЕНЕТИКА, том 59, № 3, с. 308–315 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.31857/S0016675823030049

4. Ерохин М., Браун Л., Ломаев Д., Воробьева Н., Чжан Л., Фаб Л., Мазина М., Кулаковский И., Зиганшин Р., Шедл П., Георгиев П., Сун М., Кассис Д., Четверина Д. Crol contributes to PRE-mediated repression and Polycomb group proteins recruitment in Drosophila Nucleic Acids Research, Nucleic Acids Research, gkad336, https://doi.org/10.1093/nar/gkad336 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1093/nar/gkad336

5. Четверина Д.А., Воробьева Н.Е., Дьерфи Б., Штиль А.А., Ерохин М.М. Analyses of Genes Critical to Tumor Survival Reveal Potential ‘Supertargets’: Focus on Transcription Cancers, - (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/cancers15113042

6. Четверина Д.А., Горбенко Ф.В., Ломаев Д.В., Георгиев П.Г., Ерохин М.М. ПРИВЛЕЧЕНИЕ НА ХРОМАТИН (GA)n-АССОЦИИРОВАННЫХ ФАКТОРОВ GAF И Psq В ТРАНСГЕННОЙ МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ ЗАВИСИТ ОТ ПРИСУТСТВИЯ САЙТОВ СВЯЗЫВАНИЯ АРХИТЕКТУРНЫХ БЕЛКОВ ДОКЛАДЫ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК. НАУКИ О ЖИЗНИ, том 506, с. 371–376 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.31857/S2686738922050067

Возможность практического использования результатов
не указано