Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Первый этап проекта был направлен на решение задач по разработаке технологий изготовления микрофлюидных устройств для исследования полимеризации гидрогелей и для формирования монодисперсных гидрогелевых микрочастиц. Для этого с помощью методов компьютерного моделирования был разработан дизайн микрофлюидного чипа с массивом наноканалов, соединяющих два независимых микрообъёма. После этого была разработана технология изготовления кремний/стеклянных чипов с таким дизайном, основанная на методах оптической и ионной литографии, плазмахимического травления. Для этого была исследована зависимость геометрических размеров наноканалов от времени их травления сфокусированным ионным пучком (FIB). Было показано, что при малых временах травления увеличивается глубина канала, при этом его ширина меняется слабо. Однако, при его увеличении начинает возрастать ширина канала, а его глубина практически не меняется. Герметизации чипов производилась с помощью анодного связывания стеклянной пластины и кремниевого чипа с микро и наноканалами. После этого была разработана методика и проведено исследование ионной проводимости полученных наноканалов путем измерения их вольт-амперных характеристик в водных растворах KCl концентрацией 1мМ – 1М. Было показано, что при возрастании концентрации от 1 до 10 мМ проводимость изменяется слабо, что обусловлено перекрытием двойных электрических слоев внутри каналов. При дальнейшем увеличении концентрации проводимость начинает экспоненциально возрастать. Для микроканалов шириной 1 мкм данная зависимость имеет экспоненциальный характер во всем диапазоне концентраций, что обусловлено отсутствием перекрытия двойных электрических слоев. Для разработки микрофлюидных устройств для формирования гидрогелевых микрочастиц разработан метод 2D моделирования двухфазных течений жидкости в микроканалах, который позволяет качественно рассчитывать поле скоростей течения жидкости и распределения концентрации веществ в процессе формирования эмульсии «вода в масле». С помощью разработанного метода были исследованы режимы генерации капель в микрофлюидных генераторах капель с фокусировкой потока с симметричным и асимметричным расположением микроканалов. Моделирование показало, что за счет возникновения асимметричного вихря в области формирования капель в асимметричном генераторе капель происходит увеличение скорости перемешивания реагентов. Экспериментальные исследования показали, что направление этого вихря зависит от глубины микроканалов. Однако во всех случаях возникающий вихрь вплоть до 6 раз ускоряет скорость перемешивания реагентов за счет изменения их распределения во вновь сформированной капле. Однако, эффективность перемешивания сильно зависит от объема формируемых капель и максимальна тогда, когда он равен объему области их формирования в микрофлюидном чипе. Для преодоления этого ограничения геометрию генератора капель можно масштабировать не меняя общие габариты чипа. Для ввода жидкостей в микрофлюидные чипы разработан 4-х канальный микрофлюидный контроллер давлений на базе электро-пневматических преобразователей. Для его подключения к пробиркам с жидкостями и к микрофлюидному чипу разработаны и методом 3D печати изготовлены пневмо-жидкостные интерфейсы. Результаты испытаний показали, что вариация диаметра формируемых капель в течение 4х часов не превышает 2 мкм при среднем диаметре 50 мкм и сопоставима с результатами, полученными при использовании прецизионных шприцевых насосов. Результаты исследования режимов генерации монодисперсной эмульсии «вода в масле» показали, что в микрофлюидном чипе с апертурой 15 мкм, шириной выходного канала 200 мкм и глубиной 40 мкм диаметр капель линейно зависит только от соотношения между давлениями дисперсной и непрерывной фаз и может варьироваться от 5 до 65 мкм. При использовании шприцевых насосов эта зависимость нелинейная, а диаметр капель может варьироваться от 20 до 60 мкм. Частота генерации капель при использовании контроллера давлений зависит как от абсолютного значения давлений, так и от соотношения между ними. Для синтеза монодисперсных гидрогелевых микрочастиц были использованы разработанные и исследованные микрофлюидные генераторы капель с фокусировкой потока. Была показана возможность синтеза микрочастиц из полиакриламида, полиэтиленгликоль диакрилата, желатин метакрилата, агарозы и альгината натрия диаметром от 20 мкм путем формирования капель из них с последующей полимеризацией/сшивкой в них гидрогелевого материала. Частота генерации при этом может составлять до 1 кГц при использовании минерального масла. При этом режим генерации капель в большинстве случаев осуществляется в капающем режиме, однако если вязкость исходного материала значительно превышает вязкость воды, она может осуществляться в струйном режиме. Для использования гидрогелевых микрочастиц для 3D печати требуется их упорядоченно располагать на подложке. В рамках проекта было показано, что микрочастицы можно располагать заданным образом на микроструктурированных гидрогелевых подложках, выполненных путем их полимеризации на штампах из полидиметилсилоксана (ПДМС). Размеры микроструктур на гидрогелевых подложках были от 20 мкм и отличались от заложенных в дизайне не более чем на 5%.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Второй этап реализации проекта был направлен на разработку методов определения степени полимеризации гидрогелевых микрочастиц, оптимизации экспериментальной установки для эффективного синтеза многослойных микрочастиц и упаковку в них клеток модельных клеточных линий, а также исследование процесса развития клеток в гидрогелевых микрочастицах. Для этого была разработана методика и проведены исследования вольт-амперных характеристик микроканалов шириной 2 мкм в разработанных микрофлюидных устройствах в процессе полимеризации полиэтиленгликоль диакрилата (PEGDA) под действием УФ излучения и альгината под действием ионов кальция. Результаты исследования показали, что проводимость микроканалов не меняется при полимеризации PEGDA, а при полимеризации альгината увеличивается в ~ 2 раза. Для эффективного синтеза многослойных гидрогелевых микрочастиц требуется прецизионно управлять более 4 потоками жидкости в микрофлюидном устройстве. Для упрощения экспериментальной установки и увеличения стабильности синтеза был разработан метод формирования эмульсий при вводе жидкостей в микрочип под действием отрицательного давления. При давлении меньше -30 кПа диаметр формируемых капель не зависит от абсолютного значения давления, а определяется гидравлическими сопротивлениями микроканалов. Это позволяет стабильно на протяжении нескольких часов формировать двухслойные микрочастицы «ядро-оболочка» из альгината натрия диаметром ~ 150 мкм с частотой до 250 шт/с и упаковывать в их ядро или оболочку клетки. Экспериментально было показано, что возможно культивирование клеток CT26-EGFP в альгинатных микрочастицах в течение более 9 дней in vitro, что подтвердило хорошую биосовместимость альгината и его перспективность использования в 3D биопечати. С помощью 3D микроманипулятора возможно управляемо располагать гидрогелевые микрочастицы на подложках для подтверждения концепции их использования в качестве биочернил. Использование желатиновых подложек, насыщенных ионами кальция увеличивает адгезию альгинатных микрочастиц к подложке и стимулирует формирование связей между частицами. Для распространения знаний и популяризации микрофлюидных технологий в России исполнителями проекта созданы 10 обучающих видеороликов, размещяемых на Youtube канале BioTechLab [https://www.youtube.com/channel/UCdih1D25agwMhQtjP-A06WA]. В материалах видеороликов использованы результаты, полученные в рамках реализации проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1) В рамках проекта был разработан метод формирования свободноподвешенных SiN мембранах толщиной 20 и 40 нм площадью 30х30 мкм2, метод формирования плазмонных bow-tie наноантенн на подвешенных мембранах и одиночных нанопор диаметром ~ 5 нм в них в зазоре шириной 10 нм между двумя лепестками bow-tie наноантенн. При облучении нанопор с плазмонными наноантеннами лазерным излучением с длиной волны 632 нм и мощностью 10 мВт, равновесный уровень тока возрастает на 10%. При облучении этого же образца излучением в широком спектральном диапазоне от галогеновой лампы, ионный ток вырастает на 28%. Похожие результаты наблюдаются для образцов нанопор без плазмонных антенн: в широком спектральном диапазоне ионный ток увеличивается на 38%, а при воздействии красным (632 нм) и зеленым (532 нм) лазерами на 7%, и 0,6%, соответственно. Отстутсвие значительного увеличения температуры в районе поры, измеренное с помощью рамановского сдвига в кремниевой наночастице, свидетельствует о том, что фотоиндуцированное изменение поверхностных состояний нанопоры оказывает большее воздействие на ионный транспорт, чем локальный нагрев. 2) Разработан метод синтеза альгинатных микрочастиц с клетками в микрофлюидном устройстве производительностью 0.75 мл/час. В основе метода лежит микрофлюидный чип с фокусировкой потока, течение жидкостей в котором осуществляется с помощью создания отрицательного давления в выходном резервуаре. Благодаря этому для синтеза гидрогелевых микрочастиы требуется только микрофлюидный чип и компактный мембранный вакуумный насос с регулятором давления, что позволяет быстро и воспроизводимо осуществлять синтез гидрогелевых микрочастиц в стерильных условиях. Увеличение производительности достигнуто за счет оптимизации топологии микрофлюидного чипа, увеличения отрицательного давления до -27 кПа без ухудшения монодисперсности микрочастиц или параллельного подключения двух микрофлюидных чипов. 3) Результаты экспериментальных исследований по культивированию клеток CT26-eGFP в альгинатных микрочастицах показали в течение 15 - 21 дня показали, что более 80% клеток сохраняет жизнеспособность. При этом через 1 – 4 дня из отдельных клеток происходит формирование клеточных сфероидов, которые затем увеличиваются по площади в 3 – 8 раз. На 21 день культивации происходило полное разрушение альгинатной оболочки, что свидетельствует о деградации гидрогеля. Анализ клеточного цикла с помощью проточной цитометрии не показало отличий в распределении клеток по стадиям клеточного цикла по сравнению с контрольными образцами клеток в культуральных планшетах. Дополнительно было показано, что в каплях двойной эмульсии «вода-масло-вода» отдельные клетки формировали клеточные сфероиды в течение 2 – 4 часов, что в перспективе может упростить и ускорить метод получения клеточных сфероидов для 3D био печати. 4) Разработан и изготовлен макет 3D биопринтера с подогреваемой до 50 С платформой, способный печатать гидрогелевыми материалами на плоской подложке, в чашке Петри или в 12 луночном планшете. Гидрогелевый материал для печати загружается в стандартный шприц объемом 1 – 5 мл, который устанавливается в экструдер. Диаметр сопла 0.4 – 0.7 мм в зависимости от установленного наконечника. Скорость печати до 10 мм/с. Управляется принтер с помощью стандартного G-кода из приложения с открытым исходным кодом Repetier-Host. 5) В результате экспериментальных исследований были разработаны методы формирования планарных и трехмерных клеточных структур разных размеров и формы с помощью разработанного макета 3D биопринтера. Были протестирован широкий спектр гидрогелевых материалов (альгинат, хитозан, коллаген I типа, метилцеллюлоза, Pluronic F-127) и их комбинации. Водный раствор альгината 0.75% & Pluronic F-127 18.75% показал себя наилучшим кандидатом на роль гидрогеля для 3D печати, с которым достигнуто высокое разрешение печати (до 0.6 мм), а показатель выживаемости клеток CT26-eGFP составляет более 90% в течение 10 дней. 6) Разработаны и изготовлены экспериментальные образцы устройства «орган-на-чипе», имитирующего альвеолярно-капиллярную мембрану воздушного мешка легкого человека. Устройство содержит гибкую пористую мембрану из полидиметилсилоксана, усиленную углеродными нанотрубками, для имитации движения диафрагмы, на которой возможно выращивать двумерные клеточные структуры в гидрогелевых микрочастицах. 7) Разработана конструкция устройства «орган-на-чипе» для роста трехмерных клеточных структур, сформированных методом 3D печати, и компактная перфузионная система для него на основе перистальтического насоса для автоматической смены питательной среды. Разработан метод создания 3D клеточных структур из альгинатных микрочастиц с помощью 3D биопринтера в этом устройстве. 8) Разработанная конструкция устройства «орган-на-чипе» и перфузионная система автоматической смены питательной среды позволяет культивировать клетки CT26-eGFP в трехмерной клеточной структуре на основе альгината в течение 10 дней в СО2 инкубаторе, при этом на 10 день жизнеспособность клеток составляет ~ 70%. 9) Проведенные экспериментальные исследования на примере доксорубицина показывают, что клеточные структуры в альгинатных микрочастицах можно использовать для тестирования лекарственных препаратов. Результаты, полученные через 48 часов показывают, что выживаемость клеток в таких микрочастицах без добавления доксорубицина составляет более 85%, а при добавлении доксорубицина падает до 5%, что сопоставимо с результатами, полученными в контроле. 10) Результаты инкубирования мезенхимальных стволовых клеток линии FRSN в альгинатных микрочастицах показывают, что их жизнеспособность в течение 7 дней инкубирования составила более 80%. Также наблюдалось увеличение количества клеток в микрочастицах и образование ими клеточных сфероидов.