Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. Изучено влияние липополисахаридов E. coli (ЛПС) и этаноламидов докозагексаеновой (DHEA) и эйкозапентаеновой кислот (EPEA) на морфологические характеристики микроглии, пролифертивную и антиоксидантную активность, экспрессию цитокинов в экспериментах in vitro на культуре микроглиоцитов SIM-A9. Методом твердофазного иммуноферментного анализа получены количественные данные, характеризующие влияние исследуемых препаратов на дифференцировку микроглиоцитов в М1- или в М2-фенотипы. Мы обнаружили, что введение ЛПС в культуральную среду вызывает изменения морфологии глиальных клеток. После 24-часовой инкубации с 1 μg/ml раствором ЛПС клетки, имеющие округлую или веретенообразную форму, меняют свою форму и увеличиваются в размерах. Однако, добавление этаноламидов ДГК и ЭПК совместно с ЛПС предотвратило развитие морфологичеких признаков активации. Исследование цитотоксических свойств исследуемых соединений методом, основанным на использовании флуоресцентного красителя пропидия иодида показало отсутствие цитотоксической активности всех исследуемых концентраций этаноламидов ДГК и ЭПК. Исследование антиоксидантной активности этаноламидов ДГК и ЭПК проводилось путем определения активности антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы (SOD) при инкубации клеток с ЛПС и этаноламидами жирных кислот. В результате мы выявили, что препараты DHEA и EPEA препятствуют ЛПС-опосредованному снижению активности SOD. Исследование концентрации малонового диальдегида (МДА) в культуральной жидкости после инкубации клеток с раствором ЛПС и исследуемыми препаратами показало, что как DHEA так и EPEA препятствовали ЛПС-опосредованному повышению концентрации МДА. MTS-тест показал, что препараты DHEA и EPEA препятствуют ЛПС-опосредованному снижению пролиферативной активности в культуре микроглии. Для того, чтобы исследовать способность DHEA и EPEA подавлять воспаление in vitro, культуральную жидкость после инкубирования клеток с ЛПС и этаноламидами жирных кислот использовали для твердофазного иммуноферментного анализа. В итоге мы обнаружили, что препараты DHEA и EPEA препятствуют ЛПС-опосредованному увеличению продукции провоспалительных цитокинов ФНО-α и ИЛ-6. Однако, не выявлено влияния EPEA на ЛПС-опосредованное увеличение ИЛ-1β, в то время как препарат DHEA предотвращал ЛПС-опосредованной увеличение продукции данного цитокина. Кроме того, как DHEA, так и EPEA повышал продукцию противовоспалительного цитокина ИЛ-10 в гиппокампе. 2. С помощью поведенческих тестов получены подробные данные о функциональной активности гиппокампа у экспериментальных животных с хроническим нейровоспалением при введении препаратов DHEA и EPEA. Исследованы изменения показателей рабочей (оперативной), кратковременной и долговременной памяти, двигательной активности и тревожности. Мы обнаружили, что лечение препаратом DHEA предотвращает ЛПС-опосредованное снижение пространственной рабочей памяти во время тестирования Y-лабиринта. В то же время препарат EPEA не оказал положительного влияния на показатели рабочей памяти при нейровоспалении. Лечение препаратами DHEA и EPEA не предотвратило ЛПС-опосредованного снижения двигательной активности. Кроме того, препараты DHEA и EPEA улучшили показатели долговременной памяти у животных с нейровоспалением, что показано в тестах пассивного избегания и распознавания новых объектов. В качестве теста на ЛПС-опосредованное повышение тревожности проводилось тестирование в приподнятом крестообразном лабиринте, однако тестирование не выявило увеличения тревожности в группе животных, получавших ЛПС. Это свидетельствует о том, что при выбранном нами режиме дозирования ЛПС основной мишенью служил именно дорсальный гиппокамп, отвечающий за когнитивные процессы. В то время как вентральный гиппокамп, участвующий в формировании эмоций, в том числе тревоги, был поражен в меньшей степени. 3. Получены данные о пролиферативной активности нейронов зубчатой извилины гиппокампа у мышей с хроническим нейровоспалением и при введении этаноламида ДГК, а также об активности нейронов с помощью иммуногистохимической окраски на белок немедленного реагирования Arc. Иммуногистохимическое определение продукции PCNA (маркера пролиферации и репарации) показало уменьшение количества PCNA-положительных клеток в субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа у животных, получавших ЛПС по сравнению с контрольной группой. Аналогичная картина наблюдалась для даблкортина (маркера новообразованных нейронов). Иммуногистохимическое исследование продукции белка Arc в субгранулярной зоне зубчатой извилины выявило его снижение при нейровоспалении, в то время как DHEA подавлял этот эффект. Проведен морфометрический анализ изменений структуры зубчатой извилины гиппокампа под действием хронического нейровоспаления и лечения. Препарат DHEA препятствовал уменьшению площади и длины зубчатой извилины гиппокампа при воздействии ЛПС. 4. Получены данные о морфологических особенностях пирамидальных нейронов, дендритов и дендритных шипиков CA1 области гиппокампа, а также гранулярных нейронов зубчатой извилины гиппокампа. Анализ Шолля выявил снижение сложности строения пирамидных нейронов области CA1 при воздействии ЛПС. Однако введение синаптамида позволило предотвратить как снижение количества пересечений апикальных дендритов, так и снижение общей длины дендритов. Кроме того, введение синаптамида препятствовало снижению количества дендритных шипиков, которое наблюдалось при введении ЛПС. Подобная картина наблюдалась и в отношении гранулярных нейронов зубчатой извилины. Получены данные о синаптической пластичности гиппокампа при нейровоспалении и лечении препаратом DHEA. 5. Получены данные о синаптической пластичности гиппокампа при нейровоспалении и лечении препаратом DHEA. Для изучения влияния нейровоспаления и лечения препаратом DHEA на синаптическую пластичность, проводились измерения долгосрочной потенциации в области CA1 переживающих срезов гиппокампа мышей. Стабильные исходные записи были получены за 30 минут до тетанизации. Тетанизация коллатерально-комиссуральных волокон Шаффера вызывает долговременную потенциацию полевых возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП) в области CA1. В результате мы выяснили, что препарат DHEA препятствовал ЛПС-опосредованному снижению долговременной потенциации в гиппокампе, что свидетельствует о нормализации синаптической пластичности, нарушенной при нейровоспалении. 6. Для выяснения механизмов положительного воздействия синаптамида на морфологию нейронов и синаптическую пластичность при нейровоспалении мы определили концентрацию ряда белков, участвующих в пластичности гиппокампа при нейровоспалительных процессах. С помощью твердофазного иммуноферментного анализа мы обнаружили снижение уровня рецепторов CB1 у мышей, получавших ЛПС, по сравнению с контрольной группой. Введение DHEA предотвращало развитие ЛПС-опосредованного снижения плотности рецептора CB1. Белки, кодируемые генами немедленного реагирования, а именно Arc и c-Fos, участвуют в синаптической пластичности и формировании долговременной памяти (Minatohara et al., 2016). В нашем исследовании нейровоспаление достоверно снижало уровень c-fos в гиппокампе по сравнению с контрольной группой. Введение DHEA предотвращало снижение уровня c-fos в гиппокампе. Учитывая важность глутаматергической нейротрансмиссии в поддержании синаптической пластичности в данном исследовании мы определили экспрессию рецепторов NMDA в гиппокампе. Введение DHEA предотвращает развитие LPS-опосредованного снижения уровня NMDAR1. В то же время мы наблюдаем обратную ситуацию с изменениями уровня NMDAR2a, а именно, введение DHEA предотвращает ЛПС-опосредованное повышение уровня NMDAR2a. Чтобы выяснить механизмы влияния DHEA на ЛПС-опосредованное нарушение синаптической пластичности, мы определили продукцию синаптофизина, белка пресинаптических везикул. Мы выяснили, что лечение препаратом DHEA предотвращает ЛПС-опосредованное увеличение концентрации данного белка в гиппокампе. Предполагая участие провоспалительной активации микроглии в наблюдаемых явлениях, на следующем этапе мы исследовали продукцию провоспалительного цитокина IL-1β с помощью ИФА и активность Iba-1+-микроглии иммуногистохимически. Исследование продукции провоспалительного цитокина IL-1β показало, что введение DHEA предотвращает ЛПС-опосредованное повышение концентрации IL-1β в гиппокампе. 7. Получены данные о пролиферативной активности микроглиоцитов и астроцитов при нейровоспалении и лечении препаратами DHEA и EPEA. Для исследования активности микроглии применялось иммуногистохимическое окрашивание на маркер микроглии Iba-1. Активность астроглии исследовали путем иммуногистохимического окрашивания на маркеры астроцитов GFAP (общий пул астроцитов) и S100β (зрелые астроциты). Подсчет площади иммунопозитивного окрашивания проводили в обрастях гиппокампа CA1, CA3 и DG. Исследуя площадь окрашивания Iba-1 позитивной микроглии мы обнаружили, что введенная доза DHEA предотвращает повышение данного показателя и значение держится на уровне контрольной группы. При исследовании продукции маркера астроглии GFAP в гиппокампе мы обнаружили достоверное повышение в регионах CA1, CA3 и DG. При этом, как DHEA, так и EPEA препятствовали ЛПС-опосредованному повышению продукции. Иммунопозитивная окраска маркера зрелых астроцитов S100β имела схожий вид с распределением окраски GFAP. Как DHEA, так и EPEA препятствуют увеличению продукции S100β в CA1. 8. Проведена оценка количественного соотношения двух основных микроглиальных фенотипов М1 и М2 путем определения продукции про- и противовоспалительных цитокинов в гиппокампе методом иммуноферментного анализа. Мы обнаружили, что ЛПС вызывает увеличение продукции ФНО-α в гиппокампе, в то время как введение DHEA предотвращает развитие данного эффекта. Введение аналогичной дозы EPEA оказалось не способно предотвратить ЛПС-опосредованное увеличение продукции ФНО-α. Аналогичный эффект наблюдался и при исследовании продукции ИЛ-1β. Введение DHEA, но не EPEA, предотвратило ЛПС-опосредованное повышение продукции ИЛ-1β. Введение ЛПС не повлияло на продукцию противовоспалительного цитокина ил-4, однако, введение DHEA и EPEA увеличило продукцию ИЛ-4 по сравнению с контролем. Кроме того, введение DHEA увеличило продукцию ИЛ-10 по сравнению с контролем. Таким образом, мы можем сделать вывод о том, что аналогичные дозы DHEA и EPEA оказывают различное воздействие на активность глиальных клеток и продукцию цитокинов в гиппокампе. Препарат DHEA более эффективно препятствует M1-поляризации микроглии, снижая ЛПС-опосредованную выработку провоспалительных цитокинов и увеличивая продукцию противовоспалительных цитокинов.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В процессе выполнения проекта (2021-2022 гг.) все запланированные работы выполнены в полном объеме. В проекте использован комплекс современных экспериментальных подходов, включающих применение гистологических, иммуногистохимических, биохимических и электрофизиологических методов. Детально изучена противовспалительная и нейропротективная активность этаноламидов докозагексаеновой (ЭДГК) и эйкозапентаеновой кислот (ЭЭПК). Поскольку на 1 этапе работы проводилось комплексное исследование влияния ЭДГК на структурное и функциональное состояние гиппокампа при нейровоспалении, на 2 этапе планировалось уделить основное внимание изучению влияния ЭЭПК на исследуемые параметры. Поскольку глутаматергическая передача играет существенную роль в реализации синаптической пластичности, в процессе выполнения проекта исследована экспрессия глутаматергических рецепторов в гиппокампе при нейровоспалении и терапии этаноламидом эйкозапентаеновой кислоты (ЭЭПК). Показано, что введение ЭЭПК предотвращает ЛПС-индуцированные изменения экспрессии NMDA- и AMPA-рецепторов. Исследована продукция нейротрофических факторов в гиппокампе при нейровоспалении и терапии препаратами ЭДГК и ЭЭПК методами иммуногистохимии и иммуноферментного анализа. Исследование данного аспекта важна для понимания механизмов изменений в работе глутаматергической системы, так как снижение выработки нейротрофических факторов при нейровоспалении может лежать в основе увеличения активности глутаматергических нейронов. Поскольку BDNF высвобождается как из дендритных, так и из аксонных проекций глутаматергических нейронов в гиппокампе, он может сам по себе усиливать глутаматергическую передачу как пре- так и постсинаптически. Кроме того, исследование продукции нейротрофических факторов глиальными клетками важно для понимания роли микро- и астроглии в изменении морфологии нейронов и их дендритов. Мы обнаружили, что введение ЭДГК препятствует ЛПС-индуцированному снижению продукции BDNF в регионах CA1, CA3 и зубчатой извилине гиппокампа. В то же время ЭЭПК не препятствовал снижению продукции BDNF в гиппокампе. Кроме того, выявлено положительное влияние исследуемых препаратов на продукцию нейротрофического фактора NGF (Nerve growth factor). Исследование электрофизиологических параметров гиппокампа при нейровоспалении и лечении исследуемыми препаратами показало, что ЭЭПК, наряду с ЭДГК способен предотвращать нарушения синаптической пластичности в гиппокампе. Для изучения эффектов ЛПС, ЭДГК и ЭЭПК на синаптическую пластичность проводились измерения долгосрочной потенциации в области CA1 переживающих срезов гиппокампа мышей. Долгосрочную потенциацию индуцировали с помощью тетанизации коллатерально-комиссурального пути Шаффера в области CA1. Показано стимулирующее влияние ЭЭПК на процессы нейрогенеза в гиппокампе, нарушенные вследствие ЛПС-индуцированного нейровоспаления. Введение ЭЭПК способно предотвращать ЛПС-опосредованное снижение продукции белка-маркера новообразованных нейронов даблкортина. Кроме того, ЭЭПК препятствовал ЛПС-опосредованному снижению экспрессии маркера пролиферации и репарации PCNA в субгранулярном слое зубчатой извилины гиппокампа. Исследованы морфологические особенности пирамидных нейронов, а также дендритов и дендритных шипиков в CA1-области гиппокампа при нейровоспалении и лечении препаратом ЭЭПК. Обнаружено снижение общей длины дендритов пирамидных нейронов области гиппокампа CA1 при введении ЛПС. Введение ЭЭПК препятствовало снижению как общей длины дендритов, так и количества дендритных ветвлений. Кроме того, препарат ЭЭПК предотвращал ЛПС-опосредованное снижение количества грибовидных дендритных шипиков. Проведено детальное исследование активности микро- и астроглии в отдельных слоях гиппокмпа и зубчатой извилины: Stratum oriens, Stratum pyramidale, Stratum luciderm, Stratum radiatum, Stratum lacunosum, Stratum moleculare, Stratum granulosum и hilus при нейровоспалении и лечении препаратами ЭЭПК и ЭДГК. С этой целью выполнено иммуногистохимическое выявление активности маркеров микроглии (Iba-1) и астроглии (GFAP, S100β) с последующим количественным определением их активности в отдельных слоях гиппокампа. Исследование микроглиальной активности в гиппокампе на модели ЛПС-индуцированного воспаления показало, что ЭДГК предотвращает усиление окрашивания Iba-1-иммунопозитивной области в гиппокампе у животных, получавших ЛПС. В то же время введение ЭЭПК не препятствовало увеличению площади Iba-1-иммунопозитивного окрашивания. Примечательно, что в области CA3 ЭДГК, вводимый отдельно от ЛПС, снижает иммунореактивность Iba-1 по сравнению с контролем. В областях CA1 и CA3 различия между группами «ЛПС» и «Контроль» оказались наиболее выражены в слое stratum lacunosum-moleculare. В зубчатой извилине различия наиболее выражены в молекулярном слое и хилусе. Такие селективные изменения иммунореактивности, вероятно, связаны с более высокой плотностью микроглиальных клеток в этих субрегионах. Наблюдаемое гетерогенное распределение микроглии внутри гиппокампа, вероятно, связано с модуляцией нервной активности. Кроме того, микроглия часто играет нейропротекторную роль, выделяя соединения, которые могут защищать нейроны от апоптотической гибели. Специфический паттерн распределения микроглии может быть связан с активацией микроглии факторами, продуцируемыми апоптотическими нейронами. Частичная активация микроглии M2-фенотипа под действием ЭЭПК может быть ключевым фактором, объясняющим способность соединений предотвращать активацию астроглии, не влияя на распределение Iba1-позитивной микроглии. Изучение продукции маркера астроцитов глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) в гиппокампе продемонстрировало значительное увеличение его плотности в областях CA1, CA3 и DG под действием ЛПС. Как ЭДГК, так и ЭЭПК предотвращали ЛПС-опосредованное увеличение продукции GFAP. Несмотря на то, что слой lacunosum-molculare области CA1 не показывает значительного увеличения GFAP-положительного окрашивания во время нейровоспаления, и ЭДГК, и ЭЭПК значительно уменьшают площадь окрашивания по сравнению с контрольной группой. В слое stratum radiatum снижение иммунореактивности GFAP также наблюдается у животных без нейровоспаления, получавших ЭДГК и ЭЭПК. В области CA3 ЭДГК, так и ЭЭПК ингибируют увеличение экспрессии GFAP во всех слоях в одинаковой степени. В зубчатой извилине подобная тенденция наблюдается во всех слоях за исключением слоя гранулярных клеток, где не было обнаружено существенных различий между группами. При оценке иммунопозитивного окрашивания S100β, маркера зрелых астроцитов, мы обнаружили закономерность, сходную с распределением окрашивания GFAP. Как ЭДГК, так и ЭЭПК препятствовал увеличению экспрессии GFAP в области СА1 и зубчатой извилине. Интересно, что в области СА3 как ЭДГК, так и ЭЭПК, вводимые отдельно от ЛПС, снижали иммунореактивность S100β по сравнению с группой «Контроль». В области СА1 иммунореактивность S100β значительно повышалась после введения ЛПС в областях str. radiatum и the str. lacunosum–moleculare. В области СА3 в то время, как достоверное увеличение экспрессии S100β наблюдалось в слоях str. oriens и the str. luciderm, только в str. luciderm мы наблюдали значительное влияние как ЭДГК, так и ЭЭПК на иммунореактивность S100β. В слое lacunosum–moleculare как ЭДГК, так и ЭЭПК снижали уровень S100β у животных, не получавших ЛПС ниже уровня группы «Контроль». В зубчатой извилине как ЭДГК, так и ЭЭПК предотвращали повышение иммунореактивности S100β в слоях stratum moleculare и hilus. По результатам, полученным на втором этапе проекта, опубликована статья в высокорейтинговом научном журнале International Journal of Molecular Sciences (IF 5.923). Исполнители гранта приняли участие в International Conference Marine Biology in the 21st Century: Achievements and Development Outlook, October 6-8, 2021, Vladivostok, Russia. Результаты работы, опубликованные в журнале International Journal of Molecular Sciences были широко освещены в СМИ.