Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Первый этап работы по проекту был направлен на изучение ассоциаций между уровнем экспрессии и ко-экспрессии рецепторов 1 и 2 типа к TNFα с функциональным ответом клеток на медиатор. В результате оценки типа и характера реагирования опухолевых клеточных линий различного генеза на различные дозы цитокина было установлено, что клеточный ответ на TNFα зависел от плотности экспрессии TNFR1 и TNRF2, а также от их совместной экспрессии на клетках. Высокий процент клеток, экспрессирующих TNFR1, был связан с преимущественной активацией проапоптотических путей в ответ на повышение концентрации TNFα, тогда как высокий процент клеток, экспрессирующих TNFR2, был связан с индукцией клеточной пролиферативной активности. Однако, когда уровни экспрессии обоих типов рецепторов были высокими, процент дубль-позитивных клеток в популяции клеток определял, какой сигнальный путь (проапоптотический или пролиферативный) был активирован. Дозозависимое снижение пролиферативной активности с увеличением концентрации TNFα наблюдалось для клеточных линий, которые содержали более высокий процент дубль-позитивных клеток TNFR1+ TNFR2+. Результаты этого исследования продемонстрировали, что процент клеток, коэкспрессирующих TNFR1 и TNFR2 в различных соотношениях, а также плотность экспрессии рецептора на клетках, были в значительной степени связаны с балансом между активацией проапоптотической и пролиферативной передачи сигналов. На основании полученных данных и выявленных ассоциаций, были отобраны две клеточные линии различного происхождения (ZR-75/1 и К-562), ко-экспрессирующие оба типа рецептора к TNFα, и были получены модифицированные варианты этих линий с нокаутом по гену одного из типов рецепторов к цитокину. Сравнение модифицированных линий различного происхождения по их функциональному ответу на цитокин, а также исследование порогового уровня экспрессии рецепторов для активации различных сигнальных путей, планируемое на второй год реализации проекта, позволит получить уникальные данные по возможности модуляции действия цитокина через изменение уровня экспрессии рецепторов на клетках. В результате проведенной комплексной оценки показателей ко-экспрессии и количественной экспрессии были получены данные об изменениях этих показателей при ревматоидном артрите и их ассоциированность с тяжестью течения этих заболеваний и ответом на терапию. Была проведена оценка изменения показателей экспрессии рецепторов 1 и 2 типа к TNFα при проведении различных видов терапии ревматоидного артрита и динамики в отсроченном периоде после проведенного лечения. Полученные данные указывают на различный вклад рецепторов TNFα в функционирование иммунокомпетентных клеток при патологии и позволяют выявить отдельные субпопуляции, индивидуально реагирующие на проводимую терапию, как объект для использования подходов таргетной vодуляции экспрессии рецепторов к цитокину для контроля провоспалительных и аутоиммунных процессов. Оценка данных параметров может являться перспективной для понимания механизмов регуляции иммунного ответа клеток, а также стать дополнительным критерием диагностики иммуноопосредованных заболеваний и терапевтической мишенью для создания новых подходов в лечении.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Варианты сигналинга специфических рецепторов 1 и 2 типа в настоящее время активно изучаются и включают в себя на данный момент не менее пяти вариантов внутриклеточной активации, приводящих либо к выживанию клеток, либо к нормальной или атипичной пролиферации, либо к клеточной гибели. Однако возможности и способы таргетной регуляции взаимодействия цитокин-рецептор на данный момент не известны и представляют собой значимую фундаментальную и прикладную научную задачу. Этап второго года работ по проекту был направлен на выявление механизмов такой регуляции и оценки практической применимости модуляции взаимодействия цитокин-рецептор для управления функциональной активностью целевых клеток. Проведенные работы и полученные результаты включали в себя пять больших блоков, направленных на последовательное изучение механизмов модуляции экспрессии рецепторов и оценки их влияния на параметры функционирования клеток. Первый блок включал в себя подходы по полному подавлению экспрессии одного из типов рецепторов на клеточных линиях для оценки типичных способов реагирования клеток на цитокин при наличии только TNFR1/TNFR2. Данный этап был полностью реализован за счет получения двух парных генетических нокаутов: нокаутов двух разных типов рецепторов для одной клеточной линии (K562) и нокаутов рецептора первого типа для двух клеточных линий различного происхождения (K562 и ZR75/1). Сопоставление данных по влиянию самих нокаутов одного из рецепторов на другой тип рецептора позволило установить, что полная инактивация экспрессии одного из типов рецепторов приводила к компенсаторному увеличению экспрессии другого типа рецептора за счет увеличения доли экспрессирующих клеток. При этом были установлены различия по влиянию нокаута на плотность экспрессии другого типа рецептора и выявлены потенциальные нижние пороговые уровни для изменения характера реагирования клеток на цитокин. Второй блок включал в себя первый этап разработки протоков частичного подавления экспрессии одного из типов рецепторов за счет применения технологии siRNA. Данный подход был протестирован для интактных и нокаутированных клеточных линий и был определен как нерелевантный для целей исследования в связи с невозможностью полного или контролируемого подавления экспрессии рецепторов на уровне белка на мембране за счет более длительного периода стабильной экспрессии рецепторов на поверхности клеток по сравнению с периодом действия нейтрализирующих реагентов. Данный этап показал невозможность использования технологии siRNA для стабильной управляемой регуляции уровнем экспрессии рецепторов на поверхности клеток и на основании выполненных экспериментов мы планируем использовать технологию shRNA для дальнейших работ по данному блоку. Третий блок включал в себя оценку функциональной активности клеток, полученных в результате использования всех исследуемых комбинаций методов подавления экспрессии (нокаут и siRNA) для определения дозозависимого влияния самого цитокина TNF как на параметры ко-экспрессии рецепторов, так и на показатели функциональной активности клеток, приоритезацию механизмов модуляции клеточной активности. Выявленные ассоциации и тренды продемонстрировали, что хотя определенные концентрации цитокина ассоциированы с инициацией сигнальных путей, приоритетно направленных на выживаемость или клеточную гибель, интенсивность данных клеточных эффектов определяется именно показателями плотности экспрессии рецепторов и параметрами ко-экспрессии рецепторов. Также были первично установлены пороговые значения изменения (дельта) плотности экспрессии, критичные для изменения выраженности реагирования клеток на цитокин. Четвертый блок включал в себя установление типичных паттернов перераспределения рецепторов при иммуноопосредованных заболеваниях различной этиологии и определение трендов и ассоциаций между показателями активности и давности заболеваний с параметрами экспрессии и ко-экспрессии рецепторов на иммунных клетках. Было установлено, что для патологических процессов аутоиммунной и атопической этиологии характерны принципиально разные способы адаптации иммунных клеток к хроническому воспалительному процессу. Для ревматоидного артрита ключевым адаптационным механизмом служило изменение доли дубль-позитивных TNFR1+TNFR2+ клеток, в то время как эффективность терапии и клинические показатели тяжести заболевания зависели от индивидуальной вариативности в параметрах экспрессии рецепторов 2 типа. Для бронхиальной астмы, напротив, параметры экспрессии рецепторов 2 типа не продемонстрировали значимых ассоциаций с клинически значимыми показателями, и наиболее существенный вклад в формирование фенотипа клеток пациентов с тяжелыми формами и длительным протеканием заболевания вносили параметры экспрессии рецепторов 1 типа. Другим важным результатом данному этапа было установление факта, что характер перераспределения рецепторов на клетках при бронхиальной астме в значительной мере определяется давностью заболевания и отражает адаптационные механизмы Т-клеточного иммунитета, в то время как для ревматоидного артрита ключевыми параметрами, определяющими перераспределение рецепторов были индивидуальные характеристики пациента (демографические и клинические). Пятый блок включал в себя исследования транскрипционной активности клеток под действием различных концентраций цитокина. За второй год исследования ключевой задачей стояла разработка протокола оценки транскриптома с помощью технологии nCounter и панели, включающей 579 генов, и получение первичных данных о наличии различий в функциональной активности клеток в ответ на различные дозы цитокина. При анализе дифференциально экспрессируемых генов на линии ZR75/1 показано увеличение экспрессии 46 генов и снижение экспрессии 24 генов при увеличении дозы TNF. Различия в дифференциально экспрессируемых генах по преобладанию генов с повышенной экспрессией наиболее выражены в группах генов активация лимфоцитов, взаимодействие хозяин-патоген и врожденный иммунитет, и менее выражены в группах сигналинг хемокинов, сигналинг TLR и система комплемента. Полученные данные подтвердили наличие значимых изменений в экспрессии генов при изменении дозы TNF, что подтверждает эффективность данного подхода для дальнейшего исследования транскриптома на клетках с разной экспрессией рецепторов 1 и 2 типов. Таким образом, все запланированные к получению на данном этапе результаты получены в полном объеме и предоставляют возможность дальнейшего уточнения механизмов модуляции экспрессии рецепторов и таргетной регуляции функциональной активности клеток за счет полного и частичного подавления экспрессии одного или обоих типов рецепторов к TNF на клетках.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В результате третьего этапа проекта были завершены все эксперименты по модуляции уровня экспрессии рецепторов, проведен функциональный анализ и анализ транскриптома, разработаны диагностические и прогностические модели влияния уровня экспрессии рецепторов при иммуноопосредованных заболевания. Для проверки эффективности трансфекции siRNA, реализованной за второй год работ по проекту, был проведен ПЦР анализ мРНК генов рецепторов TNF на линии К562. Показано что, мРНК TNFR1A эффективно подавляется с помощью siRNA независимо от подавления TNFR1B. А экспрессия гена TNFR1B подавляется только при подавлении мРНК гена TNFR1A. Данные результаты подтверждают вывод о том, что подход с использованием siRNA эффективен для удаления мРНК рецепторов, но его нельзя использовать для оценки биологических эффектов мембраносвязанных белков, поскольку, несмотря на эффективность разрушения мРНК, сами мембранные структуры сохраняются гораздо дольше, нежели транзиторное подавление с помощью siRNA. Модификация уровня экспрессии мембраносвязанных рецепторов TNF с помощью трансфекции shRNA позволила получить клеточные линии К562 и ZR75/1 с нокдауном гена TNFR1. Были продемонстрированы разнонаправленные компенсаторные изменения в параметрах экспрессии 2 типа рецептора для данных клеточных линий, что приводило к различиям в чувствительности клеток к действию цитокина и реализуемым биологическим эффектам. Нокдаун TNFR1 на линии с нокаутом TNFR2 не позволил получить жизнеспособные клетки, что подтверждает необходимость сохранения экспрессии хотя бы одного типа рецептора к TNF для поддержания функциональной активности клеток и выживания. При изучении дозозависимого влияния rhTNF показано, что подавление экспрессии TNFR1 на клетках K562 приводит к снижению плотности экспрессии TNFR2, а на клетках линии ZR75/1, напротив, к увеличению плотности при добавлении стимулирующих концентраций цитокина. Анализ влияния TNF на параметры клеточного цикла и апоптоза показал, что линии с нокдауном TNFR1 характеризовалась различиями по пороговому уровню TNF, необходимому для влияния на уровень пролиферации, с большей чувствительностью для линии ZR75/1. Напротив, для провокации раннего апоптоза для линии К562 был показан более низкий пороговый уровень TNF. Сопоставление данных по пороговому уровню функционального реагирования клеток на различные дозы цитокина показало, что повышение доли TNFR2+ клеток на 5% и более было ассоциировано с изменением типа реагирования клеток на стимулирующие концентрации TNF с усилением апоптоза и снижением уровня пролиферации. Дополнительно был проведен эксперимент по оценке альтернативного сплайсинга генов рецепторов TNF на клеточных линиях К562 и MCF7, у которых при воздействии TNF была обнаружена повышенная экспрессия изоформы 3 гена TNFRSF1A. При этом только у K562 снижена экспрессия изоформ 1 и 4 гена TNFRSF1A, а у MCF-7 повышена экспрессия изоформы 2 TNFRSF1B. Эти различия в уровнях сплайс-вариантов могут быть причиной разнонаправленного функционального ответа, что подтверждает роль альтернативного сплайсинга рецепторов в регуляции биологического ответа клеток под действием лиганда. Эксперимент с оценкой транскриптома был выполнен с использованием интактной клеточной линии К562 и двух ее производных, с нокаутами TNFR1 (KIA) и TNFR2 (KIB) и стимуляцией TNF (5нг/мл). Как нокаут рецепторов TNF, так и инкубация с медиатором привели к значимому изменению уровня экспрессии ряда генов. При анализе участия генов с измененной экспрессией в сигнальных путях и биологических процессах, был получен ряд важных закономерностей, характеризующих участие рецепторного аппарата TNF в функциональном состоянии клеток и компенсаторные изменения на фоне экспрессии только одного из типов рецепторов. Связывание TNF только с одним типов рецептора запускает каскад реакций, приводящих к изменениям в экспрессии генов, ассоциированных с функциональной активностью клеток. Полученные данные свидетельствуют о важности одновременного сигналинга от обоих типов рецепторов TNF для корректного функционирования клеток и подчеркивают важность определения ко-экспрессии мембраносвязанных рецепторов при оценке биологических эффектов. Биостатистическая обработка данных, полученных от пациентов с ревматоидным артритом (РА) и бронхиальной астмой (БА) показала, что при патологии формируется уникальный, связанный с патогенезом заболевания, профиль экспрессии и ко-экспрессии рецепторов. При этом ключевые паттерны изменений в параметрах экспрессии TNFR1/TNFR2 могут являться диагностическими и прогностическими биомаркерами. Сравнение изменений в профилях ко-экспрессии между двумя патологиями позволило установить, в виде общего тренда, что у пациентов с БА выше процент клеток, экспрессирующих только TNFR1, а у пациентов с РА, напротив, более высокая экспрессия TNFR2. Данные изменения демонстрируют важность каждого из типов рецепторов в патогенезе соответствующего заболевания и подтверждаются регрессионными моделями для прогнозирования наличия и тяжести заболевания. Также установлено, что у пациентов с БА для большинства популяций было характерно однонаправленное изменение относительного и абсолютного содержания рецепторов, ассоциированное с длительностью течения заболевания, в отличии от пациентов с РА. Данная тенденция может объяснять тот факт, что при нетипичном течении БА и рефрактерности к стандартной терапии глюкокортистероидами иногда оказывается эффективной анти-TNF терапия, стандартно применяемая именно при РА. Проведенное исследование позволило выявить ассоциации между профилем ко-экспрессии рецепторов к TNF на момент подбора госпитальной терапии РА и длительностью сохранения сниженной активности заболевания после выписки из стационара., Параметры экспрессии рецепторов TNF на 4 популяциях были классифицированы как потенциальные биомаркеры прогнозирования ответа на терапию ритуксимабом до ее назначения, а также было выделено два общих тренда в перераспределении рецепторов на клетках у пациентов с низким уровнем ответа на терапию. Полученные данные создают предпосылки для дальнейшего тестирования выявленных потенциальных биомаркеров как в плане более детального изучения фундаментальных механизмов регуляции в системе цитокин-рецептор, так и для поиска и тестирования терапевтических мишеней для большого числа иммуноопосредованных заболеваний. В течение третьего года работ был полностью выполнен обсчет данных по влиянию нокаута и нокдауна рецепторов TNF на функциональный ответ клеток, проведено построение прогностических моделей для двух иммунноопосредованных заболеваний различной этиологии и проведен анализ данных транскриптома клеточных линий с экспрессией разных типов рецепторов в ответ на разные дозы TNF. За третий год реализации проекта был полностью достигнут целевой план по публикации научных результатов в рецензируемых журналах с опубликованием 4 статей, среди которых 2 статьи – в журналах первого квартиля.