Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Геномная нестабильность является одним из основных свойств раковых опухолей. Она лежит в основе появления «драйверных» и «пассажирских» мутаций, ведущих клетку по пути опухолевого перерождения, а также изменчивости опухоли в результате внешних воздействий и внутренних процессов. С другой стороны, нестабильность геномов раковых опухолей тесно связана с выбором терапии и с ее ожидаемой эффективностью. При принятии решении о назначаемой терапии наиболее часто рассматриваются такие параметры, как мутационная нагрузка опухоли, микросателлитная нестабильность (МСН), мутации генов белков, участвующих в репарации ДНК, амплификация и делеция генов. В ходе выполнения данного проекта мы рассчитываем всесторонне рассмотреть показатели нестабильности генома опухоли, дополнив стандартные маркеры геномной нестабильности информацией о мобильных элементах. Более того, мы планируем научиться получать всю эту информацию в ходе одной экспериментальной процедуры — секвенирования РНК нового поколения (Next Generation Sequencing, NGS). За первый год выполнения проекта были получены следующие основные результаты: 1) Выполнены все запланированные на этот год экспериментальные процедуры. Отобрано и аннотировано 200 образцов немелкоклеточного рака лёгкого, рака толстой кишки, глиобластомы, рака яичников и рака молочной железы (по 40 образцов для каждого типа рака). Проведено полноэкзомное секвенирование для 40 опухолевых образцов и секвенирование транскриптомов для 60 образцов опухолей. 2) Были проанализированы уже имеющиеся результаты полноэкзомного секвенирования для 160 экспериментальных образцов и результаты для 40 образцов, полученные в ходе выполнения этого проекта. Была проведена аннотация мутационных профилей по результатам экзомного секвенирования для 200 экспериментальных образцов. 3) С использованием доступных данных секвенирования из базы The Cancer Genome Atlas (TCGA) был разработан алгоритм для оценки мутационной нагрузки опухоли (МНО) по результатам транскриптомного секвенирования. Золотым стандартом расчёта мутационной нагрузки считается способ на основе сравнения данных полноэкзомного секвенирования опухолевого образца и образца нормальной ткани от того же пациента. Таким образом, из расчёта количества мутаций на 1 мегабазу экзомной ДНК исключаются герминальные мутации. В базе данных TCGA было найдено 53 парных профиля экзомного и транскриптомного секвенирования для FFPE образца опухолей, для которых также имелись результаты экзомного секвенирования образцов нормальной ткани от тех же пациентов. Все данные секвенирования для этих 53 образцов были загружены, а сами образцы случайным образом распределены по двум группам для создания тренировочной и тестовой выборок. Прочтения экзомного и транскриптомного секвенирования выравнивались на геном, после этого проводился поиск вариантов. В качестве эталонной оценки МНО было принято значение, полученное в результате сравнения данных полноэкзомного секвенирования опухолевого образца и образца нормальной ткани от того же пациента. К данным транскриптомного секвенирования применялись различные способы фильтрации, включая машинное обучение, для уменьшения вклада герминальных мутаций. Полученные данные сравнивались с эталонной МНО. Наилучшим образом проявил себя способ фильтрации на основе машинного обучения по методу XGBoost, в этом случае коэффициент корреляции Пирсона был равен 0,67 p=1,7×10-4. А AUC для разделения образцов по пороговым значениям МНО ≥6, ≥10 и ≥20 составляли 0.825, 0.854 и 0.905 соответственно. Полученный опыт был применен для определения МНО по данным траснкриптомного секвенирования для экспериментальных образцов. Наша экспериментальная группа насчитывала 73 опухолевых образца, для которых имелись парные профили экзомного и транскриптомного секвенирования. По величине покрытия для транскриптомных данных экспериментальные образцы разделялись на две группы: 65 образцов с низким покрытием (в ~2.5 раза ниже, чем у образцов из TCGA) и 8 образцов с высоким покрытием (в ~2.5 раза выше, чем у образцов из TCGA). Применение различных способов фильтрации для образцов с низким покрытием не дало удовлетворительных результатов. В то же время для образцов с высоким покрытием использование тройного фильтра (Mutect2 “germline_risk” + частота встречаемости согласно ExAC < 0.000033 + отсутствие идентификатора dbSNP) позволило добиться корреляции Пирсона в 0,85, p=7.6×10-3, а AUC для пороговых значений МНО ≥6, ≥10 составили 0.812 и 0.857 соответственно. Дальнейшее улучшение фильтрации с использованием машинного обучения не потребовалось. На основании полученных результатов можно заключить, что применение РНК-секвенирования парафинизированных опухолевых материалов с достаточным покрытием может позволить с большой эффективность разделять опухоли с высокой и низкой мутационной нагрузкой.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1) Отработана методика определения статуса микросателлитной нестабильности по данным RNAseq и по данным полноэкзомного секвенирования, проведена экспериментальная валидация результатов методом фрагментного анализа продуктов амплификации микросателлитных маркеров. Определен статус микросателлитной нестабильности для 339 экспериментальных образцов, из них по транскриптомным данным – для 339 образцов, по экзомным данным - для 224 образцов, методом фрагментного анализа продуктов амплификации микросателлитных маркеров – для 103 образцов. 2) Проведено секвенирование РНК для 100 опухолевых образцов. 3) Для 40 образцов немелкоклеточного рака легкого с известным статусом ответа на анти-PD1/PDL1-терапию по полученным ранее данным секвенирования РНК и полноэкзомного секвенирования были определены показатели геномной нестабильности: уровни активации и мутационной нагрузки путей репарации ДНК, вариации числа копий ключевых генов репарации, статусы микросателлитной нестабильности – а также получены данные о транскрипционной активности ретроэлементов. Все это было сопоставлено со статусами ответа на анти-PD1/PDL1 терапию. В результате было обнаружено, что уровень активности репарационного пути NCI ATM Main Pathway значимо разделял ответивших и не ответивших на анти-PD1/PDL1-терапию с AUC = 0,82. Также в двух образцах обнаружены делеции в гене PTEN в образцах, для которых наблюдалась прогрессия на анти-PD1/PDL1 терапии. 4) Составлен каталог геномных фланков эволюционно недавних ретроэлементов AluYa5/8, L1Hs и L1PA2 по данным Repbase. В общей сложности каталог включает 11014 геномных фланков эволюционно недавних ретроэлементов. Из них к L1HS относится 1642 геномных фланка, к L1PA2 – 5114, к AluYa5 – 3853 и к AluYa8 – 405. Отработана методика амплификации и создания библиотек геномных фланков для ретроэлементов AluYa5/8, L1Hs и L1PA. Эти наработки позволят в следующем году провести поиск специфичных для опухолей вставок ретроэлементов. 5) По результатам работы опубликованы две статьи в изданиях, входящих в первый квартиль (Q1). Также результаты представлены на двух конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1) Проведено секвенирование РНК для оставшихся 40 опухолевых образцов. 2) По результатам применения разработанного нами алгоритма для определения мутационной нагрузки опухоли (МНО) по данным РНК-секвенирования на расширенной выборке экспериментальных образцов были сделаны выводы, что данный метод пригоден для определения МНО, его точность возрастает при увеличении глубины секвенирования, и, если планируется определение МНО по транскриптомным данным, необходимо заранее спланировать условия секвенирования так, чтобы на выходе получалось не менее 20 млн уникальных прочтений на образец. 3) Определен статус микросателлитной нестабильности (МСН) по данным РНК-секвенирования для 140 образцов опухолей, и методом фрагментного анализа продуктов амплификации микросателлитных маркеров – для 50 образцов опухолей. Таким образом, к третьему году выполнения проекта суммарно статус МСН по транскриптомным данным был определен для более 470 образцов, по экзомным данным – для более 200 образцов; и методом фрагментного анализа – для 153 образцов. По результатам валидации чувствительность алгоритма предсказания МСН по транскриптомным данным составила 100%, а специфичность – 83%, AUC = 0.88. Чувствительность MSIsensor-pro составила 100%, специфичность – 91%, AUC = 0.94. Таким образом, алгоритм MSIsensor-pro позволяет сделать более точное предсказание наличия МСН по сравнению с анализом транскритомной подписи на МСН. 4) Проведен расчет уровней активации и мутационное нагрузки для 79 путей репарации ДНК суммарно в 200 опухолевых образцах рака легкого, колоректального рака, рака молочной железы, рака яичника и глиобластом. Обнаружено, что в различных типах опухолей наблюдается общая тенденция к ингибированию процессов, ответственных за контроль прохождения фаз клеточного цикла (подавленные пути BRCA1_Pathway_E2_Responsive_Genes, ATM_Pathway_G2.Mitosis_progression и ATM_Pathway_G2_M_Checkpoint_Arrest), а также накоплению мутаций (и предположительно постепенной инактивации генов) в путях, связанных с контролем качества ДНК и контролем прохождения клеточного цикла (пути BRCA и ATM). Потеря контроля качества ДНК сочетается с пониженной активацией или даже репрессией апоптотических путей p53 на фоне повышения активности остальных репарационных путей. Что в сумме может способствовать выживанию опухоли. 5) Для 215 экспериментальных образцов были определены уровни экспрессии эволюционно недавних мобильных элементов AluYa5, AluYb8, AluYa8, L1Hs, L1PA2, LTR5, HERV-K (HML-2), SVA по данным РНК-секвенирования. Было отобрано суммарно 20 случаев с повышенной экспрессией L1PA2 и/или L1HS и 20 случаев с пониженной экспрессией L1PA2 и/или L1HS, для которых была выделена геномная ДНК удовлетворительного качества из опухоли и соответствующей условно-нормальной ткани. Для каждого образца были получены библиотеки геномных фланков ретроэлементов AluYa5/8 и L1Hs/L1PA2. Получены результаты секвенирования с достаточным количеством прочтений на образец (в среднем около 5 млн), обогащенных последовательностями AluYa5/8 и L1Hs/L1PA2 с соответствующими геномными фланками. Но, несмотря на корректные результаты секвенирования фланков РЭ, существующие инструменты для анализа полиморфизмов и вариаций числа копий оказались не приспособлены для решения задачи поиска опухолеспецифичных копий РЭ. Поэтому планируется разработка собственных биоинформатических инструментов для детектирования новых вставок мобильных элементов. 6) Проанализирована связь экспрессии эволюционно недавних ретроэлементов AluYa5, AluYb8, AluYa8, L1Hs, L1PA2, LTR5, HERV-K (HML-2), SVA с различными показателями геномной нестабильности опухоли. Обнаружена положительная корреляция экспрессии LINE L1Hs и L1PA2 с активацией ряда репарационных путей ATR, которая может быть опосредована генами семейства APOBEC3. Обнаружена положительная корреляция экспрессии LINE L1Hs и L1PA2 с отсутствием микросателлитной нестабильности и низкой мутационной нагрузкой опухоли. В то же время наблюдается положительная корреляция экспрессии LINE L1Hs и L1PA2 с увеличением копийности ДНК (CNV gain). Это может означать, что механизмы, ответственные за накопление в опухоли изменений на нуклеотидном уровне, отражаемые параметрами МНО и МСН, могут негативно влиять на активность элементов LINE. А механизмы, связанные c изменениями на уровне сотен или тысяч нуклеотидов, выражаемые в увеличении копийности ДНК, могут приводить к повышению активности LINE, или же наоборот – экспрессия LINE может вносить вклад в повышение копийности ДНК. 7) Разработана компьютерная система, определяющая по данным РНК-секвенирования уровень экспрессии РЭ, маркеров контрольных точек иммунитета (включая PDL1), инфильтрацию опухоли иммунными клетками, МСН, уровень активации молекулярных путей репарации и мутационную нагрузку опухоли. 8) По результатам работы опубликованы две статьи в изданиях, входящих в первый квартиль (Q1). Полученные результаты также представлены на конференциях. 9) Обнаружен еще один параметр геномной нестабильности, который может быть исследован по данным РНК-секвенирования, а именно хромосомные перестройки с образованием химерных генов. В ходе работ по проекту нами были разработаны критерии для поиска химерных транскриптов рецепторных тирозинкиназ по данным транскриптомного секвенирования в опухолевых образцах.