КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 20-75-10163

НазваниеМаркеры чувствительности и резистентности рака прямой кишки к неоадъювантной терапии

РуководительАлексахина Светлана Николаевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Петрова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, г Санкт-Петербург

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2020 - 06.2023 

Конкурс№50 - Конкурс 2020 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-208 - Онкология

Ключевые словаРак прямой кишки, неоадъювантная терапия, полный патоморфологический ответ, резистентность, жидкостная биопсия

Код ГРНТИ76.29.49

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Рак прямой кишки (РПК) входит в число наиболее частых онкологических заболеваний человека. Предоперационная (неоадъювантная) химиолучевая терапия сегодня является обязательным компонентом лечения местно-распространённого РПК. Она направлена на предотвращение местных рецидивов посредством уменьшения размеров первичной опухоли и воздействия на регионарные лимфоузлы, а также на обеспечение возможности более щадящего хирургического вмешательства. Активная лечебная тактика, включающая предоперационное химиолучевое воздействие и хирургическое вмешательство, уже позволила добиться заметного снижения частоты локального прогрессирования РПК. Важнейшим показателем эффективности неоадъювантной терапии при этом является степень патоморфологического регресса опухоли. Полный патоморфологический ответ (ППО), определяемый как отсутствие опухолевых клеток в первичной опухоли и регионарных лимфатических узлах (ypT0N0), ассоциирован со значительным увеличением безрецидивной и общей продолжительности жизни больных. Регресс опухоли, однако, наблюдается лишь примерно у половины пациентов, а частота полного ответа составляет в среднем 15-20%. Клинические, биологические или молекулярные параметры, определяющие чувствительность и резистентность к химиолучевому воздействию, на данный момент неизвестны. Помимо этого, даже достижение ППО не позволяет избежать рецидива заболевания у некоторых пациентов. Данный проект направлен на разработку новых подходов, позволяющих увеличить эффективность применения неоадъювантной терапии рака прямой кишки. У некоторых пациентов даже наличие ППО или радикально выполненная операция не предотвращают развития рецидива заболевания. Мы предполагаем, что по крайней мере часть таких случаев может быть обусловлена погрешностями морфологической детекции единичных опухолевых клеток в операционном материале. Для проверки данной гипотезы архивный материал от 100 пациентов, который, по данным гистологического анализа, не содержит клеток опухоли, будет дополнительно исследован при помощи высокочувствительной молекулярной методики – цифровой капельной ПЦР. Этот метод позволяет детектировать единичные копии ДНК, содержащей опухоль-специфические мутации, на фоне значительной примеси нормальных клеток. Данный фрагмент работы позволит установить, может ли прецизионный генетический анализ повысить точность диагностики полного патоморфологического регресса и избежать ошибок в морфологической оценке краёв резекции. Ранее выявление ответа или, напротив, прогрессирования опухоли на фоне неоадъювантного лечения, могло бы способствовать оптимизации тактики лечения пациентов. В частности, при отсутствии положительного эффекта химиолучевого воздействия оправданным является незамедлительное хирургическое вмешательство. С другой стороны, возможность достоверно определить наличие полного морфологического регресса опухоли в ответ на терапию ещё до операции потенциально могла бы позволить в отдельных случаях использовать наблюдательную тактику, то есть избежать травмирующего хирургического лечения. К сожалению, ни предлагаемые до сих пор клинические и молекулярные параметры, ни применяемые сегодня методы визуализации (МРТ, ПЭТ) пока не способны достоверно предсказать эффект неоадъювантной терапии. Актуальными задачами поэтому остаются поиск маркеров чувствительности/резистентности к лечению и способов отслеживания эффекта терапии. Перспективным подходом для мониторинга и контроля результатов лечения представляется т.н. жидкостная биопсия. Помимо неинвазивного характера, к её преимуществам относится способность отразить наличие в организме опухолевых очагов, включая микрометастазы, вне зависимости от их анатомической локализации. В данном проекте предлагается апробировать жидкостную биопсию для мониторинга эффективности неоадъювантного лечения при РПК. Участниками исследования будет выполнен анализ циркулирующей ДНК с опухоль-специфическими мутациями в серийных образцах плазмы крови от 50 больных, получающих неоадъювантное лечение. По окончании работы будут сделаны выводы о возможности контролировать степень опухолевой нагрузки при помощи описанных выше циркулирующих маркеров. Ещё одним фрагментом проекта станет полноэкзомный анализ парных образцов первичных и резидуальных опухолей (n = 15), полученных до и после неоадъювантного лечения. Мы ожидаем, что сравнение мутационных профилей в этих парах, во-первых, поможет идентифицировать отдельные варианты, ассоциированные с чувствительностью или резистентностью к химиолучевому воздействию и, во-вторых, ответить на вопрос о механизмах развития устойчивости к лечению. Предшествующие исследования, выполненные в лаборатории участников проекта на карциномах яичника, свидетельствуют о том, что возникновение резистентных опухолевых клонов в ходе неоадъювантной терапии не требует появления новых мутаций. Напротив, формирование устойчивых к лечению опухолевых масс наблюдается за счёт крайне быстрой селекции и экспансии предсуществующих резистентных клеточных популяций, которые персистируют в хемонаивных опухолях в виде единичных клеток. Представляется важным установить, насколько универсальным является данный феномен, т.е. распространяется ли он на другие типы новообразований. В дополнение к этому мы планируем подвергнуть полноэкзомному анализу 10 карцином прямой кишки, которые продемонстрировали полный морфологический ответ на неоадъювантную терапию. Мы ожидаем, что сопоставление спектра соматических мутаций в этих опухолях с профилем генетических событий, который наблюдается в РПК с умеренным ответом на лечение (см. выше), позволит выявить маркеры и механизмы эффективности предоперационной терапии.

Ожидаемые результаты
Проект направлен на изучение различных аспектов неоадъювантной терапии при раке прямой кишки (РПК). На основании высокочувствительного молекулярного анализа операционного материала посредством цифровой капельной ПЦР будет установлено, имеют ли место погрешности морфологической детекции единичных опухолевых клеток, и может ли тестирование опухоль-специфических мутаций повысить точность диагностики полного патоморфологического регресса опухоли. Будет оценена динамика концентрации циркулирующей опухолевой ДНК в процессе лечения и проанализировано предиктивное/прогностическое значение соответствующих молекулярных маркеров. В частности, будет изучена связь между наличием полного патоморфологического ответа РПК на терапию и исчезновением опухолевой ДНК из кровотока. Будет установлено, отражает ли динамика присутствия в периферической крови опухоль-специфических мутаций эффективность хирургического вмешательства и вероятность возникновения рецидива РПК. При выявлении ассоциаций с результатами неоадъювантного и/или оперативного воздействия жидкостная биопсия может быть использована как дополнительный метод при принятии решения о модификации тех или иных схем лечебных мероприятий. При помощи экзомного секвенирования будут охарактеризованы мутационные профили первичных и резидуальных опухолей после неоадъювантного лечения, а также сопоставлены спектр и количество соматических мутаций у пациентов с полным патоморфологическим ответом и без выраженного эффекта терапии. В результате данного фрагмента проекта могут быть идентифицированы отдельные варианты или мутационные паттерны, ассоциированные с чувствительностью или резистентностью к химиолучевому воздействию. Подобные предиктивные маркеры необходимы для обоснованного назначения или отказа от неоадъювантной терапии.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Колоректальный рак занимает одно из ведущих мест в онкологической заболеваемости во всём мире, при этом около трети случаев приходится на рак прямой кишки. Благодаря активной лечебной тактике, включающей предоперационную химиолучевую терапию и хирургическое вмешательство, в последнее десятилетие удалось достичь заметного снижения частоты локальных рецидивов при местно-распространённом раке прямой кишки (РПК). Так как полного патоморфологического регресса, и, соответственно, значительного улучшения прогноза, удаётся добиться лишь у части пациентов, важной задачей представляется расшифровка причин вариабельной чувствительности опухолей к химиолучевому воздействию. Биологические особенности новообразований, связанные с ответом на терапию, в большой степени обусловлены генетическим портретом опухоли. Проект направлен на изучение некоторых существенных аспектов неоадъювантной химиолучевой терапии (НХЛТ) при раке прямой кишки (РПК) и разработку новых подходов, направленных на улучшение эффективности этого метода лечения. За отчетный период на базе НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова организован проспективный набор пациентов для создания коллекции серийных образцов плазмы крови. Данная коллекция будет использована на следующих этапах проекта для мониторинга эффекта НХЛТ с помощью анализа опухоль-специфических нуклеиновых кислот методом цифровой капельной ПЦР. Выполнен анализ историй болезней пациентов, получавших НХЛТ на базе НМИЦ онкологии. Сформированы ретроспективные коллекции образцов пациентов с минимальным ответом на терапию (n=101, парные образцы до/после лечения), идет подготовка патоморфологического материала пациентов с полным патоморфологическим ответом (n=22) для дальнейшего молекулярно-генетического анализа. Для парных образцов выполнен молекулярно-генетический анализ мутационного статуса драйверных генов KRAS, NRAS, BRAF. Определено, что воздействие неоадъювантной терапии не приводит к изменению статуса драйверных мутаций после лечения. Анализ аллельной частоты в образцах с двумя мутациями позволяет предположить, что небольшая доля колоректальных опухолей содержит более одной мутации в генах KRAS, NRAS, BRAF, что скорее иллюстрирует внутриопухолевую гетерогенность, чем биаллельную активацию этих генов.

 

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Колоректальный рак занимает одно из ведущих мест в онкологической заболеваемости во всём мире, при этом около трети случаев приходится на рак прямой кишки. Благодаря активной лечебной тактике, включающей предоперационную химиолучевую терапию и хирургическое вмешательство, в последнее десятилетие удалось достичь заметного снижения частоты локальных рецидивов при местно-распространённом раке прямой кишки (РПК). Так как полного патоморфологического регресса, и, соответственно, значительного улучшения прогноза, удаётся добиться лишь у части пациентов, важной задачей представляется расшифровка причин вариабельной чувствительности опухолей к химиолучевому воздействию. Биологические особенности новообразований, связанные с ответом на терапию, в большой степени обусловлены генетическим портретом опухоли. За отчетный период завершено формирование ретроспективной коллекции образцов опухолей прямой кишки, продемонстрировавших полный патоморфологический ответ (ППО) после неоадъювантной терапии. Выполнен молекулярно-генетический анализ драйверных мутаций в генах KRAS, NRAS, BRAF в образцах опухолей из группы ППО. Частота мутаций KRAS в данной группе составила 57,9% (11/19), что сопоставимо с частотой мутаций KRAS в группе опухолей с частичным ответом – 52,5% (53/101), p=0.189. Для всех образцов с KRAS мутациями был выполнен анализ участков терапевтического патоморфоза методом цифровой капельной ПЦР. Единичные мутантные копии были обнаружены в 8/11 (72.7%) случаях. Процентное содержание мутантных опухоль-специфических фрагментов колебалось от 0,15% до 0,5%. Наличие единичных мутантных фрагментов не коррелировала с последующим рецидивом или другими клиническими факторами. Для дальнейшего изучения данного явления запланировано выполнить анализ дополнительных опухоль-специфических мутаций в этих образцах. Продолжается набор серийных образцов плазмы крови пациентов, получающих неоадъювантную химиолучевую терапию.

 

Публикации

1. Кулигина Е., Моисеенко Ф., Белухин С., Степанова Е., Захарова М., Чернобривцева В., Алиев И., Шарабура Т., Моисеенко В., Алексахина С., Лайдус Т., Мартьянов А., Холматов М., Вайтхед А., Янус Г., Имянитов Е. Tumor irradiation may facilitate the detection of tumor-specific mutations in plasma World J Clin Oncol, Vol. 12(12), P. 1215-1226 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.5306/wjco.v12.i12.1215

2. Митюшкина Н.В., Янус Г.А. Кулигина Е.Ш., Лайдус Т.А., Романько А.А., Холматов М.М., Иванцов А.О., Алексахина С.Н., Имянитов Е.Н. Preparation of Duplex Sequencing Libraries for Archival Paraffin-Embedded Tissue Samples Using Single-Strand-Specific Nuclease P1 International Journal of Molecular Sciences, Vol. 23(9), P. 4586 (1-14). (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/ijms23094586

3. Имянитов Е.Н., Алексахина С.Н., Мартьянов А.А., Кузовенкова Д.А., Самсонов Д., Ивко О.В., Карачун А.М. The analysis of driver mutations in paired samples of rectal carcinomas obtained before and after neoadjuvant chemoradiotherapy Annals of Oncology, Vol. 32, Suppl. 5, P. S539 (406P) (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.annonc.2021.08.927

4. Имянитов Е.Н., Лайдус Т.А., Моисеенко Ф.В., Белухин С., Степанова Е., Захарова М., Чернобритцева В., Алиев И., Шарабура Т., Моисеенко В.М., Алексахина С.Н., Мартьянов А.А., Янус Г.А., Того А.В., Кулигина Е.Ш. Tumor irradiation may improve the sensitivity of liquid biopsy: The analysis of RAS/RAF mutations in plasma obtained from radiotherapy-treated rectal cancer patients Annals of Oncology, Vol. 32, Suppl. 5, P. S1220 (1785P) (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.annonc.2021.08.1728

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На завершающем этапе проекта были подведены предварительные итоги проспективного исследования маркеров, позволяющих предсказать ответ на неоадъювантную химиолучевую терапию неоперабельных опухолей прямой кишки. Цель данной терапии – как минимум, перевести опухоль в статус операбельного новообразования, а при наилучшем стечении обстоятельств – добиться полного клинического ответа на лечение, позволяющего избежать инвалидизирующего хирургического вмешательства. К концу третьего года проекта мы набрали 38 пациентов с распространенным раком прямой кишки, которым было запланировано проведение предоперационной терапии. До начала лечения у больных проводился забор плазмы с целью выявления циркулирующей опухолевой ДНК. Перед началом лечения у пациентов при МРТ-исследовании оценивались также параметры CRM (circular resection margin, CRM; циркулярный край резекции) и EMVI (extramural vascular invasion, экстрамуральная сосудистая инвазия). На момент отчета терапия была завершена у 30 пациентов: у четырех пациентов по результатам контрольного обследования был достигнут полный ответ, у остальных пациентов наблюдался частичный регресс опухоли разной степени выраженности (TRG2: n = 2; TRG3: n = 15; TRG4: n = 9). 26 пациентам с частичным клиническим ответом было проведено оперативное лечение и определен патоморфологический регресс. Выраженный патоморфологический ответ (AJCC TRG1) наблюдался у 4/26 (15%) прооперированных пациентов. Для пациентов, первичные опухоли которых содержали драйверные мутации, было выполнено исследование содержания цоДНК в плазме крови с использованием индивидуальных тестов на основе цифровой капельной ПЦР. Было продемонстрировано, что количество опухоль-специфической цоДНК до начала терапии коррелирует со степенью патоморфологического ответа на неоадъювантную терапию. Было также отмечено, что у пациентов категории EMVI+ (с врастанием опухоли в кровеносные сосуды) вероятность обнаружения цоДНК в плазме крови выше. К моменту окончания предоперационной терапии у всех пациентов содержание мутантных копий цоДНК снижалось ниже порога обнаружения. В настоящий момент все пациенты проспективной группы продолжают динамическое наблюдение; ремиссия наблюдается у всех пациентов, прошедших оперативное лечение и пациентов, продемонстрировавших полный клинический ответ. За отчетный период был завершен полноэкзомный анализ опухолей пациентов, продемонстрировавших частичный и полный патоморфологический ответ (ППО) на неоадъювантную терапию. Основной задачей полноэкзомного анализа являлось определение особенностей молекулярно-генетических профилей первичных опухолей, полностью ответивших на предоперационную терапию или продемонстрировавших только частичный регресс. Однако достоверных различий в встречаемости драйверных мутаций в группе частичного и полного ответа обнаружено не было. Второй задачей этого этапа проекта стало выявление изменений, произошедших в опухолях в процессе неоадъювантной терапии. Наиболее перспективной с точки зрения дальнейшего изучения является мутация в гене CDC27 – было продемонстрировано ее появление в 5 из 9 парных случаев. Известно, что дизрегуляция CDC27 (как инактивация, так и активация) может быть связана с химиорезистентностью и пониженной радиочувствительностью клеток. Таким образом мутации в гене CDC27 представляются перспективным маркером для динамического контроля в плазме крови на разных этапах терапии пациентов с опухолями прямой кишки.

 

Публикации

1. Имянитов Е.Н., Анускина А.А., Иевлева А.Г., Митюшкина Н.В., Мулкиджан Р.С., Преображенская Е.В., Романько А.А., Саитова Е., Тюрин В.И. Spectrum of druggable gene fusions in microsatellite-unstable colorectal tumors Annals of Oncology, Annals of Oncology, 2022, Vol. 33, Suppl. 7, P. S593 (121P) (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1016/j.annonc.2022.07.153

2. Тюрин В.И., Алексахина С.Н., Анускина А.А., Иевлева А.Г., Кривошеева Е.А., Митюшкина Н.В., Преображенская Е.В., Романько А.А., Саитова Е.С., Мулкиджан Р.С., Имянитов Е.Н. Исследование клинически значимых перестроек (ALK, ROS1, RET) в MSI+ колоректальных опухолях Вопросы онкологии, Вопросы онкологии, 2022, Т. 68, № S3, С. 358-359. (год публикации - 2022)

Возможность практического использования результатов
не указано