Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Задачами проекта-продления в 2020-2021 году являлись разработка подходов к комплексному анализу структурно-функциональных изменений в дифференцирующихся 3D дермальных и нейральных моделях, 3D моделях из ИПСК человека с наследственными нейродегенеративными заболеваниями (синдром Дауна, риск ранней болезни Альцгеймера) методами флуоресцентного имиджинга, FLIM и PLIM, а также получение данных по функциональным (внутриклеточный рН, метаболизм и уровень кислорода) и структурным (вязкость мембранных структур и ультраструктура цитоскелета) изменениям в дифференцирующихся 3D дермальных и нейральных моделях, 3D моделях из ИПСК человека с наследственными нейродегенеративными заболеваниями. Все заявленные на 2020-2021 гг задачи выполнены в полном объеме. При выполнении 1 этапа проекта-продления в 2020-2021 гг были получены следующие результаты. Получены и охарактеризованы дермальные 3D культуры, дифференцированные из ИПСК (сфероиды и дермальные эквиваленты), а также нейральные 3D системы (нейросферы из нейральных стволовых клеток (НСК)) и 3D модели из ИПСК человека с наследственными нейродегенеративными заболеваниями (синдром Дауна (СД)).Были разработаны подходы к комплексному анализу структурно-функциональных показателей (внутриклеточный рН, вязкость мембранных структур и ультраструктура цитоскелета, метаболизм и уровень кислорода) в 3D дермальных и нейральных моделях, 3D моделях из ИПСК человека с СД методами флуоресцентной микроскопии, FLIM и PLIM. В результате были подобраны оптимальные условия окрашивания (концентрация флуоресцентных красителей, время инкубации), а также параметры съемки для оценки вышеуказанных параметров в трехмерных моделях, полученных из ИПСК. Был проведен анализ метаболического статуса клеток в составе нейральных сфероидов со средними размерами 200 мкм и 600 мкм, сфероидов с СД и дермальных трехмерных моделей по отношению интенсивности флуоресценции ФАД к НАД(Ф)Н (redox ratio), временам жизни флуоресценции (τ1, τ2) и вкладам времен жизни флуоресценции (α1, α2) НАД(Ф)Н с использованием метода FLIM. При оценке нейральных 3D моделей разного размера, провели сравнительных анализ значений показателей на периферии и в центре сфероидов. Было показано, что нет статистически значимого отличия по редокс-отношению между НСК расположенными в центре и на периферии сфероидов с диаметром 200 мкм. Следует отметить, что НСК, культивируемые в 3D-условиях, имели более высокое редокс-отношение по сравнению к НСК в монослое. Соответствующее увеличение редокс-отношения в НСК при изменении условий культивирования на трехмерные указывает на метаболический сдвиг в сторону окислительного фосфорилирования (ОКФОС). Анализ FLIM данных показал, вклад времени жизни флуоресценции связанной формы НАД(Ф)Н (α2,%) различается между клетками, расположенными на периферии и в центре больших сфероидов. Таким образом, НСК на периферии имеют более гликолитический фенотип, чем НСК в центре сфероида. Интересно, что НСК (как на периферии, так и в центре), сформированные в сфероиды размером 200 мкм, характеризуются преобладанием окислительного фосфорилирования в энергетическом обмене. В этих сфероидах вклад времени жизни флуоресценции связанной формы НАД(Ф)Н выше, чем в НСК, культивируемых в монослое или в формате больших нейросфер. Кроме того, НСК, расположенные в центре большого сфероида, существенно отличаются от НСК в монослое, в котором, в свою очередь, метаболический статус смещен в сторону ОКФОС. Таким образом, описанные метаболические изменения указывают на более гликолитический фенотип НСК в монослое и на периферии больших сфероидов и на преобладание окислительного фосфорилирования в НСК в центре больших сфероидов и в НСК, сгруппированных в маленькие сфероиды. Для сфероидов, полученных из ИПСК человека с СД, оценка redox ratio показала, что значения этого параметра выше в нейросферах, созданных из здоровых НСК по сравнению с нейросферами с СД, где наблюдается гетерогенность этого параметра при увеличении от периферии к центру. Это указывает на то, что нейросферы с СД характеризуются более гликолитическим фенотипом, чем здоровые. Кроме того, мы продемонстрировали, что клетки с СД в 3D-модели характеризуются более низкими значениями a2, чем здоровые НСК, культивируемые в идентичных условиях, что также указывает на их более гликолитический статус. Оценка общего метаболического статуса клеток в дермальных сфероидах по редокс-отношению показала, среднее значение данного показателя в сфероидах из клеток дермальной папиллы, дифференцированных из ИПСК (iDP) близко к таковому в первичных клеток дермальной папиллы человека (hDP). Для дермальных эквивалентов редокс-отношение в iDP статистически значимо отличалось от hDP. Более детальный анализ метаболизма с помощью FLIM данных выявил наличие статистически значимого различия по вкладу во время жизни флуоресценции связанной формы НАД(Ф)Н (а2, %) между клетками на периферии сфероидов из hDP от клеток в центре, что указывает на более гликолитический статус hDP расположенных на периферии дермальных сфероидов. В сфероидах из iDP разности по FLIM показателям клеток, расположенных на периферии, от клеток в центре не было обнаружено. Среднее значение вклада во время жизни флуоресценции связанной формы НАД(Ф)Н указывает на преобладание гликолиза в энергетическом метаболизме. Для дермальных эквивалентов можно говорить о переключении на ОКФОС в iDP и hDP. Оценка уровня кислорода проводилась в указанных 3D моделях по времени фосфоресценции BTPDM1 (τph) с использованием PLIM метода. Было показано, что оксигенация крупных нейральных сфероидов (~ 600 мкм) неоднородна: в центре сфероидов находятся области со средним временем жизни фосфоресценции от 2200 до 2600 нс, а на периферии средние значения параметра ниже (~ 1900 нс). Более длинное время жизни фосфоресценции красителя в центре сфероида по сравнению с периферией указывает на более низкий уровень кислорода в этой области. Можно отметить отсутствие гипоксических участков в центре сфероидов со средним размером 200 мкм. Среднее время жизни фосфоресценции меньших нейральных сфероидов (~ 200 мкм) составило 1800 нс. Таким образом, в этой трехмерной модели нет неоднородности τph, что указывает на равномерное распределение кислорода. В нейральных сфероидах с СД также наблюдали градиент распределения кислорода с уменьшением к центру. На периферии сфероидов τph были ниже и составляли от 1000 до 1500 нс, а в центре находились области со средним значением параметра 1900 ± 50 нс. Уровень кислорода в сфероидах с СД ниже, чем в «здоровых» нейросферах. В дермальных сфероидах как из hDP, так и iDP, из-за их небольшого размера (~ 150 мкм), распределение кислорода было равномерное. Среднее время жизни фосфоресценции составило 1149,11±261,84 нс для сфероидов из hDP и 1826,29±242,64 нс для сфероидов из iDP. Полученные результаты согласуются с известным фактом, что сфероиды размером 200 мкм или меньше характеризуются нормальным транспортом кислорода и питательных веществ. Клетки в коллагеновом геле имели более высокий уровень оксигенации, чем в сфероидах. Жизнеспособность клеток при культивировании в 3D-условиях, а также отсутствие токсичности BTPDM1 для клеток подтверждали окрашиванием кальцеином и пропидием йодидом сразу после оценки уровня оксигенации. Live/dead анализ выявил наличие мертвых клеток в сфероидах всех типов. Однако, некротических ядер в центре сфероидов обнаружено не было. Получены данные о внутриклеточном рН в 3D дермальных (сфероидах и эквивалентах) и нейральных моделях, 3D моделях из ИПСК человека с СД. В нейральных сфероидах наблюдали статистически значимое различие между значениями рН на периферии сфероидов и в центре: рН –7,19±0,04 и рН – 7,11±0,06, соответственно. Полученный результат хорошо коррелирует с данными по метаболическому статусу клеток в нейросфрах. Так более щелочные значения внутриклеточного рН на периферии нейральных сфероидов соотносятся с преобладанием гликолиза, а для клеток в центральной части сфероидов, где преобладает ОКФОС, характерны более кислые значения рН. В 3D моделях из ИПСК человека с СД значение рН составило рН-7,0±0,64. В нашем случае полученные данные о внутриклеточном рН не согласуются с данными о метаболическом статусе этих клеток. В нейросферах с синдромом Дауна преобладает гликолиз, как основной путь синтеза АТФ, что в свою очередь должно приводить к защелачиванию цитоплазмы клеток. Известно, что внутриклеточный рН поддерживается благодаря работе ионных транспортеров. Одним из таких является Na+/H+ антипорт, который переносит протоны из клетки тем самым увеличивая внутриклетоный рН. Na+/H+ антипорт является АТФ зависимым, уменьшение концентрации АТФ приводит к резкому снижению его активности. Также было показано, что астроциты мышей Ts1Cje с синдромом Дауна характеризуются более низким уровнем АТФ. Таким образом, в нашем случае более кислые значения рН могут быть связаны с низким уровнем АТФ и, как результат, снижением активности ионных транспортеров. В дермальных сфероидах и эквивалентах созданных из iDP абсолютные значения рН составили 7,56±0,7 и 7,56±0,81 соответственно. Также были получены данные при анализе 3D дермальных моделей из hDP. В соответствии с калибровочной кривой рН клеток в составе сфероидов составил 7,57±0,31, а в эквивалентах – 7,2±0,54. Как видно из полученных данных рН клеток в сфероидах из iDP и hDP и эквивалентах с iDP принимает близкие значения, а также является более щелочным по сравнению рН клеток iDP культивируемых в монослое (7,28±0,21). Щелочные значения рН могут свидетельствовать о переключении метаболизма на гликолиз, как основной путь синтеза АТФ. Кроме того, полученные данные согласуются с нашими данными о метаболическом статусе клеток в дермальных трехмерных моделях. Так, более гликолитический статус hDP и iDP в дермальных сфероидах соотносится с щелочными значениями внутриклеточного рН в данных клетках. Для дермальных эквивалентов, более кислые значения внутриклеточного рН hDP соответствуют переключению метаболизма на ОКФОС в данных клетках. Получены данные о вязкости цитоплазматической мембраны в изучаемых 3D моделях на основе метода FLIM и молекулярного ротора BODIPY C3++. Анализ микровязкости цитоплазматической мембраны клеток был проведен по изменению времени жизни молекулярного ротора BODIPY C3++. В соответствии с калибровочной кривой вязкость клеток в нейросферах составила 280,71±18,43 сПз. У клеток в сфероидах с СД значения микровязкости мембран принимали большие значения (465,75±1,32 сПз) по сравнению со здоровыми клетками в нейросферах. В дермальных трехмерных моделях вязкость мембраны у hDP и iDP в сфероидах в соответствии с калибровочной кривой принимали значения 363,66±0,24 и 444,22±18,68 сПз. У клеток hDP и iDP в коллагеновом геле значения вязкости мембраны составили 301,1±11,02 и 308,15±16,43, соответственно. Анализ структуры актинового цитоскелета в исследуемых трехмерных моделях выполняли с использованием Alexa Fluor 488 Phalloidin и флуоресцентной микроскопии. В нейросферах хорошо выделялись более толстые и длинные актиновые волокна на периферии клеток. Так как в сфероидах расположение самих клеток плотное, то они образуют большое количество межклеточных контактов. В сфероидах с СД лучше развит актиновый цитоскелет в клетках расположенных на периферии сфероида. У поверхностных клеток есть пространство для распластывания. Клетки на периферии более крупные, а актиновые волокна в них разнонаправленные и заполняют всю клетку целиком. Ближе к центру плотность клеток увеличивается и весь актиновый цитоскелет сконцентрирован рядом с плазматической мембраной, для увеличения клеточной жесткости. В дермальных сфероидах из iDP клетки сгруппированы не плотно, нижние клетки адгезировались к пластику и структура актинового цитоскелета в них имеет типичную морфологию характерную для монослоя. Волокна длинные, тянутся через всю клетку и утолщаются на концах. В дермальных сфероидах из hDP волокна актина концентрированы на периферии, ближе к плазматической мембране. У iDP и hDP в дермальных эквивалентах клетки слабо распластывались в коллагеновом геле, вероятно из-за низкой концентрации коллагена в гидрогеле, однако удалось выделить более толстые волокна актина на периферии. Известно, что на формирование цитоскелета влияет клеточное микроокружение. Чем больше давление извне, тем больше и толще волокна расположенные на периферии клеток, увеличивая их жесткость. По результатам 1го этапа проекта-продления опубликованы 2 статьи, входящие в базы Wos и Scopus (одна из них в Q1), 1 публикация (Wos и Scopus) принята и будет опубликована в июне 2021 года. Достигнутые научные результаты представлены на 2х международных конференциях с устными докладами и 1м семинаре.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Целью проекта в 2021-2022 гг. являлась разработка подходов к комплексному анализу структурно-функциональных изменений (внутриклеточный рН, вязкость мембранных структур и структура цитоскелета, метаболизм и уровень кислорода) в 3D эпидермальных и эндотелиальных моделях методами флуоресцентной микроскопии, FLIM и PLIM. Все заявленные в проекте задачи и публикационные индикаторы выполнены полностью. При выполнении второго этапа проекта получены следующие результаты: Были разработаны подходы к комплексному анализу структурно-функциональных показателей (внутриклеточный рН, вязкость мембранных структур и структура цитоскелета, метаболизм и уровень кислорода) в 3D эпидермальных и эндотелиальных моделях методами флуоресцентной микроскопии, FLIM и PLIM. В результате работы были подобраны оптимальные условия окрашивания (концентрация флуоресцентных красителей, время инкубации), а также параметры съемки для оценки вышеуказанных параметров в трехмерных моделях на основе ИПСК с использованием методов флуоресцентной микроскопии, FLIM и PLIM, которые в дальнейшем могут быть использованы в исследованиях при анализе клеточных параметров при моделировании заболеваний, тестировании лекарственных препаратов, анализе регенерации тканей и органов. Получены данные по функциональным (метаболизм, внутриклеточный рН и уровень кислорода) и структурным (вязкость мембранны и структура цитоскелета) показателям клеток в 3D эпидермальных и эндотелиальных моделях. Были получены и охарактеризованы эпидермальные 3D модели (кератиноциты на коллагеновом геле) с дифференцированными из ИПСК и нативными кератиноцитами человека, а также эндотелиальные 3D модели (эндотелиальные сфероиды) из клеток, дифференцированных из ИПСК. Во всех трехмерных моделях были исследованы: энергетический метаболизм по интенсивности флуоресценции НАД(Ф)Н и ФАД (redox ratio – IФАД/IНАД(Ф)Н), временам жизни флуоресценции и вкладам времен жизни флуоресценции НАД(Ф)Н; внутриклеточный рН по интенсивности флуоресценции SypHer-2 или BCECF; уровень кислорода по времени жизни фосфоресценции красителя BTPDM1; вязкость плазматической мембраны по времени жизни флуоресценции Bodipy C3++ и структура цитоскелета по флуоресценции Alexa Fluor 488 Phalloidin. В клетках эндотелиальных сфероидов наблюдали увеличение редокс-отношения по сравнению с монослоем, что может быть связано с усилением общей метаболической активности клеток, благодаря созданию определенного микроокружения. Однако вклад во времена жизни флуоресценции связанной формы НАД(Ф)Н (α2,%) в сфероидах оказался ниже, чем в монослое, что все-таки указывает на более гликолитический статус клеток в сфероидах. В соответствии с калибровочной кривой для BCECF уровень внутриклеточного рН в эндотелиальных сфероидах принимал более щелочные значения, что согласуется с FLIM данными НАД(Ф)Н о гликолитичном статусе клеток в 3D модели. Оценка уровня кислорода с использованием BTPDM1 и РLIM в эндотелиальных сфероидах показала, что значения показателя (τph=2086.43±179,95 нс) находятся в пределах физиологической нормы. Также внутри сфероида были отмечены участки с большей и меньшей оксигенацией. Среднее значение вязкости мембраны клеток в эндотелиальных сфероидах составила 234,75±10,67 сПз. Полученные нами низкие значения микровязкости мембраны, могут быть связаны как с получением данных эндотелиальных клеток в процессе дифференцировки из ИПСК, так и с особенностями цитоскелета в данных сфероидах. В клетках эндотелиальных сфероидов мы не наблюдали четко организованных актиновых волокон, что может быть связано с неплотной структурой и слабыми межклеточными и/или клеточно-матричными взаимодействиями в эндотелиальных сфероидах. Оценка общего метаболического статуса клеток в эпидермальных 3D моделях по редокс-отношению показала, среднее значение данного показателя в дифференцированных из ИПСК кератиноцитах (iKC) выше, чем в монослое, что говорит о преобладании окислительного фосфорилированя (ОКФОС). Вклад во время жизни флуоресценции связанной формы НАД(Ф)Н (α2 %) в дифференцированных и нативных кератиноцитах в 3D моделях принимал схожие значения. Кроме того, значения данного параметра имели близкие значения со средними значениями а2 в монослое, что может говорить о преобладании ОКФОС в энергетическом метаболизме кератиноцитов обоих типов. Уровни внутриклеточного рН в дифференцированных и нативных кератиноцитах в 3D моделях составили 7,18±0,48 и 7,30±0,52, что подтверждает окислительный метаболизм клеток. Оценка уровня кислорода в эпидермальных 3D моделях с дифференцированными и нативными кератиноцитами показала, что значения показателя находятся в пределах физиологической нормы. Анализ вязкости плазматической мембраны выявил различия между дифференцированными и нативными кератиноцитами, что может быть связанно с плотностью клеточного слоя на поверхности коллагенового геля. Также были получены данные о структуре цитоскелета клеток в эпидермальных 3D моделях. В дифференцированных и нативных кератиноцитах не наблюдали отчетливых стресс-фибрилл, однако были отмечены утолщения волокон F-актина на периферии клеток обоих типов.