КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-75-20102

НазваниеРоль каспазы-2 и ее пост-трансляционных модификаций в регуляции гибели раковых клеток, индуцируемой химиотерапевтическими препаратами

РуководительКопеина Гелина Сергеевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2020 - 06.2022 

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-101 - Экспериментальная медицина

Ключевые словаРак, апоптоз, каспаза, высокомолекулярный комплекс, пост-трансляционная модификация, фосфорилирование, убиквитинилирование.

Код ГРНТИ34.15.51


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Проект направлен на изучение роли пост-трансляционных модификаций (ПТМ) в регуляции функций и активности каспазы-2, инициирующей апоптотическую гибель раковых клеток в ответ на различные индукторы и в первую очередь на ДНК-повреждающие химиотерапевтические препараты. Каспаза-2 обладает рядом уникальных свойств по сравнению с другими белками данного семейства. Так, каспаза-2 - единственная из белков этого семейства, которая обладает сигналом ядерной локализации, а также субстратной специфичностью, присущей как инициаторным, так и эффекторным каспазам. Этот фермент играет одну из ключевых ролей в запуске апоптоза в клетках в ответ на обработку ДНК-повреждающими препаратами, а также индукторами, вызывающими стресс эндоплазматического ретикулума. Кроме того, каспаза-2 обладает онкосупрессорными функциями, участвует в поддержании генетической стабильности и регуляции клеточного цикла, ответа клетки на окислительный стресс. Недавно было показано, что каспаза-2 играет существенную роль в регуляции плоидности клеток и регенерации тканей печени после хирургического вмешательства. Несмотря на очевидную важность онкосупрессорных и проапоптотических функций каспазы-2 до сих пор до конца не выяснен механизм активации этого фермента. Известно также, что нарушение функционирования механизмов гибели клеток связано с устойчивостью патологических клеток к терапии. Хотя многие молекулярные механизмы определенных видов клеточной гибели известны, их контроль за счет пост-трансляционных модификаций, как фундаментального механизма регуляции активности жизненно-важных молекулярных путей, остается слабо изученным. В результате выполненных нами работ по проекту было показано, что из отобранных с помощью биоинформатического анализа 9 аминокислотных остатков, которые могут быть потенциально фосфорилированы, лишь один – серин 384 – оказывал существенное влияние на процесс активации каспазы-2. Замена S384A в последовательности каспазы-2 практически полностью подавляла ферментативную активность каспазы-2 при индукции апоптоза генотоксическим стрессом. Эксперименты по гибели клеток подтвердили, что мутация S384A в каспазе-2 достоверно снижала уровень апоптоза, вызванного химиотерапевтическим препаратом. Однако, замена на фосфомиметик и анализ с помощью Phos-tag технологии не подтвердили наличие фосфорилирования каспазы-2 по позиции S384, несмотря на ключевую роль этого остатка в активации фермента. Следовательно, необходимо дальнейшее изучение механизма его влияния на активацию каспазы-2. В предлагаемом продолжении проекта предполагается проверить наличие фосфорилирования прямым методом детекции – масс-спектрометрическим анализом фосфорилированных остатков и последующим протеомным анализом. В случае подтверждения фосфорилирования S384 будет проведен скрининг киназ, способных фосфорилировать этот остаток в контексте соседствующих аминокислотных остатков. Также предполагается провести анализ трехмерной структуры каспазы-2 с помощью метода молекулярной динамики, что позволит оценить влияние остатка S384 на активный центр изучаемого фермента. Одновременно, будет проведен эволюционный анализ положения S384 с целью оценки консервативности данного положения в каспазах и его потенциального влияния на активность белков данного семейства. Более того, будет рассмотрена скорость мутаций этого остатка в базе данных TCGA Research Network, позволяющей оценить частоту изменений того или иного положения в белках при злокачественном перерождении клеток. В совокупности полученные данные позволят понять механизм, по которому S384 критически влияет на активацию каспазы-2, и почему его замена приводит к снижению чувствительности опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам и повышению злокачественной перерождения клеток. Другим направлением исследования будет исследование другого типа ПТМ, а именно, убиквитинилирования каспазы-2. В рамках выполненного проекта нами было детектировано взаимодействие каспазы-2 и р62, убиквитинилирование каспазы-2, а также её протеасомная деградация. В связи с этим возник вопрос: опосредует ли р62 деградацию каспазы-2 или у их взаимодействия другая функция? Эксперименты показали, что р62 опосредует деградацию каспазы-2 в норме и при генотоксическом стрессе, однако остался открытым вопрос, происходит ли это по аутофагическому пути или в протеасомах. Для решения данного вопроса мы планируем применять линию клеток, нокаутированную по гену ATG13 с помощью технологии CRISPR/Cas9, поученную в нашей лаборатории. Оверэкспрессия конструкции гена р62 в данной линии и дальнейший анализ действии данного белка на уровень каспазы-2 даст ответ, усиливается ли деградация данного белка в аутофагосомах. В случае усиления аутофагосомной деградации будет проведен анализ с помощью конфокальной микроскопии колокализации каспазы-2 и аутофагосом. Для этого будет создана специальная система детекции аутофагосом с помощью конструкции LC3-GFP (LC3 – один из основных белков мембраны аутофагосом, GFP – зеленый флуоресциирующий белок). В случае подтверждения протеасомной деградации будет проанализирован уровень К48 убиквитинилирования. Более того, ассоциация каспазы-2 с убиквитин-связывающим белком р62 может приводить не только к деградации по тому или иному пути, но и вызывать активацию каспаз, например, такой механизм был показан для инициаторной каспазы-8. Далее будет проверена возможность активации каспазы-2 при взаимодействии с р62 с помощью плазмид, позволяющих детектировать первый этап активации, а именно димеризацию проформы данного фермента. Третьим этапом исследований ПТМ каспазы-2 станет исследование ее роли в детекции повреждений ДНК. На предыдущем этапе было выяснено, что моноубиквитинилированная форма каспазы-2 локализуется в ядре клеток и, возможно, участвует в регуляции фосфорилирования гистона Н2АХ при генотоксическом стрессе. Накопление фосфорилированного гистона Н2АХ (gammaH2AX) является ключевым маркером повреждений ДНК. Для исследования данного вопроса будут проанализированы уровни активации киназ АТМ, ATR, DNA-PK и JNK, участвующих в фосфорилировании Н2АХ, в клетках либо нокаутных по каспазе-2, либо оверэкспрессирующих этот белок. Также будет изучена возможность непосредственного взаимодействия каспазы-2 и Н2АХ с целью выявить комплексы, регулирующие фосфорилирование Н2АХ. Данный анализ будет проводиться с помощью иммунопреципитации и аффинной хроматографии. Будет определена колокализация каспазы-2 и gammaН2АХ в опухолевых клетках человека, а также продемонстрирована роль каталитической функции каспазы-2 в детекции повреждений ДНК через фосфорилирование Н2АХ. Также будут получены новые нокаутированные по гену каспазы-2 линии клеток для доказательства широты наблюдаемого феномена. Физиологическое значение каспазы-2 для детекции повреждений ДНК будет продемонстрировано на нокаутной по каспазе-2 мыши, ранее выведенной в нашей лаборатории. Более того, корреляция между уровнем каспазы-2 и теми белками, работу которых она регулирует в ходе детекции повреждения ДНК, планируется проверить на образцах опухолей, полученных от пациенток с карциномой яичника. Данный тип опухоли выбран для работы поскольку корреляция между каспазой-2 и уровнем фосфорилирования Н2АХ была выявлена на линии карциномы яичника Caov-4. В результате будет установлена физиологическая роль каспазы-2 на уровне целого организма. Таким образом, предлагаемое исследование позволит раскрыть механизмы действия химиотерапевтических препаратов за счет регуляции функций каспазы-2 на уровне ее пост-трансляционных модификаций.

Ожидаемые результаты
В результате проведённых исследований будут выполнены следующие задачи: 1) Будет выяснена роль потенциально фосфорилируемого остатка серина 384 в ходе процессинга и активации каспазы-2 на молекулярном уровне. На предыдущем этапе было установлено, что замена данного остатка блокирует активацию каспазы-2, однако замена на фосфомиметик и анализ с помощью Phos-tag технологии не подтвердили наличие фосфорилирования каспазы-2 по позиции S384. Поэтому, конкретный механизм регуляции активности каспазы-2 за счет остатка S384 будет исследован с помощью протеомного анализа и молекулярного моделирования. 2) Будет проанализирована эволюционная консервативность остатка серина 384 для понимая функционирования всего семейства каспаз. Также будет проанализирована корреляция между частотой возникновения мутаций по положению S384 и возникновением того или иного типа опухоли. В будущем данная корреляция может быть использована как прогностический фактор возникновения злокачественных заболеваний. 3) Будет исследован конкретный путь деградации каспазы-2 после ее убиквитинилирования при генотоксическом стрессе. В ходе реализации предыдущего проекта мы выяснили, что каспаза-2 подвергается убиквитинилированию, взаимодействует с убиквитин-связывающим белком р62, а также уровень проформы каспазы-2 падает в условиях оверэкспрессии р62. Было предположено, что р62 опосредует деградацию каспазы-2 в протеасомах или по аутофагическому пути. Для решения этого вопроса будет использована полученная нами ранее дефицитная по аутофагии линия клеток. 4) Поскольку взаимодействие каспазы-2 и р62 может быть значимо не только для деградации первой, но и иметь другие функции, будет проведено исследование насколько каспаза-2 влияет на р62-опосредованную митофагию и функционирование митохондрий. Анализ возможной активации каспазы-2 за счет ее ассоциации с р62 раскроет новый механизм регуляции работы данного фермента. 5) Будет проанализирован молекулярный путь каспаза-2-опосредованного фосфорилирования гистона Н2АХ. Фосфорилирование гистона Н2АХ является ключевым для детекции повреждений ДНК. На предыдущих этапах мы выяснили, что каспаза-2 может осуществлять свою ядерную функцию в моноубиквитинилированной форме. Поскольку мы выявили четкую зависимость фосфорилирования гистона Н2АХ от уровня каспазы-2, было предположено, что ядерная форма каспазы-2 осуществляет эту регуляцию детекции ДНК повреждений. 6) Будет выявлено от какой именно киназы зависит каспаза-2-регулируемое фосфорилирование Н2АХ. На данном этапе 4 основные киназы рассматриваются в качестве потенциальных кандидатов – ATM, ATR, DNA-PK и JNK. Будет проведена оценка активации данных киназ при снижении или повышении экспрессии гена каспазы-2 при помощи siRNA или соответствующих плазмид. Выявление влияния каспазы-2 на одну из этих киназ прольет свет на важнейшие неапоптотические функции данного фермента, а также позволит раскрыть новый путь регуляции центральных в детекции повреждений ДНК киназ. Такая предположительная взаимосвязь в дальнейшем может быть использована для создания таргетных противоопухолевых препаратов. 7) Влияние каспазы-2 на уровень основного маркера повреждений ДНК – фосфорилированной формы Н2АХ – будет исследовано на модели нокаутной по каспазе-2 мыши, выведенной в нашей лаборатории. Также корреляцию между уровнем каспазы-2 и белками, регулирующими детекцию повреждений ДНК, планируется проанализировать на образцах, полученных от пациентов с карциномой яичника. Эти исследования подтвердят физиологическую роль каспазы-2 на организменном уровне, а также позволят выявить новые механизмы образования опухолей. Таким образом в совокупности будет исследован вопрос о роли конкретных пост-трансляционных модификации в регуляции работы каспазы-2 и в индукции гибели опухолевых клеток под воздействием ДНК-повреждающих химиотерапевтических препаратов. Также будет продемонстрирована физиологическая роль каспазы-2 в детекции повреждений ДНК на уровне организма с помощью исследований на нокаутной мышиной модели и образцах пациентов со злокачественными образованиями.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Каспаза-2 выполняет в организме различные функции, отвечая за запуск апоптоза в ответ на ряд стимулов, элиминацию анеуплоидных и полиплоидных клеток или клеток в состоянии митотического стресса, а также обладает онкосупрессорными свойствами. Более того, этот белок отвечает за сохранение геномной стабильности, активируясь при его повреждении. Несмотря на важность этого фермента механизм регуляции его работы остается до сих пор плохо изученным. Так, практически нет сведений о том, как регулируется данный фермент за счет-пострансляционных модификаций, таких как фосфорилирование и убиквитинилирование. На предыдущих этапах исследований мы выявили ряд потенциальных сайтов фосфорилирования каспазы-2 и проанализировали их. Оказалось, что только замена S384A в последовательности каспазы-2 вела к ингибированию автокаталитического процессинга профермента, что практически полностью подавляло его ферментативную активность и снижало уровень гибели клеток при индукции апоптоза генотоксическим стрессом. Все эти данные указывали на то, что остаток S384 является ключевым для работы каспазы-2. Однако, предыдущие попытки доказать, что данный остаток подвергается фосфорилированию, не имели успеха. Поэтому мы применили в текущем году некоторые другие подходы (масс-спектрометрический, биоинформатический анализ и молекулярное моделирование) для исследования механизмов, каким образом S384 регулирует работу каспазы-2. В первую очередь был применен метод масс-спектрометрического анализа для непосредственного анализа возможности фосфорилирования каспазы-2. Для проведения данного анализа каспазу-2 (мутантную и дикого типа) выделяли из клеток линии СAOV-4 и линии HEK293T при индукции в них генотоксического стресса. Далее препараты были проанализированы с помощью масс-спектрометрического и протеомного анализов. Фосфорилирование остатка S384 не было подтверждено этим методом. Для изучения механизма воздействия замены серина в положении 384 на аланин в молекуле каспазы-2 было исследовано пространственное расположение остатка S384 относительно активного центра в 3D структуре данного фермента. Проведенный анализ показал, что остаток S384 находится на дне небольшой полости вблизи активного центра. Важно отметить, что тетраэдрическая фосфатная группа слишком объемная, чтобы поместиться в эту полость и ковалентно связаться с боковой цепью серина, поэтому мы сделали вывод, что данный остаток не может быть фосфорилирован. Оказалось, что боковая цепь изучаемого остатка серина вовлечена в формирование поверхности данной полости вместе с боковыми цепями остатков Arg-219 и Arg-378. Карбоксильная группа аспартата субстрата связывается в этом кармане, что имеет первоочередное значение для субстратного распознавания. Arg-219 и Arg-378 образуют водородные связи с аспартатом, в то время как остаток серина в положении 384 напрямую не взаимодействует с субстратом. Вместо этого данный остаток образует водородные связи с боковой цепью аспартата в позиции 225 каспазы-2. При мутации серина в позиции 384 водородная связь с аспартатом 225 не образуется, зато формируется гидрофобный контакт с изолейцином 387. Конформация аргинина в положении 378, одного из ключевых остатков, участвующих в связывании субстрата, при этом сильно изменяется: гуанидиновая группа поворачивается таким образом, что атом Nε больше не способен образовывать важную водородную связь с аспартатом субстрата. Замена S384A в структуре каспазы-2 не влияет на каталитическую пару His-227 - Cys-320, но ведет к нарушению связывания субстрата с остатком аргинина в позиции 378. Таким образом, данные результаты говорят о том, что остаток S384 играет ключевую роль в связывании субстрата, что необходимо для процессинга каспазы-2, ее каталитической активности и запуска процесса клеточной гибели. Вывод о важности остатка S384 в структуре каспазы-2 подтвердился множественным выравниванием последовательностей инициаторных и эффекторных каспаз, которое показало высокую степень консервативности остатка серина в положении 384 среди представителей семейства каспаз и среди различных видов. Для валидации важности S384 на уровне организма был проведен анализ базы данных TCGA на наличие missense и stop-gain мутации в каспазах-2, -3 и -6 при консервативном положении аргинина, которое соответствует Arg-378 в каспазе-2. Выяснилось, что мутации Arg-378Trp в каспазе-2, Arg-207Stop в каспазе-3 и Arg-220Trp в каспазе-6 были обнаружены в карциномах тела матки. Также было выявлено, что позиция серина, которая соответствует остатку S384 в каспазе-2, подвергаются миссенс-мутагенезу в каспазе-5 и -6 при развитии плоскоклеточного рака легкого и аденокарциноме легкого. Полученные данные свидетельствуют о значимости таких замен в нарушениях апоптотической гибели опухолевых клеток и канцерогенезе. Таким образом, полученные результаты демонстрируют решающую роль остатков Ser-384 и Arg-378 в связывании субстрата, процессинге каспазы-2 и формировании ее ферментативной активности. Однако, наши данные свидетельствуют, что остаток Ser-384 не подвергается фосфорилировнию, а участвует в формировании и поддержании стабильности активного центра каспазы-2. Более того, описанный механизм консервативен и, вероятно, является общим для других членов семейства каспаз. Исследования другой формы пост-трансляционной модификации каспазы-2 – убиквитинирования также были продолжены. На предыдущих этапах нами было детектировано взаимодействие каспазы-2 и р62, убиквитинилирование каспазы-2, а также её деградация при оверэкспрессии р62. В связи с этим возник вопрос: опосредует ли р62 деградацию каспазы-2 через протеасомы или через аутофагический путь, или у их взаимодействия другая функция? Для выяснения этих вопросов были выполнены следующие исследования. На предыдущих этапах работы нами было показано, что блокирование протеосомной деградации с помощью MG-132 приводит к аккумуляции активной формы каспазы-2 и усилению гибели опухолевых клеток. Однако, это не исключало, что убиквитинилированная каспаза-2 подвергается протеолизу по аутофагическому пути. Для выяснения этого вопроса в клетках линии HEK293T индуцировали апоптоз генотоксическим стрессом, а затем блокировали протеасомную или аутофагическую деградацию с помощью ингибиторов. Было продемонстрировано, что при комбинаторной обработке доксорубицином и MG-132 наблюдалась значительное расщепление полноразмерного PARP и аккумуляция ферментативно-активных фрагментов каспазы-2 и -3. Таким образом, можно сделать вывод о том, что блокирование протеасом приводило к аккумуляции расщепленной формы каспазы-2. В противовес этому, оказалось, что при блокировании аутофагии не происходило накопление проформы или ферментативно-активных форм каспазы-2 ни в нормальных условиях, ни в условиях генотоксического стресса, из чего можно сделать вывод о том, что каспаза-2 подвергается протеасомной, но не аутофагосомной деградации. Для проверки данного вывода мы проанализировали накопление ферментативно-активных форм каспазы-2 в клетках аденокарциномы легкого U1810 дикого дипа (U1810 wt – wild type) и нокаутных по гену аутофагии ATG13, и потому неспособных к аутофагии (U1810 ATG13KO). Клетки обрабатывали ингибитором протеасом, а также ингибитором трансляции циклогексимидом и ингибитором каспаз QVD в течение 24 часов для того, чтобы исключить процессы синтеза или апоптотической деградации каспазы-2. Было показано, что при обработке клеток циклогексимидом наблюдалось уменьшение уровня проформы каспазы-2 без накопления ферментативно-активных фрагментов каспазы-2. Снижение уровня проформы возможно было по трем причинам: 1) деградация каспазы-2 по пути аутофагии, 2) аутопротеолиз в процессе инициации апоптоза, 3) деградация в протеасоме. Поскольку разница в уровне каспазы-2 в клетках дикого типа и нокаутных по аутофагическому гену отсутствовала, следовательно, убиквитинилированная каспаза-2 не подвергалась аутофагосомной деградации. Для проверки варианта апоптотической гибели данный тип гибели был заблокирован обработкой клеток каспазным ингибитором QVD совместно с циклогексимидом. Однако и в этом случае мы наблюдали падение уровня проформы каспазы-2. Когда же была заблокирована протеасомная деградация ингибитором MG-132, то наблюдалось полное восстановление уровня проформы каспазы-2 сравнимое с контролем. Таким образом, можно сделать вывод о том, что каспаза-2 подвергается протеасомной, но не аутофагической деградации. Для того, чтобы дополнительно проверить гипотезу о том, что деградация каспазы-2 происходит не за счет аутофагии, нами был поставлен эксперимент в условиях стимуляции аутофагии за счет ограничения питательных веществ. Было показано, что в условиях ограничения питания убиквитинилирование каспазы-2 приводит к ее протеосомной, но не аутофагической деградации. Однако роль белка р62 оставалась неясной в данном процессе. Необходимо было изучить, опосредует ли р62 деградацию каспазы-2 или выполняет какую-то другую функцию. Для исследования данного вопроса мы провели оверэкспрессию плазмиды р62 в клетках линии U1810 wt и U1810 ATG13KO. При оверэкспрессии р62 наблюдалось падение уровня проформы каспазы-2 и существенное накопление расщепленного фрагмента каспазы-2 р19. При этом обработка клеток QVD не приводила к полному восстановлению проформы каспазы-2. При комбинаторной обработке QVD и MG-132 уровень проформы каспазы-2 практически полностью восстанавливался. Таким образом, можно заключить, что оверэкспрессия р62 приводила к активации каспазы-2. Для того, чтобы убедиться в том, что при оверэкспрессии каспазы-2 происходит активация каспазы-2 нами был поставлен эксперимент по измерению активности каспазы-2 в клетках, трансфицированных плазмидой р62. Данный анализ показал, что оверэкспрессия р62 приводит к увеличению активности каспазы-2. Исходя из полученных нами результатов мы предполагаем, что каспаза-2 подвергается убиквитинилированию, уровень которого повышается в условиях генотоксического стресса, а также при ингибировании протеасомной деградации. Можно предположить, что р62 связывается с каспазой-2 именно посредством моно- или полиубиквитина и направляет её на протеасомную деградацию. Однако при этом в случае большой представленности р62 в клетке или усиленном убиквитинилировании каспазы-2 происходит интенсивное взаимодействие р62 и каспазы-2 через убиквитин, что приводит к олигомеризации каспазы-2 и её последующей активации. Другим аспектом роли исследования роли каспазы-2 в гибели опухолевых клеток при действии химиотерапевтических препаратов стало изучение роли данного фермента в детекции повреждений ДНК. В сайтах повреждения ДНК накапливаются белки, ингибирующие экспрессию генов путем связывания с факторами транскрипции, и факторы ремоделирования хроматина, привлекающие комплекс MRN к месту разрыва цепи ДНК. Комплекс MRN играет важную роль в первоначальной детекции двухцепочечных разрывов в ДНК перед репарацией. MRN комплекс, в свою очередь, привлекает к месту разрыва киназы АТМ, АТR и DNA-PK, что ведет к фосфорилированию по остатку Ser139 гистона H2AX, что является одним из главных маркеров повреждения ДНК. Поскольку ранее нами было показано, что уровень каспазы-2 коррелирует с уровнем фосфорилирования гистона H2AX, то мы исследовали потенциальное влияние каспазы-2 на работу комплекса MRN. В эксперименте была проанализирована активность ключевого компонента MRN комплекса - белка Nbs1. При индукции генотоксического стресса различие в уровне фосфорилирования Nbs1 между клетками дикого типа и нокаутными по каспазе-2 не было детектировано, что говорило об отсутствии влияния каспазы-2 на работу этого комплекса. Таким образом, по-видимому, каспаза-2 не участвует в процессе обнаружения разрывов ДНК комплексом белков MRN. Поскольку было показано, что каспаза-2 не влияет на активацию комплекса MRN, ответственного за детекцию разрывов ДНК, было выдвинуто предположение, что каспаза-2 может непосредственно взаимодействовать с Н2АХ и влиять на фосфорилирование данного гистона. С помощью метода аффинной хроматографии была выделена каспаза-2 из клеток, ее анализ показал, что данной белок не взаимодействует с гистоном Н2АХ. Таким образом, каспаза-2 влияет на фосфорилирование гистона Н2АХ не через непосредственное белок-белковое взаимодействие. Для того, чтобы определить является ли важной каталитическая функция каспазы-2 для фосфорилирования Н2АХ в клетках HEK293T были оверэкспрессированы конструкции, кодирующие каспазу-2 дикого типа или мутантную с заменами, блокирующими работу активного центра. Было показано, что уровень накопления фосфорилированной формы Н2АХ не отличается в клетках, экспрессирующих каспазу-2 дикого типа или мутантную. Таким образом, мы заключили, что влияние каспазы-2 на фосфорилирование Н2АХ не связано с каталитической функцией данного белка. На основании проведенных исследований был сделан вывод, что каспаза-2 не влияет на активацию комплекса MRN и не взаимодействует напрямую с Н2АХ. Однако наши эксперименты снова подтвердили зависимость уровня фосфорилирования Н2АХ от каспазы-2.

 

Публикации

1. Замараев А.В, Волик П.И., Нилов Д.К., Туркина М.В., Егоршина А.Ю., Горбунова А.С., Яровенко С.Ю., Животовский Б., Копеина Г.С. Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity Cell Death & Disease, 3;11(10):825 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1038/s41419-020-03023-6

2. Сеничкин В.В., Прохорова Е.А., Животовский Б, Копеина Г.С. Simple and Efficient Protocol for Subcellular Fractionation of Normal and Apoptotic Cells Cells, - (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/cells10040852

3. В.В. Сеничкин, Н.В. Первушин, А.П. Зуев , Б. Животовский, Г.С. Копеина Таргетирование белков семейства Bcl-2: что, где, когда? БИОХИМИЯ, том 85, вып. 10, с. 1421-1441 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.31857/S0320972520100097

4. Копеина Г.С., Животовский Б.Д. Caspase-2 as a Master Regulator of Genomic Stability Trends in Cell Biology, - (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.tcb.2021.03.002

5. Базанов Даниил Романович, Лозинская Наталья Александровна, Первушин Николай Викторович, Копеина Гелина Сергеевна, Аникина Лада Владимировна, Савицкая Виктория Юрьевна, Максутова Анита Ирековна 2,4,5-ТРИ(МЕТОКСИФЕНИЛ) ЦИС-ИМИДАЗОЛИН И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ -, RU (11) 2 730 497 (13) C1 (год публикации - )

6. - Обнаружены участки, благодаря которым белки-каспазы «убивают» клетки Газета.ru, - (год публикации - )


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
На текущем этапе работы мы исследовали функции и механизм взаимодействия каспазы-2 и р62, которое было обнаружено ранее. С помощью иммунопреципитации из цитоплазматической и ядерных фракций клеток мы показали, что каспаза-2 взаимодействует с р62 в цитоплазме. Также исследовали способен ли р62 без убиквитин-связывающего домена (p62-ΔUBD) взаимодействовать с каспазой-2. Для этого в клеточных линиях совместно экспрессировали конструкты, кодирующие последовательность каспазы-2 и р62 wt или р62-ΔUBD, и обрабатывали цисплатином или доксорубицином проводили. Оказалось, что каспаза-2 и р62 дикого типа выделяются совместно в pull-down assay, что говорит об их непосредственном взаимодействии. При этом р62-ΔUBD не детектировали в образцах с каспазой-2. Полученные данные свидетельствуют о том, что убиквитин-связывающий домен важен для стабильного взаимодействия каспазы-2 и р62. Далее проводили исследование эффекта подавления синтеза р62 с помощью siRNA на активацию каспазы-2 и процесса апоптоза. Было показано, что подавление синтеза р62 снижало накопление активных форм каспазы-2 и каспазы-3 при индукции гибели химиопрепаратами, что говорило об участии р62 в процессинге и активации каспазы-2 и апоптоза в целом при генотоксическом стрессе. Для выяснения механизма, каким образом р62 может обеспечивать активацию каспазы-2, был применен метод BiFC (Bimolecular fluorescence complementation). Данный метод позволяет оценить происходит ли критический этап активации каспазы-2 – ее димеризация – за счет оценки восстановления флюоресценции белка Venus, N- и С-концевые фрагменты которого слиты с продоменом каспазы-2. Введение соответствующих конструктов в клетки и анализ с помощью флюоресцентной микроскопии показал, что синтез в клетках mCherry-p62 стимулировал появление флюоресценции procasp2-Venus, при этом оба флюоресцентных белка колоколизовались. Соответственно, р62 способен взаимодействовать с продоменом каспазы-2 и опосредовать ее димеризацию, вызывая ее активацию. В литературе показано, что каспаза-2 может активироваться в составе комплекса PIDDosome, состоящего из белков RAIDD и PIDD, но может это делать и в отсутствии этих белков. На предыдущем этапе мы обнаружили, что в условиях генотоксического стресса каспаза-2 копреципитируется с р62, но не с белком RAIDD, который является адаптером в PIDDosome. Вероятно, взаимодействие с р62 играет роль альтернативного механизма активации каспазы-2. При этом согласно экспериментам по ко-преципитации каспазы-2 и р62 из ядерной и цитоплазматической фракций такое взаимодействие происходит в цитоплазме. Далее был исследован вклад убиквитина в р62-опосредованную димеризацию каспазы-2. Для этого проведён эксперимент BiFC с использованием конструкта, кодирующего mCherry-p62-ΔUBD. Анализ показал, что синтез в клетках mCherry-p62-ΔUBD индуцировал флюоресценцию Venus, что подтверждало димеризацию продомена каспазы-2. При этом количество клеток с сигналом флюоресценции Venus при оверэкспрессии mCherry-p62-ΔUBD было сравнимо с таковым при оверэкспрессии mCherry-p62 wt. Соответственно, р62 даже без убиквитин-связывающего домена способен обеспечивать димеризацию прокаспазы-2 и ее последующую активацию. Таким образом, убиквитин-связывающий домен является важным для образования стабильной и долговременной связи с каспазой-2. Однако, р62 и каспаза-2 могут взаимодействовать не только через убиквитин, но и напрямую, что в итоге приводит к димеризации и активации последней. Более того, мы провели анализ уровня этих белков в образцах патологических и здоровых тканей пациентов с аденокарциномой легкого и карциномой яичника. Была выявлена статистически значимая положительная корреляция между уровнем каспазы-2 и р62 в опухолевых тканях. Таким образом, в тканях аденокарциномы легкого и карциномы яичника происходило увеличение уровня р62, что коррелировало с увеличением уровня каспазы-2. Полученные данные свидетельствуют о биологической значимости взаимосвязи каспазы-2 и р62 в опухолях исследованных этиологий. Суммируя приведенные выше данные, можно сделать вывод, что каспаза-2 подвергается убиквитинированию в условиях генотоксического стресса и взаимодействует с р62. При этом р62 способен опосредовать димеризацию каспазы-2, что приводит к ее активации. Значимость взаимосвязи этих двух белков подтверждается синхронным повышением их уровня в патологических тканях пациентов с аденокарциномой легкого и карциномой яичника. Ранее мы обнаружили, что снижение уровня каспазы-2 за счет нокаута или нокдауна приводило к заметному угнетению апоптоза и уменьшению накопления маркера повреждения ДНК – фосфорилированной формы гистона H2AX. Была предпринята попытка преодолеть такую устойчивость к гибели с помощью разработанных нами аналогов нутлина-3а. Действительно, обработка клеток с нормальным уровнем каспазы-2 и нокаутных этими соединениями приводила к увеличению уровня р53. Однако это повышение р53 не усиливало накопление ɣH2AX или гибель нокаутных по каспазе-2 клеток. Далее мы исследовали, происходит ли увеличение уровня gammaH2AX, если восстановить уровень каспазы-2 в нокаутных клетках за счет введения соответствующей плазмиды. Эксперименты показали, что оверэкспрессия каспазы-2 ведет к восстановлению уровня gammaH2AX при обработке клеток доксорубицином по сравнению с клетками дикого типа. Мы изучили, влияет ли каспаза-2 на киназы АТМ, АТR и DNA-PK, которые непосредственно фосфорилируют Н2АХ. Обнаружено, что увеличение уровня каспазы-2 за счет оверэкспрессии после обработки клеток доксорубицином не приводило к изменению уровня фосфорилированных форм этих киназ. Таким образом, вероятно, каспаза-2 влияет на фосфорилирование Н2АХ через другие механизмы. Ранее в литературе было показано, что фосфорилирование H2AX может регулироваться комплексом, содержащим белки каспаза-8, RIP1 и FADD. Согласно литературным данным такой комплекс участвует в регуляции деления и также способен запускать апоптоз или некроптоз в зависимости от условий. Проведенное нами исследование морфологии клеток и биохимических маркеров показало, что при обработке клеток доксорубицином развивается состояние митотической катастрофы, а также происходит фосфорилирование киназы RIP1 и формирование мультибелкового комплекса, содержащего RIP1, каспазу-8 и FADD. Мы предположили, что каспаза-2 может регулировать фосфорилирование H2AX, входя в состав этого комплекса. Однако, каспаза-2 не взаимодействовала напрямую с RIP1 и каспазой-8 в норме или при генотоксическом стрессе. Таким образом, влияние каспазы-2 на фосфорилирование H2AX при повреждении ДНК не связано с RIP1-зависимым механизмом, который был продемонстрирован для каспазы-8. Для того, чтобы подтвердить физиологическую значимость каспазы-2 для фосфорилирования H2AX, мы использовали нокаутных по каспазе-2 мышей, полученных в нашей лаборатории с помощью CRISPR/Cas9. Было проанализировано накопление gammaH2AX в ядрах гепатоцитов мышей дикого типа и с нокаутом по каспазе-2 после введения доксорубицина. Оказалось, что у нокаутных животных действительно снижено количество гепатоцитов с положительным окрашиванием gammaH2AX в ядрах по сравнению мышами дикого типа. Этот результат говорил о том, что отсутствие каспазы-2 приводит к снижению фосфорилирования H2AX при повреждениях ДНК не только в клетках отдельных культур, но и на уровне организма модельно животного. Также мы описали подход, основанный на молекулярной динамике, для оценки структурных изменений каспаз при мутации того или иного аминокислотного остатка.

 

Публикации

1. Базанов Д. Р., Первушин Н. В., Савин Е.В., Цымляков М.Д., Максутова А. И., Сосонюк С.Е., Копеина Г.С., Лозинская Н.А. Sulfonamide derivatives of cis-imidazolines as potent p53-MDM2/ MDMX protein-protein interaction inhibitors medicinal chemistry research, 30, 2216–2227 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1007/s00044-021-02802-w

2. Егоршина А.Ю., Замараев А.В., Каминский В.О., Радыгина Т.В., Животовский Б, Копеина Г.С. Necroptosis as a Novel Facet of Mitotic Catastrophe International Journal of Molecular Sciences, 23(7), 3733 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/ijms23073733

3. Нилов Д.К., Замараев А.В., Животовский Б.Д., Копеина Г.С. Exploring Caspase Mutations and Post-Translational Modification by Molecular Modeling Approaches J. Vis. Exp, - (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3791/64206

4. - СМЕРТЬ РАДИ ЖИЗНИ: МОЛЕКУЛЯРНОЕ ПРОГРАММИРОВАНИЕ ГИБЕЛИ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА Всероссийский фестиваль науки, https://www.festivalnauki.ru/program/lektsiya-smert-radi-zhizni-molekulyarnoe-programmirovanie-gibeli-kletok-cheloveka-geliny-kopeinoy-ka-211003173347/?sphrase_id=9380 (год публикации - )


Возможность практического использования результатов
В ходе проекта был разработан новый подход для синтеза новых аналогов нутлина-3а. Этот подход позволяет дешевле и эффективнее получить аналоги нутлина-3а с различными заменами, которые помогают увеличить растворимость этих соединений. Данный аспект является важным фармакологическим параметром потенциального лекарства. На эти соединения и их способ получения выдан патент. Нутлины способны разрушать взаимодействие между MDM2 и р53, повышая уровень последнего. Как известно, этот белок регулирует стабильность генома и является важным онкосупрессором. Стабилизация уровня р53 за счет аналогов нутлинов рассматривается как перспективный подход в лечении некоторых онкологических заболеваний, и сейчас один из аналогов проходит клинические испытания. Также эти соединения могут быть использованы для преодоления резистентности опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам.