Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Сформирована коллекция клинических изолятов N. gonorrhoeae, состоящая из 179 обрацов, собранных в 2019-2021 гг. в 8 субъектах Российской Федерации. При сборе образцов и их обработке использовали рекомендации программы мониторинга гонококковой инфекции RU-GASP (Russian Gonococcal Antimicrobial Surveillance Programme). Получены препараты высокоочищенной ДНК, пригодной для молекулярно-генетического анализа. Определены фенотипические характеристики штаммов из полученной коллекции. Установлены минимальные подавляющие концентрации (МПК) к антимикробным препаратам (АМП): пенициллину, цефалоспоринам III поколения (цефтриаксон – является препаратом выбора для лечения гонококковой инфекции в РФ и в мире), фторхинолонам (ципрофлоксацин), макролидам (азитромицин), тетрациклину и спектиномицину, идентифицированы генетические детерминанты устойчивости к АМП. С целью исследования природы устойчивости гонококка к разным группам бета-лактамов впервые определены структура гена penA, кодирующего пенициллинсвязываюший белок 2 PBP2, и тип penA аллели для изолятов российской популяции, дополненные анализом детерминант в генах penA, ponA, mtrR и porB. Самыми распространёнными типами penA аллелей на территории РФ оказались типы I и XV. Все изоляты, за исключением штаммов, обладавших аллелями penA типов XV и XXXIV, содержали инсерцию Asp345а, уменьшающую чувствительность к пенициллинам, но не влияющую на устойчивость к цефалоспоринам. Обнаружены мутации на С-концевом участке транспептидазы PBP2 Phe504Leu, Ala510Val, Ala516Gly, Pro551Ser/Leu, снижающие скорость связывания антибиотика и препятствующие последующим конформационным изменениям белка. Все изоляты были определены как фенотипически чувствительные к цефтриаксону, однако накопление мутаций в разных генах приводило к постепенному росту медианного значения МПКцеф. Максимальное повышение МПКцеф до 0,045 мг/л наблюдалось в группе изолятов, содержащих мозаичную аллель penA тип XXXIV, замену Leu421Pro в PBP1 (ген ponA), делецию delA в гене mtrR и мутации в гене porB. Большинство изолятов были фенотипически устойчивы к пенициллину. Изоляты с экстремально высоким МПКпен 32 мг/л несли плазмидную детерминанту blaTEM-1. Полученные результаты показали как частичное сходство, так и различия молекулярных механизмов, ведущих к повышению устойчивости к разным группам бета-лактамных антибиотиков. Наиболее значимыми являлись различия в аллелях penA, ряд немозаичных вариантов которых обнаруживался у изолятов с высокими МПКпен, в то время как увеличение МПКцеф оказывалось возможным только при приобретении аллели мозаичного типа. С другой стороны, изоляты, характеризующиеся как повышенными значениями МПКцеф, так и МПКпен, обладали общими мутациями в системах транспорта и эффлюкса антибиотиков, а также значимой аминокислотной заменой в белке-мишени PBP1 (ген ponA). На основе информации об изолятах N. gonorrhoeae из базы данных Pathogenwatch и изолятов, собранных в РФ (всего - 5812 изолятов) построена регрессионная модель, предсказывающая значения МПК изолятов N. gonorrhoeae к цефтриаксону, и получено регрессионное уравнение для расчета МПКцеф на основе наличия детерминант резистентности, включающее 20 параметров. Регрессионная модель продемонстрировала, что наибольшее влияние на устойчивость к цефтриаксону имеет замена Ala501Pro в белке PBP2. Значительно меньшее влияние имеют замены Ala501Val/Thr и Ala311Val, а также замена Gly120Arg в пориновом белке. Заметное влияние на МПКцеф оказывала инсерция insAsp345a, которая часто встречается у изолятов N. gonorrhoeae и вызывает повышение устойчивости к пенициллинам. Валидация полученной регрессионной модели с использованием 14 референсных штаммов WHO показала хорошую корреляцию рассчитанных значений МПКцеф и экспериментально измеренных значений МПКцеф: 92,8% в пределах одного двойного разведения. Разработан метод предсказания значения МПК изолятов N. gonorrhoeae к цефтриаксону, включающий (а) определение молекулярных детерминант резистентности в изолятах N. gonorrhoeae с использованием разработанных нами олигонуклеотидных гидрогелевых микрочипов; (б) расчет МПК по регрессионному уравнению. Применение метода для исследования 448 российских изолятов показало, что для 94.4% изолятов исследованной выборки предсказанные значения МПКцеф отличались от экспериментально измеренных не более чем на одно двукратное разведение. Метод не показал ложноположительных результатов: все прогнозируемые значения МПКцеф были правильными с точки зрения критерия чувствительности/устойчивости. Проведено молекулярное типирование клинических изолятов N. gonorrhoeae, полученных на территории РФ, с использованием двух методов: NG-MAST и MLST (мультилокусное) типирование. Среди изолятов РФ 2018-2019 гг. выявлен 61 NG-MAST тип, среди которых доминирующими являлись NG-MAST 228, 807, 9486, 1993. Показано, что отличие наиболее распространенных российских сиквенс-типов от европейских сохраняется из года в год, что свидетельствует о значительном вкладе клонального размножения в структуру популяции возбудителя гонококковой инфекции. Филогенетический анализ распределил изоляты N. gonorrhoeae по геногруппам, объединяющим наиболее близкие NG-MAST типы. Показана функциональная зависимость типа аллели penA от NG-MAST типа, т.е. изоляты одного сиквенс-типа несут одинаковые аллели penA. Обратное утверждение неверно, так как одинаковые аллели penA могут принадлежать разным сиквенс-типам и геногруппам. Построенное филогенетическое древо демонстрирует, что аллели penA одного типа могут принадлежать как филогенетически близким сиквенс-типам, так и располагаться на далеких друг от друга ветвях. Среди изолятов РФ отсутствовали изоляты пандемически значимого и распространенного в Европе и в мире NG-MAST типа 1407, однако обнаружено шесть изолятов, принадлежащих геногруппе G1407. При этом филогенетический анализ показал, что все представители геногруппы G1407 обладали мозаичной аллелью penA XXXIV типа, что подтверждает выявленную функциональную зависимость типа аллели penA от NG-MAST типа. Кроме того, эти же изоляты имели мутацию Leu421Pro в пенициллинсвязывающем белке (ген ponA), Gly120Lys, Ala121Asn в белке-порине PorB и делецией delA в промоторной области гена mtrR (помпа эффлюкса), что дополнительно смещало МПКцеф в сторону высоких значений. Следует отметить, что глобально распространенные штаммы N. gonorrhoeae с множественной лекарственной устойчивостью, включая высокую устойчивость к цефтриаксону и цефиксиму, принадлежали к NG-MAST 1407 и имели мозаичную penA аллель именно XXXIV типа плюс дополнительную замену Ala501Pro в penA. Таким образом, риски появления и распространения устойчивости к цефалоспоринам в российской популяции N. gonorrhoeae в настоящее время связаны с трансграничным переносом представителей геногруппы G1407. Результаты MLST типирования изолятов 2018-2021 гг. показали наличие 43 MLST типов, что, наряду с наличием большого числа NG-MAST типов, свидетельствует о генетическом разнообразии российской популяции возбудителя. Наиболее распространенными MLST типами оказались 1594, 1892 и 1901. Российские изоляты MLST типа 1901 демонстрировали повышенную фенотипическую устойчивость к пенициллину, тетрациклину и ципрофлоксацину по сравнению с изолятами других типов, что было подтверждено идентификацией соответствующих детерминант резистентности. Однако, в отличие от европейских штаммов N. gonorrhoeae, изоляты РФ MLST типа 1901 не несли мутации, приводящие к устойчивости к цефалоспоринам III поколения. Проведено полногеномное секвенирование изолятов N. gonorrhoeae, принадлежащих доминирующим в РФ геногруппам: G807, G1993, G9476. Секвенирование проводили параллельно на двух платформах: Oxford Nanopore technologies (ячейки MinION) и секвенаторе MiniSeq (Illumina). Проводили «de novo» сборку геномов, что дало возможность получить данные о порядке расположения генов на хромосоме N. gonorrhoeae. Получено по 45 сиквенсов изолятов N. gonorrhoeae с каждой платформы. Полностью собраны геномы 28 образцов N. gonorrhoeae. Результаты полногеномного секвенирования использовали для биоинформационного анализа: поиска уникальных аллелей в изолятах N. gonorrhoeae, принадлежащих наиболее распространенным сиквенс-типам Европы и РФ, анализа геномных перестроек и определения расположения ортологов на хромосоме. Проведено сравнение геномов N. gonorrhoeae изолятов РФ NG-MAST 807, доминирующих в РФ и геномов изолятов NG-MAST 1407. Для сиквенс-типа 807 выявлено 144 характерных аллеля, для сиквенс-типа 1407 – 98 характерных аллелей. Определены белки, кодируемые данными генами, и принадлежность белков к группам, характеризующим их функцию. Наибольшее количество характерных для NG-MAST 807 белков относится к группе фагов и инсерционных элементов. Другие большие группы характерных белков входят в группу пилей, адгезинов, белков мутности, факторов патогенности, токсинов, группу белков, отвечающих за взаимодействие с нуклеиновыми кислотами, репликацию, транскрипцию, трансляцию, белков, участвующих в биосинтезе стенки, метаболизме и транспорте через мембрану. Для NG-MAST 1407 наибольшее количество характерных белков содержатся в группах белков биосинтеза клеточной стенки, метаболизма и транспорта через мембрану, взаимодействия с нуклеиновыми кислотами, репликацию, транскрипцию, трансляцию, белков пилей, адгезинов, белков мутности, факторов патогенности. Определено расположение генов 14 референсных геномов WHO по сравнению с расположением генов в референсном изоляте WHO-W, а также расположение ортологов в геноме изолятов РФ, принадлежащих к геногруппе G807. Проведен детальный анализ геномных перестроек N. gonorrhoeae для изолятов, собранных в РФ и принадлежащих NG-MAST 807, и определено расположение мобильных элементов, включающих инсерционные элементы IS, фаги (NgoΦ1- NgoΦ9), элементы Корреи, гонококковый остров, элементы Спенсера-Смита. Из проведенного анализа можно сделать вывод, что геномные перестройки у N. gonorrhoeae происходят независимо от филогенетической близости штаммов, поскольку как для филогенетически близких изолятов геногруппы G807, так и для филогенетически далеких референсных геномов WHO характерно наличие значительного количества инверсий и геномных транслокаций. Показано, что большáя часть инверсий происходит в местах расположения элементов Спенсера-Смита, Корреи и по сайтам IS Ngo2, ассоциированного с фагом NgoΦ8.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Завершено полногеномное секвенирование 60 российских изолятов N. gonorrhoeae, принадлежащих доминирующим в РФ геногруппам и сборка геномов. Полученные последовательности загружены в Genbank NCBI с присвоением номера Биопроекта: Bioproject PRJNA768989 и регистрационных номеров сиквенсов. Для характеризации современной популяции N. gonorrhoeae в России с точки зрения лекарственной устойчивости проанализировано и генотипировано более 600 клинических изолятов, полученных в РФ за последние 5 лет. Построены мутационные профили генов N. gonorrhoeae, ассоциированные с устойчивостью. Популяция N. gonorrhoeae РФ остается стабильной в течение последних пяти лет при тенденции к снижению устойчивости к пенициллину. Не обнаружено изолятов, устойчивых к цефтриаксону – препарату выбора для лечения гонококковой инфекции. Доли изолятов, устойчивых к пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину, составляли более 5%, что не позволяет надеяться на возобновление лечения гонореи этими препаратами. Как правило, присутствие нескольких мутаций у N. gonorrhoeae оказывало кумулятивный эффект на устойчивость. Наиболее многочисленной геногруппой в РФ является геногруппа G807. Доминирующим MLST сиквенс-типом в РФ является тип 1594, который сохраняет лидирующие позиции в российской популяции N. gonorrhoeae с 2004-2005 гг. Изоляты РФ MLST типа 1901 (глобально распространенный сиквенс-тип, занимающий 1-е место в мировой популяции) не несли мутации, приводящие к устойчивости к цефалоспоринам III поколения. Оценена доля встречаемости MLST типов на континентах Земли, проведен филогенетический анализ MLST типов изолятов N. gonorrhoeae России и мира с построением филогенетического древа. Проведен анализ изолятов N. gonorrhoeae, содержащихся в базах данных PubMLST (https://pubmlst.org) и Pathogenwatch (https://pathogen.watch/genomes/all?organismId=485). Наиболее распространенными в мире сиквенс-типами являются NG-MAST 225, 1407, 2400, 2992 и 4186. Построенная филогенетическая сеть показала, что разделение изолятов по NG-MAST типам соответствует разделению по кор-геномам. Филогенетически различающиеся сиквенс-типы отличаются также профилями антибиотикорезистентости, что может быть связано с различиями в путях эволюции и адаптации N. gonorrhoeae и с присутствием генов, характерных для каждого сиквенс-типа и отличающим один сиквенс-тип от другого. Сравнительный полногеномный анализ изолятов N. gonorrhoeae наиболее распространенных молекулярных типов показал, что генетические линии исследованных сиквенс-типов имели от 8 до 20 характерных генов. Пути эволюции N. gonorrhoeae, позволяющие какому-либо NG-MAST типу много лет сохранять лидирующие позиции в популяции, включают изменения в генах, отвечающих за адгезию и вирулентность, изменения в структуре гонококкового острова, сохранение генов, несущих детерминанты лекарственной устойчивости, изменения в генах, связанных адаптацией, изменения в генах ферментов биохимических путей. Проведено парное сравнение геномов NG-MAST 807 - наиболее распространен в РФ, и NG-MAST 1407 - наиболее часто встречается в Европе и мире, но не в РФ. Изоляты сиквенс-типа 807 несли немозаичную аллель гена penA I типа, изоляты сиквенс-типа 1407 - мозаичную аллель типа ХХХIV, ассоциированную с устойчивостью к цефалоспоринам III поколения. Для геномов обоих типов характерны уникальные гены, кодирующие белки пилей, факторы патогенности, включающие белки мутности OpaA, гены белков, отвечающие за инициацию репликации. Геномы анализируемых сиквенс-типов отличаются генами, кодирующими HNH эндонуклеазу семейства MafB, генами адгезинов MafA, генами белков систем транспорта и эффлюкса, генами ферментов биохимических путей (гликозилтрансферазы, алкогольдегидрогеназы), генами гонококкового острова. Подробное исследование последовательностей генов, входящих в состав гонококковых островов, , показало существенные различия в структуре для изолятов различных сиквенс-типов. Для глобально распространённых NG-MAST типов продемонстрирована связь между снижением чувствительности изолятов к антимикробным препаратам и отсутствием поломок в необходимых для секреции ДНК генах гонококкового острова. По результатам полногеномного секвенирования описаны генные перестройки в доминирующих NG-MAST типах. Анализ геномов 60 российских изолятов после сборки de novo подтвердил отсутствие прямой связи между геномными перестройками и филогенетической близостью штаммов. Большая часть инверсий происходит в местах расположения элементов Спенсера-Смита, Корреи и по сайтам ISNgo2, ассоциированных с фагом NgoΦ8. Мобильные элементы фланкируют участки перестроек и инверсий, что объясняет неслучайный характер перестроек и инверсий и показывает, что изменение порядка генов на хромосоме способно меняться быстрее их нуклеотидных последовательностей. Для исследования изменения жизнеспособности (бактериального фитнесса) N. gonorrhoeae при формировании устойчивости к антимикробным препаратам сконструированы плазмидные векторы, содержащие ген bla, экспрессирующий фермент бета-лактамазу. Получены генно-инженерные конструкции, отличающиеся структурой гена bla, в частности рblaTEM-20, которая в природе у N. gonorrhoeae не встречается. Измерены МПК к ряду бета-лактамных антибиотиков: пенициллины, цефалоспорины II, III и IV поколения, карбопенемы. Одна нуклеотидная замена GGT→AGT в кодоне 238 привела к образованию бета-лактамазы TEM-20 расширенного спектра действия, обладающей способностью к гидролизу как пенициллинов, так и цефалоспоринов. Все анализируемые штаммы E. coli и N. gonorrhoeae были чувствительны к карбапенемам, то есть препараты ряда карбапенемов остаются среди препаратов резерва для терапии гонококковой инфекции. Проведена оценка параметров роста и гибели клеток в полученных штаммах N. gonorrhoeae. Проведено математическое моделирование кинетических кривых. Показано, что клетки, содержащие плазмиды pblaTEM, имеют сниженную жизнеспособность по сравнению с клетками без плазмид, что может быть объяснено дополнительными энергетическими и метаболическими затратами на репродукцию плазмид. Штамм с плазмидой pblaTEM-20 демонстрировал значительно сниженную жизнеспособность, что объясняется двумя факторами: наличием самой плазмиды и экспрессией β-лактамазы расширенного спектра действия. Бета-лактамаза может вызывать изменения в структуре пептидогликана клеточной стенки бактерий, в частности, снижение уровня сшитых муропептидов, что является причиной гибели клеток. Исследованы кривые выживаемости (гибели) клеток N. gonorrhoeae в присутствии цефтриаксона. Для штаммов, не имеющих детерминанты устойчивости к цефтриаксону, кинетика гибели описывается моделью Чика-Ватсона, разработанной для кривых дезинфекции. Кинетические кривые гибели для клеток с плазмидой, экспрессирующих бета-лактамазу расширенного спектра действия, отражают протекание нескольких процессов: гидролиз цефтриаксона бета-лактамазой TEM-20, рост и постепенную гибель клеток. На 2-ом этапе Проекта по результатам работы опубликованы три статьи в журналах с рейтингом Q1 и одна статья принята к публикации в российский научный журнал. Результаты доложены на трех конференциях. Вышел ряд публикаций в СМИ: https://nauka.tass.ru/nauka/13395911; https://poisknews.ru/themes/biologiya/novyj-mikrochip-pomozhet-vyyavlyat-vozbuditelya-gonorei-ustojchivogo-k-naibolee-rasprostranennym-antibiotikam/ https://polit.ru/news/2022/01/11/ps_rnf/ https://www.inpharm.ru/novosti/2022/01/11/novyy-mikrochip-pomozhet-vyyavlyat-vozbuditelya-gonorei-ustoychivogo-k-naibolee-rasprostranennym-antibiotikam.html https://scientificrussia.ru/articles/novyj-mikrocip-pomozet-vyavlat-vozbuditela-gonorei-ustojcivogo-k-naibolee-rasprostranennym-antibiotikam http://sci-dig.ru/medicine/ustojchivyh-k-antibiotikam-vozbuditelej-gonorei-stanut-vyyavlyat-pri-pomoshhi-novogo-mikrochipa/