Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Биоинформатические исследования. За отчётный период была проанализирована патогенность вариантов генов эндонуклеаз микроРНК DICER1, DROSHA в 3’-нетранслируемых областях, а также экзонные мутации DROSHA. Кроме того, был определён круг генов, ассоциированных с биосинтезом микроРНК, мутации которых могут стать дополнительными прогностическими маркерами при миелодиспластическом синдроме и других патологиях. МикроРНК является важнейшим регулятором экспрессии генов, определяющим фенотип клетки. Мутации белков, участвующих в биосинтезе этих молекул, могут приводить к различным заболеваниям, в том числе онкологическим. В связи с обнаруженной нами ранее в ходе выполнения проэкта распространенностью мутаций в генах DROSHA (17%) и DICER1 (54%), преимущественно локализованных в некодирующих регуляторных областях генов, данные гены являются перспективными кандидатами в диагностические мишени факторов риска развитии МДС, характеризующегося нарушением процессинга и биогенеза микроРНК. Варианты в кодирующей области DROSHA, выявленные у пациентов с онкогематологическими заболеваниями, исследовались с помощью алгоритмов по предсказанию эффекта мутаций на основе консервативности последовательности белков (SIFT, PolyPhen-2, MutPred, Provean, nsSNPAnalyzer, MAPP, PhD-SNP, SNAP, PANTHER, PredictSNP, MutationTaster). Также мутантные структуры изучались с позиции их влияния на термодинамическую стабильность и гибкую конформацию белка (mCSM, MUpro, i-MUTANT-Suite, SDM, DUET, PREMP, Maestro, FoldX4, ENCoM, DynaMut, DynaMut2). В итоге была показана значимость frameshift мутаций (R358Tfs*18, P356Lfs*121), а также выявлены наиболее патогенные миссенс-мутации (I625K, L1047S и H1170D). Таким образом, к патогенным мутациям белка DROSHA можно отнести I625K, L1047S, H1170D, R358Tfs*18 и P356Lfs*121, которые будут включены в диагностическую панель для тестирование различных слокачественных новообразований. Биоинформатический анализ экзонных мутаций DICER1 будет завершен в следующем отчетном периоде. Моделирование патогенных мутаций DICER1 запланирован на следующий отчетный период. Более детальное исследование влияния вариантов гена DROSHA на структуру, динамичность белка и его связывание с микроРНК, было проведено методом молекулярной динамики с продолжительностью в 200 нс. Ранее было показано, что при миелодиспластическом синдроме в мезенхимальных стволовых клетках наблюдается сниженная экспрессия эндонуклеаз процессинга микроРНК, DICER1 и DROSHA. Был разработан пайплайн для анализа вариантов генов в 3’-UTR и оценки их тканеспецифичного эффекта на экспрессию генов DICER1, DROSHA. Анализ вариантов 3’-нетранслируемых областей проводился с вычислением термодинамических параметров взаимодействия между оригинальными и мутировавшими подпоследовательностями и микроРНК, при этом перечень микроРНК состоял из наиболее экспрессирующихся именно в мезенхимальных стволовых клетках. Был получен список вариантов, которые могут приводить к эффективному снижению экспрессии генов DICER1, DROSHA в мезенхимальных стволовых клетках. Расширенное исследование генов общего пути биосинтеза микроРНК и их клеточных белков-партнеров показало, что наиболее перспективными генами с точки зрения потенциальных биомаркеров являются TP63, DHX8, AGO1. Анализ статистики пациентов с хроническим миелолейкозом показал, что наличие мутации в TP63 ассоциировано с переходом заболевания в бластную фазу. AGO1 регулирует экспрессию генов, вовлеченных в онкогенные пути; взаимодействие этого белка с РНК полимеразой II зависит от экспрессии DICER1 и DROSHA. Экспрессия хеликаз DexH повышена при миелодиспластическом синдроме высокого риска, что делает ген DHX9, также взаимодействующий с DICER1, важным регулятором биосинтеза микроРНК. Запланировано дальнейшее исследование данных генов в контексте онкогематологической патологии. Проведенные биоинформатические исследования позволили достигнуть следующих результатов: расширить изначальную диагностическую панель мутаций в генах процессинга микро-РНК и увеличить вероятность создания валидированного диагностического инструмента для выявления DROSHA/DICER1 мутированных опухолей; определить, что коррекция дефектов, возникающих в каталитической активности этих белков невозможна на уровне непосредственно DROSHA/DICER1, а должна осуществляться на уровне последующих ступеней клеточного метаболизма; определена потенциальная мишень для коррекции на уровне гена AGO1, что создает платформу для дальнейших in vitro исследований; на основании анализа UTR-3 полиморфизмов определены потенциальные маркеры предрасположенности к МДС, которые ранее не упоминались в литературе, необходимо их клиническое тестирование. В случае валидации подобной предрасположенности открывается перспектива разработки клинического инструмента для прогнозирования развития МДС в ситуациях клонального гемопоэза. Ингибиторование экспрессии молекул «контрольных точек» in vitro. Проведен эксперимент ингибирования сигнальных путей малыми молеклами с целью подавления экспрессии TIM3 и PD-1L на поверхности клеток при миелоидных неоплазиях. В качестве модели использована клеточная линия миеломонобластного лейкоза THP-1, которая имеет высокую экспрессию TIM3 и PD-1L. На основании анализа литературы в качестве целевых киназ выбраны mTOR, PKС, Akt, mTOR, RAF, MAPK. Для них, соответственно, были использованы ингибиторы киназ энзастаурин, MK-2206, рапамицин, сорафениб, PD 98,059. Проведены эксперименты культивирования клеточной линии с выбранными ингибиторами в наиболее часто используемых в литературе концентрациях. Выявлено, что среди всех ингибиторов наибольший эффект в отношении как экспрессии PD-1L, так и TIM3 обладал Akt ингибитор МК-2206, который более чем в 10 раз снижал экспрессию PD-1L (до 9.5% от исходного в концентрации 10 мкМ) и более, чем в 5 раз экспрессию TIM3 (до 16.5% от исходного концентрации 10 мкМ) на поверхности клеток. Ни один из других ингибиторов не влиял одновременно на 2 пути системы «контрольных точек. При этом значимого нарушения жизнеспособности клеток по данным окраски 7-AAD по сравнению с контролем не наблюдалось, процент клеток в состоянии апоптоза был сравним с контролем (1.4% против 1.5%). Результаты эффективности МК-2206 в отношении подавления экспрессии TIM3 были подтверждены в культуре костного мозга пациента с TIM3-положительным МДС. Предварительные результаты оценки экспрессии TIM3 свидетельствуют о том, что происходит не подавление экспрессии гена, а подавление транспорта исследуемых белков на мембрану. Планируется завершение валидации эффективности подавления TIM3 и PD-1L на расширенной группе пацентов с МДС и острым миелобластным лейкозом, валидация конкретных механизмов подавления экспрессии с помощью Akt ингибитора, выявление более селективных препаратов в отношении Akt киназ. Совершествование протоколов аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток при МДС. Третьим направлением проекта стала разработка нового протокола аллогенной трансплнантации гемопоэтических стволовых клеток (аллоТГСК). При МДС по сравнению с другими нозологиями результаты аллоТГСК остаются неудовлетворительными из-за высокой частоты рецидивов, обусловленных в том числе и иммунологическими механизмами. Разработан оригинальный протокол профилактики реакции трансплантат против хозяина на основе посттрансплнтационного бендамустина. Проведено пилотное исследование на 27 пациентах с рефрактерными лейкозами, преимущественно миелоидными. Выявлена крайне высокая напряженность реакции трансплантат против лейкоза, характеризовавшаяся высокой частотой приживления трансплантата (93%), ремиссий (89%) и ремиссий без минимальной остаточной болезни (63%). Только 2 пациента с миелоидными неоплазиями рецидивировали после трансплантации. В рамках проекта были изучены иммунологические аспекты такого выраженного противоопухолевого эффекта. За счет зарплантых средств проекта выполнен анализ иммунологического восстановления с помощью методов проточной цитометрии и цитокинового профиля с исселдованием методом иммуноферментного анализа 5 цитокинов и уровня сывороточного ферритина. Выявлено, что после использования посттрансплнтационного бендамустина наблюдается сверхранняя экспансия общей популяции лимфоцитов и, особенно, NK клеток, абсолютное количество которых в раннем посттрансплантационном периоде даже превосходило референсные значения у здоровых добровольцев. Выявлено, что такой иммунологический феномен обусловлен как специфическими, отличными от других подходов к аллоТГСК, механизмами иммунологической толерантности, так специфическими осложнениями. Выявлено, что после посттрансплантационного бендамустина иммунологическая толерантность обусловлена экспансией PD-1L позитивных моноцитов и гранулоцитов (М2-позитивных макрофагов), причем доля этих клеток в периферической крови в ранний период после трансплантации у части пациентов превосходила 30% от всех ядросодержащих клеток. Срыв этого механизма приводил к развитию синдрома выброса цитокинов с наибольшим пиковым повышением интерлейкина-6 и интерлейкина-17, что сделало обоснованным использование анти-интерлейкин-6 антитела тоцилизумаба. Запланировано продолжение клинических исследований, направленное на контроль синдрома выброса цитокинов.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
На основании проспективного исследования и применения проточной цитометрии c 48 антителами полностью завершен анализ структуры изменений системы контрольных точек в костном мозге пациентов с миелодиспластическим синдромом. В результате исследования установлено, что как у здоровых доноров, так и у больных МДС высока доля лимфоцитов с экспрессией PD-1 (41±18% и 58±25% соответственно) и высокая доля миелоидных клеток с экспрессией PD-1L (31±23% и 12±7% соответственно) соответственно), что свидетельствует о потенциальной физиологической роли систем контрольных точек в костном мозге. Однако мы подтвердили сложные изменения в костном мозге пациентов с МДС, включая пути PD-1, CTLA-4, LAG-3 и TIM3, сопровождающиеся повышенным уровнем T-reg и популяций супрессорных клеток миелоидного происхождения. Кластерный анализ выявил независимую прогностическую значимость профиля контрольных точек для общей выживаемости (ОР 1,90, 95% ДИ 1,01-3,56, р=0,0471). Ведущими субпопуляциями для прогноза были TIM3-положительные эффекторные клетки NK и CD8, а также количество бластов MDS. Повышение уровня бластов в BM было связано с одновременной экспрессией нескольких контрольных точек на миелоидных клетках. Также за отчётный период была полномасштабно проанализирована патогенность вариантов генов эндонуклеазы процессинга микроРНК DICER1 в кодирующих областях, зарегистрированных в базе данных ClinVar: найдено 2002 варианта, из которых более 91% являются вариантами неясного значения. Основное внимание уделялось именно вариантам неизвестного клинического значения, их эффект был предсказан методами сравнительной геномики в данном исследовании. С этой целью был проведен углубленный филогенетический анализ и последующая реконструкция эволюционного сценария гена DICER1, в результате чего была разработана детальная карта риска белка Dicer1, представляющая собой по-позиционный анализ аминокислотных остатков белка на предмет толерантности к заменам. Dicer1 является белком с повышенной мутационной нагрузкой при различных патологиях, в том числе и онкологических заболеваниях, поэтому полученная карта может быть использована в дальнейшем для прогнозирования новых мутаций DICER1 при различных патологиях, включая миелодиспластический синдром (МДС). Варианты в кодирующей области DICER1, выявленные у пациентов с онкогематологическими заболеваниями по базе данных COSMIC, исследовались с помощью набора алгоритмов по предсказанию эффекта мутаций на основе консервативности последовательности белков (SIFT, PolyPhen-2, MutPred, Provean, nsSNPAnalyzer, MAPP, PhD-SNP, SNAP, PANTHER, PredictSNP, MutationTaster). Также мутантные структуры изучались с позиции их влияния на термодинамическую стабильность и гибкую конформацию белка (MUpro, PREMPS, DynaMut). В итоге первичного анализа с интеграцией результатов автоматических инструментов были выявлены наиболее потенциально патогенные миссенс-мутации (Y124H, I445S, F508C, T993R). Более детальное исследование влияния данных вариантов DICER1 на структуру, динамичность и стабильность белка было проведено методом молекулярной динамики с продолжительностью в 300 нс. В результате сайт-специфического мутагенеза in silico и молекулярной динамики мутантных белков были продемонстрированы наиболее значимая структурная дестабилизация и конформационные изменения белка Dicer1, вызванные мутациями F508C и T993R в С-концевом хеликазном и PAZ доменах, соответственно. Полученные результаты согласуются с многочисленными исследованиями, выявляющими потенциальную взаимосвязь между вариантами DICER1 у носителей и развитием ряда новообразований и неопухолевых состояний; дальнейшее изучение данной ассоциации является перспективным для обнаружения молекулярно-генетической роли DICER1 в развитии новых патологий, в том числе и МДС. На основании полученных биоинформатических данных синтезирована оригинальная панель для секвенирования нового поколения, проводится валидации ее информативности в клинической практике. Завершены исследования ко-культивирования линии миеломонобластного лейкоза THP-1 с ингибиторами сигнальных путей, подтверждена эффективность ряда ингибиторов для подавления экспрессии TIM3 и PD-1L. Тем не менее выявлено, что нативные клетки костного мозга пациентов с МДС даже при изначально высокой экспрессии TIM3 и PD-1L теряют эту экспрессию в процессе культивирования даже без ингибиторов, что свидетельствует о важности влияния гемопоэтических ниш на экспрессию молекул контрольных точек. Для дальнейших доклинических исследований малых молекул требуются более совершенные in vitro модели контрольных точек МДС. Продолжающиеся исследования улучшения технологии аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, которая на сегодняшний день остается единственным излечивающим методом при МДС, продемонстрировали возможности оптимизации иммуносупрессивной терапии, которая приводит к сокращению частоты грибвковых, бактериальных и вирусных инфекций, а также отличным показателям выживаемости пациентов.