КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-75-20060

НазваниеПоиск биомишеней потенциальных противотуберкулезных препаратов класса азоло[1,2,4,5]тетразинов

РуководительМаслов Дмитрий Антонович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, г Москва

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2020 - 06.2022 

КонкурсКонкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-403 - Медицинская микробиология и вирусология

Ключевые словатуберкулез, биомишень, азоло[1,2,4,5]тетразины, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis, лекарственная устойчивость, кандидаты в лекарственные препараты

Код ГРНТИ76.03.43


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Туберкулез (ТБ), вызванный Mycobactrium tuberculosis, является на сегодняшний день основной причиной смертей от одного возбудителя, ответственного, по оценке ВОЗ за 1,2 миллиона смертей в 2018 году. Согласно той же оценке, около 1,7 миллиарда человек во всем мире являются носителями возбудителя, и рискуют развитием активной формы ТБ [WHO, Global Tuberculosis Report 2019]. Возникновение и распространение ТБ с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ, устойчивость к изониазиду и рифампицину), широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ-ТБ, определяется как МЛУ-ТБ с дополнительной устойчивостью к фторхинолонам и инъекционным препаратам второго ряда) и ТБ с тотальной лекарственной устойчивостью (ТЛУ-ТБ) является глобальной угрозой для мирового контроля за распространением заболевания [Islam M.M., et al. J Genet Genomics. 2017, 44(1), Pp. 21–37]. Длительная терапия (от шести месяцев в случае лекарственно-чувствительного туберкулеза до двух лет, в случае формы с ЛУ), приводит к снижению приверженности пациентов терапии, дальнейшему развитию лекарственной устойчивости и, как следствие, снижению частоты успешного лечения. Таким образом, важной задачей на сегодняшний день является поиск новых противотуберкулезных лекарств и более коротких режимов химиотерапии [Munnoz-Torrico, M., et al. Rev. Port. De Pneumol. 2018, 24, 86–98]. Объектом исследования проекта 2017 года являлись пять новых соединений класса имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов, ранее отобранных нами как потенциальные ингибиторы серин-треониновых протеинкиназ (СТПК) в двух оригинальных тест-системах - M. smegmatis aphVIII+ и S. lividansaphVIII+, хотя их точный механизм действия и механизм устойчивости микобактерий к ним оставался неизвестным. В рамках завершенного проекта был установлен основной механизм устойчивости микобактерий к имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам: мутации в гене MSMEG_1380 приводят к его инактивации и повышенной экспрессии оперона mmpS5-mmpL5 и, соответсвенно, усиленному эффлюксу соединений из клетки. Таким образом, было показано, что система эффлюкса MmpS5-MmpL5 микобактерий является важной МЛУ-помпой, способной обеспечивать устойчивость к различным препаратам: азолам [Milano A., et al. Tuberculosis (Edinb). 2009. V. 89. № 1. P. 84–90], клофазимину и бедаквилину у M. tuberculosis [Andries K., et al. PLoS One. 2014. V. 9. № 7. P. e102135], производным тиоацетазона у M. abscessus [Halloum I., et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2017. V. 61. № 4. P. e02509–16] и имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам у M. smegmatis [Maslov D.A., et al. Pathogens 2020. V. 9. № 3. P. 166]. Ввиду невозможности обнаружения мутантов на основе созданного штамма M. smegmatis dmmp5, с делетированным опероном mmpS5-mmpL5, мы предположили, что соединения могут иметь более одной биомишени, либо мутации в биомишени, которые могли бы обеспечить устойчивость к имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинам, являются летальными. Пилотный эксперимент по анализу транскриптомного ответа на воздействие одного из имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов позволил выдвинуть гипотезу, что данные соединения воздействуют на системы реплкации/репарации ДНК микобактерий, помимо предполагаемого ингибирования СТПК. В рамках возможного продолжения проекта мы планируем осуществлять исследования в двух направлениях: 1. Продолжить исследования транскриптомного ответа микобактерий на воздействия имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразином в различных концентрациях. Анализ транскриптома – новый подход, который может дать новые знания и понимания действия различных препаратов на бактериальную клетку, путем анализа ее ответа на транскрипционном уровне. Такой подход все шире используется в последние годы в том числе для исследования противотуберкулезных лекарств [Briffotaux J., et al. Front. Microbio. 2019, 10, Pp. 249.], и выглядит перспективным в условиях невозможности обнаружения мутаций устойчивости в гене биомишени. 2. Исследовать специфичность эффлюкс-помпы MmpS5-MmpL5 M. tuberculosis к различным лекарственным препаратам и провести in vitro скрининг ее ингибиторов. Такие соединения могут быть использованы для предотвращения возникновения лекарственной устойчивости, опосредованной данной помпой, а также снизить порог устойчивости микобактерий к различным препаратам. Ингибирование эффлюкса уже показало свою эффективность в снижении МИК изониазида у клинических изолятов туберкулеза [Jaiswal, I., et al. Lung India 2017, 34, 499–505] и считается перспективным подходом в разработке новых схем противотуберкулезной химиотерапии [Pule C.M., et al. J. Antimicrob. Chemother. 2016, 71, 17–26.].

Ожидаемые результаты
При выполнении проекта мы рассчитываем получить следующие результаты: 1. Будут получены профили транскрипционного ответа микобактерий на воздействие имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразином, при различных его концентрациях (динамика изменения транскрипционного ответа). Эти данные помогут не только понять механизм действия имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов, но и возможно помогут выявить новые потенциальные биомишени в клетках микобактерий; 2. На основе анализа транскриптомных профилей будет обоснован механизм действия соединений класса имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов. Механизм действия данных соединений будет подтвержденное экспериментально (сверхэкспрессия, нокаут/нокдаун генов); 3. Будет описан спектр препаратов, к которым способна обеспечивать устойчивость система эффлюкса MmpS5-MmpL5 M. tuberculosis. Будет исследована лекарственная чувствительность штамма M. smegmatis, сверхэкспрессирующая данную систему M. tuberculosis, как в ее диком типе, так и вариант, характерный для линии Beijing B0/W-148, широко распространенной на территории России. Полученные данные помогут не только рациональнее создавать новые препараты, но и прогнозировать возможное развитие лекартственной устойчивости к применяемым ныне.; 4. На основе in silico и in vitro скрининга будут отобраны активные ингибиторы MmpL5-помпы M. tuberculosis – кандидатные препараты для борьбы с лекарственной устойчивостью (приобретенной и природной) M. tuberculosis.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Для установления механизма действия соединения TSV-395 на клетку M. smegmatis mc2 155 был изучен транскрипционный профиль клеток при добавлении к ним субингибирующих концентраций TSV-395. В результате анализа полученных данных было установлено, что при добавлении к клеткам M. smegmatis TSV-395 происходит изменение экспрессии ряда генов ответственных за синтез и транспорт сидерофоров - важнейших молекул для захвата железа из окружающей среды. Наблюдалось дозозависимое изменение генов синтеза микобактина, карбоксимикобактина, синтеза и транспорта экзохелина. Помимо этого, была повышена экспрессия оперона системы секреции 7 типа ESX-3, ответственной за поглощение железа. Повышалась экспрессия транспортеров MmpS5-MmpL5, ответственных за эффлюкс сидерофоров, а также ряда железорегулируемых генов, ответственных за импорт и хранение железа (irtA-B, bfrA, bfrB, оперонов nuo и pqqE-lldD1). В целом, за редкими исключениями, транскрипционные профили M. smegmatis, при воздействии TSV-395, походили на описанные транскрипционные профили микобактерий при низких уровнях железа, что может свидетельствовать о том, что TSV-395 воздействует на метаболизм железа, нарушая механизмы его добычи. Это также объясняет более высокую чувствительность M. tuberculosis к имидазотетразинам из-за его требовательности к содержанию железа. Следующим этапом работы было изучение специфичности транспортера MmpS5-MmpL5 M. smegmatis mc2 155 к различным антибактериальным агентам. Показано, что данный транспортер способен обеспечивать устойчивость к триптантринам, линезолиду, телитромицину и производным 2-тио-нафталина. Проведен in vitro скрининг отобранных ранее, совместно с коллегами из Южно-Африканского Национального Института Биоинформатики (South African National Bioinformatics Institute, SANBI, Кейп-Таун, ЮАР), методом виртуального скрининга 5 хит-соединений, потенциальных ингибиторов системы MmpS5-MmpL5 микобактерий. Тестирование показало, что соединения BDE 26593610 и BDD 27860195 являются активными ингибиторами системы эффлюкса MmpS5-MmpL5. По результатам первого года выполнения проекта опубликована 1 публикация в журнале Q1 (Antibiotics), в которую вошли данные по обеспечению устойчивости микобактерий к триптантринам системой эффлюкса MmpS5-MmpL5, а также приняты к печати 2 тезисов на конференцию FEBS-2021 (индексируются в WoS), по результатам проведенного транскриптомного анализа и отбору ингибиторов системы эффлюкса MmpS5-MmpL5.

 

Публикации

1. А.А. Ватлин, К.М. Климина, В.Н. Даниленко, Д.А. Маслов Transcriptomic profiling of Mycobacterium smegmatis to reveal imidazo[1,2-b][1,2,4,5]tetrazine mechanism of action FEBS Open Bio, - (год публикации - 2021).

2. С.Г. Фролова, А.А. Ватлин, М. Шахбааз, В.Н. Даниленко, А. Кристоффелс, Д.А. Маслов Search for potential mycobacterial MmpS5-MmpL5 efflux pump inhibitors FEBS Open Bio, - (год публикации - 2021).

3. Фролова С.Г., Климина К.М., Кумар Р., Ватлин А.А., Салунке Д.Б., Кендрекар П., Даниленко В.Н., Маслов Д.А. Identification of Mutations Conferring Tryptanthrin Resistance to Mycobacterium smegmatis Antibiotics, 2021, 10(1), Pp. 6–10 (год публикации - 2021).


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Во второй год проекта нами был проанализирован транскриптомный профиль M. smegmatis под воздействием субингибирующей (1/4 МИК) концентрацией имидазотетразина TSV-402. Сравнение профиля экспрессии с результатами, полученными в предыдущие годы для различных концентраций TSV-395 показало сходства во многих аспектах транскриптомного ответа. Так, основными сверхэкспрессированными генами были таковые из групп, отвечающих за оксилительное фосфорилирование и транскрипцию ДНК, что свидетельствует об окислительном стрессе и повреждениях ДНК. Также общий чертой было изменение генов, вовлеченных в метаболизм железа, хотя в данном случае изменение было в противоположную сторону. В частности была снижена экспрессия генов кластера mbt (синтез микобактина), генов биосинтеза и транспорта экзохелина и систем секреции VII типа, при этом была повышена экспрессия генов запасания железа. Очевидно, что имидазотетразины вызывают окислительный стресс, и затрагивают бактериальный метаболизм ионов железа, хотя и несколько по-разному. Исследования более детальных различий в воздействии имидазотетразинов на синтез и транспорт сидерофоров является перспективной целью для дальнейших исследований. Нами показано, что наличие железа в среде (по крайней мере при сравнении Lemco-Tw и Middlebrool 7H9, и при добавлении железа в твердую питательную среду) может повышать устойчивость M. smegmatis к имидазотетразинам, однако вариация концентрации в пределах одной жидкой среды не оказывает эффекта на чувствительность, что может быть связано с различиями в поглощении железа в жидкой и твердой средах. Анализ 100 спонтанных мутантов, устойчивых к TSV-395 был нашей очередной попыткой найти мутации устойчивости, отличные от таковых в гене MSMEG_1380 – регуляторе экспрессии системы эффлюкса MmpS5-MmpL5, после невозможности получения спонтанных мутантов на основе штамма M. smegmatis dmmp5, делетированного по оперону mmpS5-mmpL5. При этом у всех проанализированных мутантов были обнаружены мутации в гене MSMEG_1380, что показывает, что данный механизм является единственным, который может приобрести M. smegmatis для формирования устойчивости к имидазотетразинам. Показано, что особенности гетерологической экспрессии трансмембранных белков M. tuberculosis в M. smegmatis не позволяют использовать модель M. smegmatis для анализа активности системы MmpS5-MmpL5 M. tuberculosis. При этом сконструированные в рамках проекта штаммы M. smegmatis atr9c и M. smegmatis dmmp5 вполне подходят для таргетного анализа специфичности такой системы M. smegmatis, а также для поиска ее ингибиторов Нами также проведен скрининг полной библиотеки соединений ASINEX, включающей коллекции Gold и Platinum, и насчитывающей 575302 соединения, из которых отобраны 6 дополнительных потенциальных ингибитора системы MmpS5-MmpL5 M. smegmatis.

 

Публикации

1. - Найдены препараты, которые не дают возбудителю туберкулеза избавиться от антибиотиков ТАСС Наука, - (год публикации - ).

2. - Новые препараты не дали возбудителю туберкулеза избавиться от антибиотиков Naked Science, - (год публикации - ).

3. - Новые препараты не дали возбудителю туберкулеза избавиться от антибиотиков Поиск, - (год публикации - ).

4. - Ученые не дали возбудителю туберкулеза избавиться от антибиотиков Indicator, - (год публикации - ).

5. - НОВЫЕ ПРЕПАРАТЫ НЕ ДАЛИ ВОЗБУДИТЕЛЮ ТУБЕРКУЛЕЗА ИЗБАВИТЬСЯ ОТ АНТИБИОТИКОВ Научная Россия, - (год публикации - ).

6. - Будущие лекарства выведут из строя «белки-насосы» возбудителя туберкулеза Развивай себя, - (год публикации - ).

7. - Будущие лекарства выведут из строя «белки-насосы» возбудителя туберкулеза Полит.ру, - (год публикации - ).

8. - Будущие лекарства выведут из строя «белки-насосы» возбудителя туберкулеза Science-digest, - (год публикации - ).

9. - Новые препараты не дали возбудителю туберкулеза избавиться от антибиотиков Nano News Net, - (год публикации - ).

10. - Новые препараты не дали возбудителю туберкулеза избавиться от антибиотиков MSAU.ru, - (год публикации - ).

11. - Ученые не дали возбудителю туберкулеза избавиться от антибиотиков Пресс-служба РНФ, - (год публикации - ).

12. Ватлин АА, Шитиков ЕА, Шахбааз М, Беспятых ДА, Климина КМ, Кристоффелс А, Даниленко ВН и Маслов ДА Transcriptomic Profile of Mycobacterium smegmatis in Response to an Imidazo[1,2-b][1,2,4,5]tetrazine Reveals Its Possible Impact on Iron Metabolism Frontiers in Microbiology, 12:724042 (год публикации - 2021).

13. Шахбааз М., Маслов Д.А., Ватлин А.А., Даниленко В.Н., Гришина М., Кристоффелс А. Repurposing based identification of novel inhibitors against MmpS5-MmpL5 efflux pump of Mycobacterium smegmatis: A combined in silico and in vitro study Biomedicines, 10(2), 333 (год публикации - 2022).


Возможность практического использования результатов
Важнейшим прикладным результатом проекта стало обнаружение 2 активных in vitro ингибиторов MmpS5-MmpL5 транспортера M. smegmatis, и еще 6 кандидатов, отобранных виртуальным скринингом. Эти результаты могут лечь в основу разработки новых эффективных препаратов, способных подавлять лекарственную устойчивость туберкулеза, обусловленную эффлюксом, таким образом выступая своего рода "адъювантами" лекарственных препаратов, таких как бедаквилин.