Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Бактерии Bacillus thuringiensis (БТ) широко распространены в природе и являются основой биопрепаратов для защиты растений от насекомых вредителей различных отрядов. Проект направлен на изучение факторов вирулентности энтомопатогенных бактерий B. thuringiensis, а также ключевых антибактериальных механизмов резистентности насекомых к данным бактериям. Жизненный цикл бактерий БТ находятся под контролем систем, называемых «чувство плотности сообщества» (Quorum sensing), и может включать инфекционный (биотрофный), сапротрофный (некротрофный) период жизнедеятельности, а также период спорообразования, которые переключаются в течение инфекционного процесса в организме насекомых. Данные системы контроля уровня экспрессии генов были открыты сравнительно недавно и в основном изучаются в фундаментальных работах, посвященных росту и размножению бактерий (Agaisse et al., 1999, Salamitou, et al., 2000, Buisson et al., 2019). Задачей проекта является изучить уровень экспрессии и моменты переключения жизненных стратегий бактерий в кишечнике зараженных насекомых. В ходе реализации проекта, выполнен дизайн праймеров по 34 последовательностям 21 гена факторов вирулентности бактерий B. thuringiensis и 6 генов «домашнего хозяйства» (на некоторые гены было подобрано несколько пар праймеров). Подобраны праймеры для следующих генов: транскрипционный фактор нейтральная протеаза (NprR), гемолизин BL (binding component) (Hbl A,Hbl B, Hbl D), гемолизин III (InhA), хитиназа (Chi), N-Acyl homoserin lactone-degrading enzyme (N-Ac), регулятор споруляции (Spo0A), негемолитический энтеротоксин А (NheA, NheB), траскрипционный активатор R (PlcR), фосфолипаза С (PlcA), цитотоксин К (CytK), Cry-токсины (Cry1J, Cry1B, Cry8), энтеротоксин С (EntC, EntCW). Из них по 19 генам интереса и одному референсному гену - была полностью отработана и готова к использованию методика оценки экспрессии в образцах бактерий БТ. Подобраны праймеры и отработана методика для определения экспрессии генов, отвечающих за синтез Cry токсинов (Cry 1, Cry 2, Cry 7/8, Cry 9) у бактерий B. thuringiensis методом ПЦР с детекцией продуктов методом электрофореза в агарозном геле. Подобраны искусственные питательные среды (ИПС) для размножения бактерий B. thuringiensis, с целью активации различных генов, отвечающих за транскрипцию факторов вирулентности. Сравнительно недавно было показано, что транскрипция фактора регуляции PlcR зависит от питательной среды и подавляется фактором, регулирующим процесс спорообразования Spo0A. Таким образом PlcR не активен в клетках бактерий рода Bacillus, растущих на бедной питательной среде, и гены, регулируемые PlcR экспрессируются на богатой питательными элементами среде, например LB, или в организме насекомых. Для оптимизации подобранных праймеров наработку чистой культуры бактерий проводили на ИПС, богатой питательными веществами. Для активации уровня экспрессии генов, отвечающих за синтез хитиназы (Chi 2), использовали ИПС с гидродизатом хитина. Для активации уровня экспрессии генов, отвечающих за синтез фосфолипазы С (PlcA), использовали питательную среду с добавление 10% желтковой эмульсии. Для активации гена, отвечающего за экспрессию регулятора споруляции (Spo0A), использовали бедную на питательные элементы ИПС. Проведен подбор концентрации вегетативных клеток бактерий БТ для заражения личинок вощинной огневки (Galleria mellonella L) методом принудительного скармливания (force-feed). Отработана методика выделения РНК бактерий из кишечников зараженных насекомых. Подобраны оптимальные условия для ревертирования бактериальной РНК. Получена амплификация с кДНК бактерий БТ, выделенных из кишечников зараженных насекомых, по всем изучаемым генам. Для анализа экспрессии генов, вовлеченных в процесс некротрофной (сапротрофной) фазы жизненного цикла бактерий, РНК выделяется из погибших от бактерий насекомых. Проведена постановка ПЦР на гены некротрофной фазы развития бактерий и показана амплификация этих генов на высоких циклах выхода. Для оценки вклада генома бактерий БТ, которые составляют естественную часть микробиома кишечника, проанализированы контрольные насекомые, которым не скармливали принудительно бактерий БТ. Показано либо отсутствие амплификации генов, либо амплификацию на очень поздних циклах. Мутантные штаммы бактерий рода Bacillus, с неактивным плеотропным регулятором биотрофной фазы развития бактерий (Bt 407 Cry- ∆plcR-papR), не будут успешны в развитии инфекционного процесса при заражении насекомых или мышей. Штаммы, с неактивным регулятором некротрофной фазы развития (Bt 407 Cry- ∆nprR-nprX), не способны использовать субстрат из погибших насекомых (Bouillaut et al., 2008; Perchat et al., 2011). Использование мутантных штаммов позволит смоделировать различны этапы инфекционного процесса. В ходе выполнения проекта отработана методика по изучению уровня экспрессии пятнадцати генов на ДНК бактерий B.cereus. С целью подготовки к запланированной работе на второй год реализации проекта, связанной с определение уровня экспрессии генов, отвечающих за защитные реакции у насекомых, проведена оптимизация праймеров для изучения уровня экспрессии генов- кандидатов иммунной системы вощинной огневки Galleria mellonella. По результатам данного блока работ статья принята в печать в журнал Developmental & Comparative Immunology · May 2021 (IF 3,195). Изучать механизмы действия ключевых факторов вирулентности бактерий на организм насекомых вредителей необходимо, чтобы понять, как повысить активность инфекционного начала для разработки новых биопрепаратов и усовершенствования уже существующих.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Bacillus thuringiensis (Bt) является одной из наиболее распространенных энтомопатогенных бактерий, используемых в качестве биопестицида и источника генов эндотоксинов для создания устойчивых к насекомым трансгенных растений. Основным фактором вирулентности бактерий БТ являются Cry-токсины эндотоксинового параспорального включения, продуцируемые бактериями на стадии споруляции под контролем регулятора SpoOA. Дополнительные факторы вирулентности (цитотоксины, гемолизины, энтеротоксины, фосфолипаза С), продуцируемые вегетативными клетками, находятся под контролем регулятора транскрипции PlcR на вирулентной стадии жизненного цикла БТ. Функции этих белков связаны с питанием и вирулентностью, защитой клеток и восприятием окружающей среды. Регулон NprR контролирует некротрофические свойства, позволяя бактериям выживать в трупах инфицированных насекомых, и включает гены, кодирующие ферменты деградации (протеазы, липазы, хитиназы) и липопептид (курстакин), участвующие в формировании биопленок. Бактерии, обитающие в трупе, размножаются до тех пор, пока не исчерпают всю потребляемую органику, а затем переходят к спорообразованию. Однако мало известно о природе выживания бактерий, размножения и образования спор в трупах устойчивых (или толерантных к болезням) хозяев. В ходе реализации проекта изучено развитие инфекции Bt в восприимчивых и устойчивых популяциях личинок вощинной огневки (Galleria mellonella), чтобы понять «борьбу в кишечнике» между вирулентностью Bt и защитой насекомых. Использована комбинация методов заражения насекомых бактериями БТ in vivo, анализ бактериального микробиома, РНК-интерференцию и анализ уровня экспрессии генов насекомых, отвечающих за защитные системы, и бактерий, на основных этапах жизненного цикла в насекомом. В результате реализации проекта получены следующие результаты. Во-первых, устойчивые к Bt насекомые могут очищать средний кишечник от бактерий в течение 48 часов после заражения. При заражении насекомых устойчивой линии происходит изменение состава микробиоты кишечника: преобладание Enterobacteraceae (грамотрицательных) и отсутствие спор Bt и вегетативных клеток в инфицированных личинках устойчивой популяции по сравнению с личинками чувствительной линии, у которых преобладали грамположительные энтерококки и БТ (споры и вегетативные клетки). Механизмы резистентности G. mellonella устойчивой линии могут включать очистку средней кишки от грамположительных бактерий. Во-вторых, когда Bt сталкивается с устойчивым хозяином, они быстро модулируют экспрессию генов, чтобы инициировать споруляцию (связанную с чувством кворума). Проанализирована экспрессия генов факторов вирулентности бактерий БТ биотрофной стадии, находящихся под контролем регулятора транскрипции PlcR (plcR), а также регулятор некротрофной фазы развития БТ (nprR) и регулятор спорообразования (SpoOA), в образцах, выделенных из погибших личинок после заражения бактериями БТ. Показаны четкие различия в координации вирулентности, некротрофного развития и спорообразования между бактериями, растущими в погибших личинках восприимчивых и резистентных линий. Бактерии БТ в чувствительном хозяине продолжают экспрессировать факторы вирулентности более активно, чем в устойчивом хозяине. При этом экспрессия регулонов некротрофной стадии и спорообразования была выше в устойчивом хозяине по сравнению с чувствительным. Таким образом, показано, что жизненный цикл бактерий БТ находится под длительным давлением механизмов резистентности устойчивого хозяина в кишечнике, таких как повышенный уровень экспрессии генов антимикробных пептидов. Кроме того, наши данные, полученные при помощи РНК-интерференции (https://www.sbras.info/articles/nauka-dlya-obschestva/sibirskie-uchenye-boryutsya-s-nasekomymi-vreditelyami; http://www.sib-science.info/ru/news/novosibirskiy-gosudarstvennyy-agrarnyy-universitet-21052021 ), подтверждают более ранние выводы о том, что повышенный уровень экспрессии антимикробных пептидов, в частности гловерина, обнаруживаются в среднем кишечнике устойчивых насекомых, что является эволюционной стратегией «быть готовым» к Bt-инфекции через ее основные пути проникновения и развития. Это приводит к значительному давлению на бактерии Bt как в средней кишке, так и в погибших насекомых резистентной линии. Бактерии Bt при столкновении с резистентным хозяином демонстрируют целый арсенал изменений в регуляции ключевых стадий бактериального развития. Все вместе это позволяет Bt поддерживать одинаковую бактериальную продуктивность у резистентного хозяина по сравнению с восприимчивым, хотя для этого требуются значительно большие дозы бактерий для резистентного хозяина и значительном сдвиге в регуляторах жизненного цикла бактерий. Результаты дают новое представление об антибиозе и некротрофной стадии жизненного цикла бактерий в системе «бактерии Bt-насекомые» в контексте разработки стратегий повышения эффективности биопестицидов. Полученные результаты представлены на конференциях российского и международного уровня. По результатам реализации второго года проекта подготовлена публикация и подана в журнал Toxins (Q1, Impact Factor 4,5).