Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В рамках Проекта за отчётный период были проведены лабораторные исследования влияния гуминовой кислоты на организм модельного вида рыб – японской медаки Oryzias latipes (линия Hd-rR). Схемы и условия экспериментов были разработаны в соответствии с рекомендациями Организации экономического сотрудничества и развития (OECD, Test No. 203; Test No. 230). На основании результатов 96-часового и 21-дневного экспериментов было показано, что присутствие гуминовой кислоты в воде в концентрациях, которые могут наблюдаться в природных водах, вызывает в печени медаки развитие стресс-реакций. Так, гуминовая кислота вызывает индукцию активности этоксирезоруфин-О-деэтилазы, фермента первой фазы биотрансформации ксенобиотиков: активность фермента в печени медаки была пропорциональна концентрации гуминовой кислоты (в выражении на количество органического углерода в воде). С увеличением времени экспозиции уровень активности этоксирезоруфин-О-деэтилазы в печени медаки возрастает. По итогам острой экспозиции, с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) и безметковой количественной оценкой (алгоритм LFQ) был проведён протеомный анализ проб печени и плазмы крови медаки. Были получены новые данные об изменениях в метаболизме рыб, происходящих при разных концентрациях гуминовой кислоты в воде. В печени медаки было достоверно идентифицировано 1628 белков (или белковых групп); белки рассматривались в качестве достоверно идентифицированных, если для них было обнаружено, по крайней мере, два пептида. Результаты масс-спектрометрического анализа указывают на то, что гуминовая кислота влияет на экспрессию множества белков и, следовательно, затрагивает большое число путей метаболизма. В контексте изучения процесса биотрансформации гуминовой кислоты в печени рыб особый интерес представляют данные по экспрессии изоферментов глутатион-S-трансферазы и УДФ-глюкуронилтрансферазы (ферментов, катализирующих реакции второй фазы биотрансформации). Согласно полученным данным при разных концентрациях гуминовой кислоты соотношение количества изоферментов в печени рыб различается: одни изоферменты имеют наибольшее содержание при низкой концентрации гуминовой кислоты, другие – при высокой, содержание третьих не изменяется. Наряду с ответными реакциями системы биотрансформации ксенобиотиков было изучено влияние гуминовой кислоты на антиоксидантную систему печени медаки. Анализ каталитической активности каталазы и концентрации перекиси водорода в печени рыб не выявил признаков развития окислительного стресса. Масс-спектрометрический анализ белкового состава печени показал, что значительный вклад в антиоксидантную защиту клеток при высокой концентрации гуминовой кислоты вносят Cu,Zn-зависимая супероксиддисмутаза (sod1), Mn-зависимая супероксиддисмутаза (sod2) и каталаза; при малой концентрации гуминовой кислоты увеличивается экспрессия внеклеточной Cu,Zn-зависимой супероксиддисмутазы (sod3), и двух изоферментов пероксиредоксина (prdx2 и prdx5). С помощью масс-спектрометрического анализа в плазме крови медаки было достоверно идентифицировано 164 белка. По результатам безметковой количественной оценки была построена тепловая карта, отражающая изменения белкового профиля под действием разных концентраций гуминовой кислоты. Подавляющее большинство идентифицированных белков плазмы характеризовалось отрицательной регуляцией даже при наименьшей силе фактора. Отмечалась отрицательная экспрессия белков (или белковых групп), участвующих в полимеризации белков, негативной регуляции эндогидролиза пептидных связей, синтезе креатинфосфата (высокоэнергетического соединения), гомеостазе холестерина, метаболизме углеводов, свёртывании крови, активации разных стадий системы комплемента (иммунном ответе). По меньшему числу идентифицированных белков наблюдалась положительная экспрессия; так, повышение количества было зафиксировано по белкам, участвующим в связывании ионов кальция, транспорте жиров, метаболизме липопротеинов, протеолизе и адгезии клеток. Полученные данные расширяют знания о молекулярных основах защитных реакций рыб, как объектов аквакультуры, под действием разных концентраций гуминовой кислоты, естественного экологического фактора.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В отчётный период 2021-2022 гг. был завершён анализ изменения протеома печени и плазмы крови японской медаки Oryzias latipes под влиянием гуминовой кислоты (Sigma-Aldrich, № продукта 53680, CAS 1415-93-6) в 96-часовом эксперименте. Также были проведены экспериментальные работы на обыкновенном карпе Cyprinus carpio и получены новые данные об изменении протеома печени рыб под влиянием краткосрочного (96 часов) и продолжительного (21 сутки) воздействия гуминовой кислоты в концентрациях, встречающихся в естественных водных объектах. Согласно результатам исследования, влияние гуминовой кислоты затрагивает большое число путей метаболизма. 96-часовое воздействие вызвало в печени карпа изменение относительного обилия белков, участвующих в переносе электронов в электрон-транспортной цепи, синтезе АТФ и липидов, метаболизме фосфолипидов, трансляции, сворачивании полипептидной цепи, убиквитинировании, протеолизе, внутриклеточном транспорте белков, формировании цитоскелета и адгезии клеток. 21-дневная экспозиция отразилась на обилии белков, задействованных в переносе электронов в электрон-транспортной цепи, репарации ДНК и упаковке хроматина, метаболизме РНК, трансляции, сворачивании полипептидной цепи, протеолизе, транспорте белков, рециркуляции трансмембранных белков, катаболизме аминокислот, метаболизме углеводов, АТФ и глутатиона, связывании АТФ, ионов металлов и гема, кроветворении, ангиогенезе, иммунном ответе, формировании цитоскелета и адгезии клеток. При более продолжительном действии фактора среди белков с изменившимся относительным обилием значительно возросло число белков, общих для всех опытных групп (68 белков в 21-дневном эксперименте и 19 белков в 96-часовом), при этом в обоих случаях превалировали белки с отрицательной регуляцией. С увеличением продолжительности воздействия гуминовой кислоты возросло число дисрегулированных белков, участвующих в организации цитоскелета (актиновых и промежуточных филаментов) и межклеточного пространства (десмосом). Анализ функций всех дисрегулированных белков в печени медаки и карпа позволил выявить значительное сходство эффектов гуминовой кислоты – поступление данного вещества в организм рыб вызывало нарушение регуляции белков, функции которых связаны с такими биологическими процессами как перенос электронов в электрон-транспортной цепи, трансляция, сворачивание полипептидной цепи, убиквитинирование, протеолиз, транспорт белков, синтез липидов, активация системы комплемента и организация цитоскелета. В результате воздействия гуминовой кислоты также наблюдались изменения каталитической активности ферментов биотрансформации и антиоксидантных ферментов в печени рыб, однако данные реакции не имели чёткой зависимости от концентрации. Протеомный анализ показал, что в пробах печени карпа наибольшую кратность изменения относительного обилия среди антиоксидантных ферментов и ферментов биотрансформации имели глутатионпероксидаза 1а, глутатионсинтетаза, каталаза, тиоредоксинредуктаза 3, глутатион-S-трансфераза тета, цитохром Р450 2J2 и цитохром Р450 2Х10. Тогда как в печени медаки наиболее выраженные изменения относительного обилия были зарегистрированы по тиоредоксину, Cu-Zn-зависимой супероксиддисмутазе (sod3), глутатион-S-трансферазе тета и цитохрому P450 1A.