Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Первый год выполнения Проекта был посвящен комплексной характеристике и анализу последовательностей факторов, определяющих полезные свойства бактерий вида Bacillus thuringiensis, такие как инсектицидные, фунгицидные, антибактериальные и стимулирующие рост растений свойства. В результате выполнения первого года Проекта был составлен список факторов вирулентности и молекулярных детерминант антибактериальных, фунгицидных и ростостимулирующих свойств B. thuringiensis, который включал более 50 разных хитиназ, более 20 разных групп бактерицидных факторов и различных факторов, стимулирующих рост растений, в том числе 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) дезаминазу, индол пируватдекарбоксилазу, фосфат-солюбилизирующий фермент и сидерофоры. Для каждой из этих групп были получены последовательности белков (всего 24355, среднее количество последовательностей на группу белков – 738), которые затем были кластеризованы и подвергнуты дополнительной фильтрации, чтобы избавится от неправильно аннотированных последовательностей. В результате были получены 162 кластера последовательностей со средним количеством кластеров на группу, равным 4,9, и средним количеством последовательностей на кластер, равным 65,5. Для каждого кластера, содержащего более одной последовательности, были созданы скрытые марковские модели (HMM) для поиска соответствующих детерминант как в массиве аминокислотных последовательностей, так и в геномах, и проведена валидация полученных моделей на доступных геномах штаммов рода Bacillus. На основании использованного подхода была создана компьютерная программа для автоматизированного поиска представителей всех указанных выше групп факторов в геномах B. thuringiensis. Для проверки полноты метаболических и регуляторных путей, вовлеченных в обеспечение антибактериальных, фунгицидных и ростостимулирующих свойств, была разработана программа, основанная на интеграции инструментов HMMER и PePPER, с привлечением данных принадлежности к метаболическим путям KEGG, полученных при помощи программы eggNOG v2.0.1.b-2-g816e190. Были получены последовательности 1269 генов, кодирующих токсины Cry вместе с координатами доменов этих токсинов, построены филогенетические деревья для аминокислотных последовательностей токсинов Cry и их доменов, на основании которых был сделан вывод о их относительно независимой эволюции. Было выявлено 60 событий рекомбинации между различными представителями токсинов Cry, и установлено, что эти события рекомбинации приводили возникновению стабилизирующего эволюционного отбора в возникших сочетаниях доменов, проведено изменение силы эволюционного отбора в токсинах Cry после рекомбинации. Также было установлено, что события рекомбинации, приводящие к обмену третьим доменов между токсинами Cry, приводили к смене спектра насекомых, против которых действовали эти токсины. С помощью программ SARP и Waltz были выявлены амилоидогенные участки в составе N- и C-терминальных фрагментах протоксинов Cry. Некоторые из этих амилоидогенных последовательностей были ассоциированы с консервативными блоками в составе С-терминальных участков, что позволяет сделать предположение о том, что роль С-терминального участка в кристаллизации может обеспечиваться именно посредством локальной агрегации токсинов в амилоидогенных сайтах. Таким образом, в ходе выполнения первого года Проекта был составлен подробный список как минорных факторов вирулентности, так и факторов, отвечающих за фунгицидные, антибактериальные и стимулирующие рост растений свойства бактерий Bacillus thuringiensis, который позволил создать программный инструмент для автоматизированного поиска этих факторов в геномах бактерий. Также был проведен детальный анализ эволюции трехдоменных токсинов Cry, который позволил выявить большое количество событий рекомбинации между генами, кодирующими эти токсины, установить роль этих событий в адаптации токсинов к новым насекомых и возможную роль амилоидогенных последовательностей в кристаллизации протоксинов Cry. Публикации по результатам первого года выполнения Проекта: 1. Shikov A.E., Malovichko Yu.V., Nizhnikov A.A., Antonets K.S. Dissecting the evolutionary mechanisms of the 3-domain Cry toxins diversity // BMC Bioinf., 2020, V.21 (Suppl. 20), P.2. 2. Belousova M.E., Malovichko Yu.V., Shikov A.E., Nizhnikov A.A., Antonets K.S. Dissecting the environmental consequences of Bacillus thuringiensis application for natural ecosystems // Toxins (MDPI), 2021, V.13., e.355.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Второй год выполнения проекта был посвящен анализу пангенома Bacillus thuringiensis и всего рода Bacillus, а также поиску новых природных изолятов видов B. thuringiensis. Была проведена кластеризация генов-ортологов не только в рамках пангенома B. thuringiensis, но и всего рода Bacillus, ввиду того, что границы вида для B. thuringiensis не являются однозначно определенными. Набор данных содержал 4094 генома, из которых 889 были представлены сборками высокого уровня (Complete и Chromosome). Всего в состав набора было включено 89 видов, при этом наиболее многочисленными видами были B. cereus, B. subtilis, B. thuringiensis, B. velezensis и B. anthracis. Реконструированный пангеном содержал 19987697 уникальных генов (найденных и восстановленных согласно алгоритму Panaroo), которые образовывали 176058 ортологичных кластеров с отсечкой по идентичности последовательностей в 95%, 338 из которых относились к общим для рода коровым генам, 7599 генов были представлены в диапазоне от 15 до 95% геномов, а оставшиеся 176057 были найдены в менее чем 15% геномов. При этом последние две группы генов характерны для представителей различных видов. Для полученных кластеров была проведена функциональная аннотация с использованием инструмента eggNOG в режиме поиска с применением программы mmseqs2. При этом поиск аннотаций осуществляли для всех белок-кодирующих генов в пангеноме. С помощью данного инструмента были получены соответствующие аннотационные коды из баз Clusters of Orthologous Genes (COG), Gene Ontology (GO) и KEGG Pathway. В результате анализа функционального обогащения групп генов относящихся к разным вида в составе рода Bacillus, было выявлено, что характер обогащений B. cereus и B. thuringiensis во многом перекрывается, при этом основными выявленными особенностями являются выраженные протеазная и пептидазная активности, поверхностные структуры клетки, а также большое число экспортеров, что соотносится с механизмами патогенеза этих бактерий: B. cereus и B. thuringiensis секретируют внеклеточные факторы с токсической активностью против человека и насекомых соответственно. Важно отметить, что функциональная схожесть также подтверждает размытые границы между этими видами: они входят в группу B. cereus sensu lato, представителей которых зачастую нельзя однозначно отнести к определённому виду. Для автоматизации поиска набора маркеров нами был разработан конвейер обработки геномных данных c использованием системы управления рабочим процессом Snakemake (https://snakemake.github.io/). Полученный конвейер был использован для анализа набора из 30 геномных сборок штаммов B. thuringiensis, отнесенных к наиболее представленным сероварам. В результате был получен набор из 5 маркерных генов, который позволяет разделить 7 сероваров и кроме того позволяет предсказать некоторые из хозяйственно-ценных признаков, так как два маркера, присущие сероварам darmstadiensis и tolworthi, приходятся на компоненты нерибосомальной пептидсинтазы, и белок глицерофосфорил-диэфир фосфодиэстераза. Первый из них участвуют в синтезе нерибосомальных пептидов, в частности, циклических липопептидов фунгицидного действия, тогда как второй белок служит для солюбизилации фосфата из почвы, что оказывает ростостимулирующий эффект на растения при наличии бактерий в ризосфере или на поверхности растений. На основе выявленных маркеров были получены праймеры для тест-системы, позволяющей определять серовары новых изолятов B. thuringiensis. Для практической апробации разработанных на предыдущих этапах программных средств аннотации геномов B. thuringiensis и сравнения их с уже известными штаммами, проведен сбор природных образцов почв и выделение из них изолятов B. thuringiensis. В окрестностях озера Байкал были отобраны 14 образцов почвы с целью выделения изолятов Bacillus thuringiensis. Из данных образцов были выделены 72 изолята, из которых 4 предположительно относились к виду B. thuringiensis. Использование ПЦР-системы подтвердило наличие во всех них 3 маркеров, характерных для B. thuringiensis, хотя и не позволило определить однозначно серовар. Однако, по наличию среди выявленных маркеров нерибосомальной пептидсинтазы и фосфосоллюбилизирующего белка глицерофосфорил-диэфир фосфодиэстеразы можно заключить, что выделенные изоляты могут обладать ценными ростстимулирующими и фунгицидными активностями. Геномы этих 4 изолятов были секвенированы с использованием технологий секвенирования второго (Illumina) и третьего (Nanopore) поколений. Полученные сборки геномов были аннотированы, благодаря чему был установлен спектр инсектицидных факторов вирулентности, представленных в геноме каждого из изолятов. Также были получены трансфецированные клетки Sf9, которые продуцировали рецепторы токсинов Cry, принадлежащие Galleria mellonella, активно используемому модельному насекомому, и Leptinotarsa decemlineata, широко распространенному виду насекомых-вредителей. Полученные клетки позволили проверять на них действие токсинов Cry. Таким образом, в результате выполнения второго года проекта был проведен анализ пангенома рода Bacillus, включавший кластеризацию ортологичных генов и функциональную аннотацию полученных кластеров. Был определен набор уникальных маркеров, позволяющих определять принадлежность природных изолятов к одному из семи наиболее распространенных сероваров. Выделены четыре изолята B. thuringiensis из образцов почвы, собранных в окрестностях озера Байкал и проведено их полногеномное секвенирование. Также были получены трансфецированные клетки Sf9, которые можно использовать для оценки токсического действия токсинов Cry. Публикации по результатам второго года выполнения Проекта: 1. Malovichko Yu.V., Shikov A.E., Nizhnikov A.A., Antonets K.S. In silico search for the hallmarks of plant-associated phenotypes in Bacillus strains // The FASEB Journal, 2021, V. 35 (Suppl. 1) 2. Shikov A.E., Malovichko Yu.V., Alagov R.O., Nizhnikov A.A., Antonets K.S. Conservative blocks in C-terminal regions of 3-D Cry toxins exhibit amyloidogenic properties // BMC Bioinf., 2021, V.22 (Suppl. 16), P.9.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Третий год выполнения проекта был посвящен разработке автоматизированной системы для предсказания свойств природных изолятов B. thuringiensis с последующей экспериментальной проверкой предсказанных с ее помощью свойств, а также созданию единой публичной базы данных, объединяющей имеющуюся информацию об известных штаммах рода Bacillus, полученную как экспериментальным путем, так и на основе биоинформатических предсказаний. Таким образом, в ходе выполнения работ третьего года Проекта была создана система автоматизированного анализа бактериальных геномных данных под названием «BacPack», полный код которой доступен по адресу https://github.com/lab7arriam/BacPack. BacPack состоит из серии взаимосвязанных модулей, отвечающих за комплексное исследование последовательностей бактериальных геномов, начиная с контроля качества исходных данных секвенированния нуклеотидных фрагментов и их de novo объединением в протяженные последовательности и заканчивая предсказанием факторов вирулентности и детерминант антибактериальных, инсектицидных, фунгицидных и других свойств исследуемого штамма. Система была создана на основе системы управлениями потоками исполнения Snakemake и помещена в Docker-контейнер для упрощения запуска разработанной системы на любом устройстве. Далее с помощью разработанной системы были предсказаны свойства секвенированных в ходе первого и второго года выполнения Проекта природных изолятов B. thuringiensis (b.2.4, b.2.5, b.14.2, b.14.5, in.1.1, in.6.1). Согласно полученным результатам анализа, все исследованные природные изоляты B. thuringiensis предположительно обладают антибактериальными и цитотоксичными свойствами, а также проявляют активность против представителей Чешуекрылых (Lepidoptera) и Таракановых (Blattodea). За исключением штамма b.14.5, все проанализированные природные изоляты, вероятно, будут демонстрировать активность против представителей Полужесткокрылых (Hemiptera). Вероятно, изоляты b.2.5, b.14.2, b.14.5 также будут обладать ингибиторными свойствами, b.14.2, b.14.5 - антибактериально-фунгицидными, а штаммы in.1.1, in.6.1 будут проявлять активность против представителей Жесткокрылых (Coleoptera), in.1.1, in.6.1 против Двукрылых (Diptera), и b.14.5 против круглых червей (Nematoda). Полученные данные о предсказанных свойствах природных изолятов были экспериментально проверены в отношении принадлежащих к 4 отрядам личинок живых насекомых, а также ряда патогенов сельскохозяйственных культур, включая 7 штаммов бактерий (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pectobacterium atrosepticum, Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringa, Pseudomonas syringae pv. maculicola, Pseudomonas syringae pv. tomato, Clavibacter michiganensi) и один штамм гриба (Fusarium oxysporum). По результатам биотестирования все изученные изоляты являлись вирулентными или слабовирулентными в отношении насекомых отряда Lepidoptera (Чешуекрылые) и Hemiptera (Полужесткокрылые). Для четырех штаммов (in.1.1, in.6.1, b.2.4, b.14.5) была показана активность в отношении личинок насекомых отряда Blattodea (Таракановые), а для штаммов in.1.1, in.6.1, b.14.2, b.2.5 в отношении отряда Coleoptera (Жесткокрылые). Для двух штаммов (b.2.4 и b.14.2) была также идентифицирована фунгицидная активность в отношении Fusarium oxysporum, тогда как ни один из штаммов не проявил антибактериальную активность. Некоторые расхождения с результатами биоинформатических предсказаний могут свидетельствовать о неполноте информации, представленной в существующих базах данных. Можно также предположить, что за наблюдаемые эффекты отвечают новые, ранее не описанные генные кластеры. Таким образом, для накопления и систематизации данных о геномах штаммов, относящихся к роду Bacillus, была создана веб-версия BacPack’а в составе с базой данных штаммов рода Bacillus, которая в настоящее время доступна по адресу https://lab7.arraim.ru/database. В базу данных, помимо возможности получения доступа к информации о штаммах с секвенированным полным геномом, была также интегрирована возможность загрузки информации о новых изолятах и проведении анализа их геномов. В целом, созданная база данных способна не только хранить и предоставлять информацию об экспериментальных и предсказанных биоинформатически свойствах штаммов рода Bacillus, а также в автоматическом режиме проводить аннотацию загруженных геномных данных изолятов Bacillus. Таким образом, в результате выполнения третьего года Проекта была создана система автоматизированного анализа бактериальных геномных данных под названием «BacPack», с помощью которой были предсказаны свойства шести секвенированных в ходе первого и второго года выполнения Проекта природных изолятов B. thuringiensis. Предсказанные биоинформатически свойства были экспериментально проверены в отношении личинок ряда насекомых, а также важных фитопатогенов (7 бактерий и 1 гриба). В ходе последнего этапа выполнения работ третьего года Проекта была разработана публичная база данных, позволяющая объединять имеющуюся информацию об известных штаммах рода Bacillus, полученную как экспериментальным путем, так и на основе биоинформатических предсказаний, сделанных с помощью интегрированной в базу данных веб-версии BacPack’а. По результатам выполнения третьего года Проекта были представлены три доклада на международных конференциях и 2 на всероссийской, а также опубликована одна работа в рейтинговом международном издании и подготовлена рукопись по рекомбинации токсинов Cry.