КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 20-76-10044

НазваниеРазработка программного комплекса, базы данных и системы генетических маркеров для быстрого типирования изолятов бактерии Bacillus thuringiensis и полной характеристики их хозяйственно-ценных свойств

РуководительАнтонец Кирилл Сергеевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии", г Санкт-Петербург

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2020 - 06.2023 

КонкурсКонкурс 2020 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-104 - Агробиотехнологии

Ключевые словаBacillus thuringiensis, биологические препараты, агробиотехнология, токсины, бактерия, геномика, анализ данных, полифункциональные свойства, базы данных

Код ГРНТИ68.03.07


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Приоритетной задачей современного сельского хозяйства и биотехнологии является производство экологически чистой продукции. Одним из путей решения этой задачи является постепенный отказ от химических пестицидов в пользу биологических средств борьбы с насекомыми-вредителями растений. Для создания таких препаратов активно используются различные виды живых организмов, но более половины всего объема рынка биологических препаратов занимают бактериальные препараты на основе различных штаммов грамположительной спорообразующей бактерии Bacillus thuringiensis. Этот вид бактерий продуцирует широкий ряд разнообразных белковых токсинов, активных в отношении определенных видов насекомых. В то же время известно, что в обеспечение вирулентности и патогенности бактерий этого вида вовлечено большое количество факторов, которые не ограничиваются основными группами токсинов. Кроме того, штаммы B. thuringiensis, зачастую, обладают рядом других полезных для сельского хозяйства свойств, к которым отнести антибактериальную, фунгицидную и ростостимулирующую активности. Несмотря на высокую актуальность исследований в области в области создания новых комплексных биологических средств борьбы с насекомыми-вредителями, многие ключевые молекулярные аспекты хозяйственно-значимых свойств бактерии Bacillus thuringiensis остаются мало изученными и недостаточно систематизированными. В частности, отсутствуют программы для системного поиска в геномах штаммов этого вида молекулярных детерминант вирулентности и патогенных свойств для различных систематических групп организмов-вредителей, фунгицидной и антибактериальной активности, а также ростостимулирующих свойств в отношении растений. Настоящий Проект посвящен разработке программ для аннотации всего комплекса молекулярных детерминант вирулентности, патогенности и полифункциональных свойств в геномах штаммов B. thuringiensis, созданию базы данных и системы генетических маркеров для быстрого типирования изолятов этой бактерии. Так, в рамках Проекта будет проведено изучение особенностей пангенома данного вида бактерий, что позволит создать программы для определения уникальных особенностей штаммов этого вида, которые существенно упростят предсказание хозяйственно-ценных свойств новых изолятов B. thuringiensis. Также результаты изучения пангенома будут использованы для создания системы на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции для быстрого и экономичного типирования B. thuringiensis. В рамках Проекта будет проведено изучение эволюции основной группы токсинов этого вида, токсинов Cry, и механизмов их адаптации к новым видам насекомых-хозяев. Созданные в ходе выполнения Проекта программы будут апробированы на геномах новых природных изолятов B. thuringiensis для предсказания их свойств. Полученные данные будут интегрированы в виде уникальной базы данных, которая будет агрегировать имеющуюся информацию о геномах и фенотипах штаммов B. thuringiensis и всем комплексе их хозяйственно-ценных характеристик. Подобные базы существуют для ряда модельных организмов и важных патогенов и существенно облегчают поиск информации о молекулярных механизмах, детерминирующих различные фенотипические свойства, предсказание характеристик и позволяют быстро и эффективно проводить сравнение различных штаммов этих организмов. В настоящее время, такая база данных для B. thuringiensis отсутствует. В рамках Проекта планируется восполнить этот пробел и создать такую базу данных, которая не только позволит пользователям легко сравнивать как предсказанные, так и подтвержденные экспериментально свойства уже известных штаммов по целому ряду параметров, но и будет предоставлять возможность для загрузки информации о новых изолятах и проведении анализа их геномов. В целом, в ходе выполнения настоящего Проекта будет впервые создан комплекс программ для определения хозяйственно-значимых свойств штаммов B. thuringiensis на основе данных геномного секвенирования, проведения комплексного сравнительного анализа их геномов, включая автоматизированную аннотацию молекулярных детерминант вирулентности, патогенности и полифункциональных свойств. На основе данных, полученных с использованием разработанных программ, будет создана база данных, агрегирующая информацию о совокупности свойств штаммов B. thuringiensis. Также будет уточнен ряд эволюционных аспектов приспособления B. thuringiensis к определенным группам насекомых-хозяев и разработана система генетических маркеров для быстрого типирования изолятов B. thuringiensis. Полученные в ходе выполнения Проекта результаты существенно упростят многие ключевые этапы скрининга и характеристики новых изолятов B. thuringiensis, от их выделения и описания хозяйственно-значимых свойств до создания на их основе новых биологических препаратов с полифункциональными свойствами, применимых в органическом земледелии.

Ожидаемые результаты
Ожидаемые в рамках Проекта результаты будут обладают высокой значимостью и новизной. Впервые будет разработан комплекс программ для системного поиска в геномах бактерий B. thuringiensis генов, отвечающих за вирулентность этих штаммов в отношении различных систематических групп организмов, а также за наличие у них всего спектра антибактериальных, фунгицидных и ростостимулирующих свойств. Также будет произведено изучение эволюции наиболее полно охарактеризованной группы токсинов B. thuringiensis, токсинов Cry (от crystal, кристалл), будет проанализирована роль рекомбинационных обменов доменами между этими токсинами в адаптации к новым видам насекомых-хозяев, будет изучена эволюция N- и C-терминальных протеолизируемых участков протоксинов Cry и роль их склонных к агрегации участков в кристаллизации протоксинов. Впервые будет изучен пангеном вида B. thuringiensis. На основе этих исследований будет создана программа для сравнения геномов штаммов этого вида и выявления их уникальных особенностей. Результаты изучения пангенома будут использованы для создания системы генетических маркеров для быстрой и экономичной идентификации серотипов B. thuringiensis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции. Созданные в рамках Проекта программы для обработки геномных данных B. thuringiensis будут апробированы для предсказания комплекса свойств новых природных изолятов этого вида, которые затем будут проверены экспериментально. С использованием полученных программ будет создана база данных с публично доступным веб-интерфейсом, которая станет первой базой данных, агрегирующей широкий спектр геномной и фенотипической информации о штаммах B. thuringiensis, и существенно упростит функциональную аннотацию геномов новых изолятов этого вида. Полученные результаты будут обладать высокой значимостью на мировом уровне, поскольку значительно облегчат определение всего комплекса свойств новых изолятов B. thuringiensis, их сравнение с уже изученными штаммами, внесут вклад в исследование эволюции бактериальных токсинов и механизмов адаптации бактерий к новым видам хозяев, а также создадут основу для создания новых полифункциональных биологических препаратов с уникальным спектром хозяйственно-ценных свойств.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Первый год выполнения Проекта был посвящен комплексной характеристике и анализу последовательностей факторов, определяющих полезные свойства бактерий вида Bacillus thuringiensis, такие как инсектицидные, фунгицидные, антибактериальные и стимулирующие рост растений свойства. В результате выполнения первого года Проекта был составлен список факторов вирулентности и молекулярных детерминант антибактериальных, фунгицидных и ростостимулирующих свойств B. thuringiensis, который включал более 50 разных хитиназ, более 20 разных групп бактерицидных факторов и различных факторов, стимулирующих рост растений, в том числе 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) дезаминазу, индол пируватдекарбоксилазу, фосфат-солюбилизирующий фермент и сидерофоры. Для каждой из этих групп были получены последовательности белков (всего 24355, среднее количество последовательностей на группу белков – 738), которые затем были кластеризованы и подвергнуты дополнительной фильтрации, чтобы избавится от неправильно аннотированных последовательностей. В результате были получены 162 кластера последовательностей со средним количеством кластеров на группу, равным 4,9, и средним количеством последовательностей на кластер, равным 65,5. Для каждого кластера, содержащего более одной последовательности, были созданы скрытые марковские модели (HMM) для поиска соответствующих детерминант как в массиве аминокислотных последовательностей, так и в геномах, и проведена валидация полученных моделей на доступных геномах штаммов рода Bacillus. На основании использованного подхода была создана компьютерная программа для автоматизированного поиска представителей всех указанных выше групп факторов в геномах B. thuringiensis. Для проверки полноты метаболических и регуляторных путей, вовлеченных в обеспечение антибактериальных, фунгицидных и ростостимулирующих свойств, была разработана программа, основанная на интеграции инструментов HMMER и PePPER, с привлечением данных принадлежности к метаболическим путям KEGG, полученных при помощи программы eggNOG v2.0.1.b-2-g816e190. Были получены последовательности 1269 генов, кодирующих токсины Cry вместе с координатами доменов этих токсинов, построены филогенетические деревья для аминокислотных последовательностей токсинов Cry и их доменов, на основании которых был сделан вывод о их относительно независимой эволюции. Было выявлено 60 событий рекомбинации между различными представителями токсинов Cry, и установлено, что эти события рекомбинации приводили возникновению стабилизирующего эволюционного отбора в возникших сочетаниях доменов, проведено изменение силы эволюционного отбора в токсинах Cry после рекомбинации. Также было установлено, что события рекомбинации, приводящие к обмену третьим доменов между токсинами Cry, приводили к смене спектра насекомых, против которых действовали эти токсины. С помощью программ SARP и Waltz были выявлены амилоидогенные участки в составе N- и C-терминальных фрагментах протоксинов Cry. Некоторые из этих амилоидогенных последовательностей были ассоциированы с консервативными блоками в составе С-терминальных участков, что позволяет сделать предположение о том, что роль С-терминального участка в кристаллизации может обеспечиваться именно посредством локальной агрегации токсинов в амилоидогенных сайтах. Таким образом, в ходе выполнения первого года Проекта был составлен подробный список как минорных факторов вирулентности, так и факторов, отвечающих за фунгицидные, антибактериальные и стимулирующие рост растений свойства бактерий Bacillus thuringiensis, который позволил создать программный инструмент для автоматизированного поиска этих факторов в геномах бактерий. Также был проведен детальный анализ эволюции трехдоменных токсинов Cry, который позволил выявить большое количество событий рекомбинации между генами, кодирующими эти токсины, установить роль этих событий в адаптации токсинов к новым насекомых и возможную роль амилоидогенных последовательностей в кристаллизации протоксинов Cry. Публикации по результатам первого года выполнения Проекта: 1. Shikov A.E., Malovichko Yu.V., Nizhnikov A.A., Antonets K.S. Dissecting the evolutionary mechanisms of the 3-domain Cry toxins diversity // BMC Bioinf., 2020, V.21 (Suppl. 20), P.2. 2. Belousova M.E., Malovichko Yu.V., Shikov A.E., Nizhnikov A.A., Antonets K.S. Dissecting the environmental consequences of Bacillus thuringiensis application for natural ecosystems // Toxins (MDPI), 2021, V.13., e.355.

 

Публикации

1. Белоусова М.Е., Маловичко Ю.В., Шиков А.Е., Нижников А.А., Антонец К.С. Dissecting the environmental consequences of Bacillus thuringiensis application for natural ecosystems Toxins (MDPI), V. 13, e355 (год публикации - 2021).

2. Шиков А.Е., Маловичко Ю.В., Нижников А.А., Антонец К.С. Dissecting the evolutionary mechanisms of the 3-domain Cry toxins diversity BMC Bioinformatics, V. 21, Suppl. 20, P.2 (год публикации - 2020).