КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 21-12-00407

НазваниеОпто-магнитные методы для ультрачувствительной нанобиосенсорики

РуководительНикитин Петр Иванович, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр "Институт общей физики им. А.М. Прохорова Российской академии наук", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2021 г. - 2023 г. 

Конкурс№55 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 02 - Физика и науки о космосе, 02-204 - Нано- и микроструктуры

Ключевые словамагнитные наноструктуры, наночастицы, нанокомпозиты с магнитным ядром, нелинейное намагничивание, магниторезонансная томография, неинвазивная регистрация, биосенсорика, медицинская in vitro диагностика, целевая доставка лекарственных средств.

Код ГРНТИ29.19.39


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Проект посвящен созданию новых магнитных и композитных (с магнитным ядром) оптических наноструктур и наночастиц, функционализированных биораспознающими рецепторами, а также развитию высокочувствительных магнитных методов регистрации таких наноагентов в непрозрачных средах за счет нелинейного перемагничивания и повышения контраста магниторезонансной томографии для решения проблем нанобиосенсорики. На основе указанных магнитных методов детекции и томографии, а также полученных наноструктур будут разработаны новые методы измерения ультранизких концентраций целого ряда аналитов в непрозрачных средах сложного состава, в том числе в качестве важного шага на пути к решению проблем диагностики и целевой доставки лекарственных средств. В настоящее время разработка новых магнитных наноструктур для биомедицинских применений является актуальной задачей. По мере получения новых научных результатов привлекательность магнитных наночастиц по сравнению с агентами из других неорганических материалов в этой области только неуклонно возрастает. Это связано с целым рядом обстоятельств. Так, уже детально продемонстрирована низкая токсичность малых доз наночастиц оксидов железа, что снимает многие вопросы и опасения в отношении этих нанотехнологических объектов. Целый ряд препаратов на основе оксидов железа уже допущен для внутривенных инъекций человеку, например для увеличения контраста магниторезонансной томографии опухолей, при анемии и т. д. Кроме того, в отличие от остальных частиц магнитные нанообъекты обладают уникальными возможностями манипулирования с помощью внешнего магнитного поля, а также индукционного нагрева даже в глубоких тканях и органах внутри живого организма. Другим преимуществом магнитных наноструктур по сравнению с традиционными оптическими метками биохимических реакций является возможность их неинвазивной регистрации в различных непрозрачных средах, а также на большой глубине в живом организме, в том числе в глубине тела человека. В рамках проекта планируется разработка нового типа «умных» нанобиосенсоров, способных детектировать ультранизкие концентрации нуклеиновых кислот (без этапов усиления сигнала и амплификации реакций), низкомолекулярных соединений и других аналитов, что актуально для исследования новых возможностей задач ранней диагностики заболеваний и направленной доставки лекарственных препаратов. Решение этой задачи может значительно изменить существующий статус терапии и диагностики заболеваний, а также существенно расширить возможности в решении практических биомедицинских задач, имеющих высокую социальную значимость.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будут созданы новые магнитные и композитные (с магнитным ядром) оптические наноструктуры и наночастицы, функционализированные биораспознающими рецепторами. Дальнейшее развитие получат методы высокочувствительной количественной регистрации таких агентов в непрозрачных средах за счет их нелинейного перемагничивания (МPQ от англ. Magnetic Particle Quantification), а также повышения контраста магниторезонансной томографии (МРТ) для нанобиосенсорики. На основе указанных магнитных методов детекции и томографии, а также полученных наноструктур будут разработаны фундаментальные основы оптомагнитного измерения ультранизких концентраций нуклеиновых кислот и малых молекул (олигонуклеотидов, антибиотиков, токсинов) в образцах сложного состава. Конкретными задачами проекта являются создание новых гибридных наноструктур для «умных» материалов - нанобиосенсоров, способных детектировать молекулы нуклеиновых кислот и малые молекулы in vitro, а также развитие магнитных методов визуализации и контроля таких объектов в непрозрачных средах, в том числе неинвазивно в живых организмах. Такие «интеллектуальные» наноструктуры откроют новые возможности в создании тераностических систем нового поколения, характеризующихся направленной и контролируемой доставкой нанобиопрепаратов к месту необходимого воздействия в организме. Ожидаемые результаты будут иметь высокую научную, практическую и социальную значимость не только для РФ, но и для последующего развития предлагаемых подходов в ведущих лабораториях мира.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Методами коллоидной химии синтезированы новые магнитные и гибридные оптические наночастицы. Получены изображения этих объектов с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Осуществлён синтез анизотропных магнитных частиц. Получены результаты исследования магнитных свойств синтезированных наночастиц с помощью сверхпроводящих квантовых интерферометров на установке MPMS XL SQUID magnetometer (Quantum Design, USA). Среди синтезированных магнитных наноструктур выявлены образцы, обладающие максимальными намагниченностью и нелинейностью зависимости B(Н) при сравнительно небольших магнитных полях с напряжённостью до 240 Э. Установлены закономерности магнитных свойств МЧ, с учетом которых были адаптированы и оптимизированы методы регистрации по нелинейному перемагничиванию синтезированных гибридных композитных наноструктур, обладающих максимальной нелинейностью намагничивания B(H) в слабых магнитных полях с амплитудой до 100 Э и 200 Э. Оптимизированы экспериментальные устройства двух типов, работающие на принципе MPQ (от агл. Magnetic Particle Quantification). Каждое такое устройство реализовано с применением низкотоковых электронных компонентов, позволяющих генерировать две переменные составляющие магнитного поля с суммарной амплитудой до 100 Э и 200 Э, соответственно. В первом случае были реализованы высокочувствительные портативные варианты экспериментальных MPQ устройств, а во втором – настольные. Разработаны методы покрытий и модификации поверхности наноструктур функциональными распознающими рецепторами (белковыми молекулами, ДНК) с целью применения наноструктур, обладающих высокой нелинейностью В(Н), в качестве нанометок для биосенсорных применений и для наносенсорных носителей лекарственных препаратов. Проведена оптимизация процессов функционализации гибридных наноструктур для обеспечения минимального неспецифического связывания с неадресными молекулами. Выполнена всесторонняя характеризация структур с помощью атомно-силовой и просвечивающей электронной микроскопии, а также по динамическому светорассеянию. Разработаны методы преодоления кинетических ограничений, обеспечения высокой скорости биохимических реакций и получения итогового результата по измерению ультрамалых концентраций аналитов. Разработан метод для определения характеристик связывания магнитных биоконъюгатов с адресными молекулами, который будет использован на последующих этапах работы по проекту для разработки высокочувствительных нанобиосенсоров. Получены результаты исследования оптомагнитной биосенсорной платформы, основанной на использовании уникальной комбинации стеклянных сенсорных чипов с нанесенным слоем модифицированного графена, функционализированного аптамерами, и регистрацией магнитных нанобиоконъюгатов, используванных одновременно как в качестве агентов магнитной сепарации, так и в качестве биоспецифичных нанометок. Разработана ультрачувствительная аптасенсорная платформа для определения низкомолекулярных соединений. Она основана на применении графеновых полевых транзисторов и высокочувствительной детекции конформационных изменений трёхмерной структуры иммобилизованных на сенсорном чипе аптамеров в результате их специфического взаимодействия с целевыми молекулами. На примере определения низкомолекулярных микотоксинов, в частности охратоксина А (ОТА), показано, что данные сенсоры на основе структур графен-аптамер обеспечивают возможность проведения анализа с рекордно быстрым временем отклика в области сверхнизких концентраций. Для OTA время отклика составило всего 10 секунд при пределе обнаружения 1,4 пМ. Таким образом, разработанный биосенсор позволяет регистрировать микотоксины более, чем в 30 раз быстрее по сравнению с любыми другими известными методами обнаружения данных соединений на основе аптамеров. Установлено, что созданные сенсоры обеспечивают надёжную регистрацию низкомолекулярных соединений в режиме реального времени, в том числе непосредственно в образцах сложного матрикса, например, в пробах вина без предварительной подготовки. Получены результаты исследования зависимости амплитуды регистрируемых сигналов от концентрации аналита (ОТА) в диапазоне от 6 пМ до 7 нМ. Показана линейная зависимость сигнала от концентрации в диапазоне 6-100 пМ. Аналитический предел обнаружения, рассчитанный как пересечение линейной зависимости сигнал-концентрация с горизонтальной прямой, соответствующей сумме сигналов отрицательного контроля и удвоенного стандартного отклонения, составил 1,4 пМ. Это существенно (более чем на 3 порядка) ниже допустимого уровня OTA в продуктах питания, который составляет около 5 нМ. Это позволит реализовать более чувствительные методы измерения концентрации микотоксинов в кормах для животных и продуктах питания для человека, особенно для детского питания, чем у массово используемых аналитических методов в настоящее время. Продемонстрирована также высокая специфичность созданных аптасенсоров, а также входящих в его состав биораспознающих рецепторных молекул (аптамеров к ОТА). Проведена демонстрация эффективности разработанных сенсоров для анализа реальных пищевых продуктов, в том числе, образцов вина. Была продемонстрирована возможность нескольких циклов регенерации сенсорной поверхности с помощью раствора мочевины. Таким образов, достигнутые значения пределов обнаружения на несколько порядков ниже регламентированных в настоящее время максимально допустимых концентраций микотоксинов в пищевых продуктах. Проведён анализ возможностей применения наночастиц в качестве носителей химиотерапевтических препаратов путём создания на их основе, по существу, селективных наносенсоров, автономно циркулирующих в кровотоке живого организма, способных обнаруживать и связываться с клетками раковых опухолей. Как правило, подобная стратегия включает функционализацию наночастиц биораспознающими рецепторами к фрагментам мембран раковых клеток с последующим мониторингом локализации таких агентов в опухолях. Выявлен ряд факторов, определяющих эффективность нацеливания подобных наносенсоров к адресным клеткам, такие как тип рецепторов, тип наноносителей, их размер, дзета-потенциал, доза, вводимая в организм лабораторных животных, время циркуляции в кровотоке наноносителей и ряда других параметров. Установлено, что активное нацеливание наночастиц изменяет биораспределение наноносителей и их неспецифический захват в различных органах лабораторных животных. В частности, исследования показали, что увеличение доставки и накопления адресных наночастиц в раковых опухолях сопровождается значительным снижением их поглощения в селезенке. При этом не прослеживается каких-либо закономерностей между изменениями содержания наночастиц в других органах лабораторных животных и в раковых опухолях. Результаты проведенного анализа оптимальных биораспознающих рецепторов для наносенсоров к разным типам раковых опухолей могут быть использованы для повышения адресной доставки лекарственных препаратов для эффективного подавления как самих опухолей, так и метастазов на поздних стадиях развития заболеваний. Выявленные закономерности будут учтены при проведении экспериментов на последующих этапах работ по проекту. Запланированные на год работы выполнены. Публикационные обязательства перевыполнены: опубликована одна и принята к публикации вторая статья в журналах с импакт- факторами 5,924 и 10,618, соответственно, относящихся к первому квартилю Q1, что, по правилам конкурса, засчитывается за 4 публикации. Кроме того, результаты разработок докладывались научному сообществу в качестве 5 приглашенных докладов, 1 устного и 2 стендовых докладов на ведущих профильных конференциях.

 

Публикации

1. Дроздов А.С., Никитин П.И., Розенберг Дж.М. Systematic Review of Cancer Targeting by Nanoparticles Revealed a Global Association between Accumulation in Tumors and Spleen International Journal of Molecular Sciences, V. 22, P. 13011 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/ijms222313011

2. Некрасов Н., Ярич С., Киреев Д., Емельянов А.В., Орлов А.В., Гаджански И., Никитин П.И., Акинванде Д., Бобринецкий И. Real-time detection of Ochratoxin A in wine through insight of aptamer conformation in conjunction with graphene field-effect transistor Biosensors & Bioelectronics, - (год публикации - 2022)


Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В течение второго года была проведена оптимизация составляющих проекта: гибридных магнитных наноструктур, магнитных методов их регистрации, процессов функционализации наноструктур, процесса выбора оптимальных биораспознающих рецепторов и форматов биосенсорики. Методами коллоидной химии синтезированы магнитные наночастицы (МЧ), состоящие из 20-нм ядер из оксидов железа в общей полимерной оболочке. Эксперименты продемонстрировали суперпарамагнитный характер перемагничивания синтезированных частиц, отсутствие остаточной намагниченности, хорошую коллоидную стабильность и низкое неспецифическое связывание. Это позволяет применять частицы в качестве нанометок иммунохимических реакций, регистрируемых с помощью оптимизированных MPQ-регистраторов (анг. Magnetic Particle Quantification) на комбинаторных частотах при нелинейном перемагничивании в сравнительно слабых двухчастотных магнитных полях, амплитуда которых не превышает 100 Э. Разработана методика высокопроизводительного скрининга наиболее эффективных биораспознающих молекул (антител, аптамеров), которые обеспечивают быстрое и прочное связывание с аналитом-мишенью. Это, в свою очередь, позволило достичь более высокой чувствительности биосенсоров и улучшить пороги детекции комплементарных аналитов, что было продемонстрировано на плоских сенсорных чипах и объемных пористых иммунохроматографических тест-полосках. Проведены исследования кинетических характеристик целого ряда моноклональных антител с помощью компактных анализаторов на основе мультиплексной спектрально-корреляционной интерферометрии и низкокогерентной интерферометрии. Выбранные оптимальные антитела использованы для разработки биосенсоров для детекции ряда белковых маркеров заболеваний. Достигнуты уникальные для быстрых тестов аналитические параметры. Так, например, предел обнаружения сердечного тропонина I составил 0,08 нг/мл, а динамический диапазон более 3 порядков при малом времени анализа 25 минут. Таким образом, разработанные методы биосенсорики и вспомогательных аналитических технологий обладают простотой проведения актуальных биоаналитических измерений и, в то же время, демонстрируют уникальную совокупность параметров. Кроме того, развитые сенсорные методы высокочувствительных измерений сверхмалых величин были распространены и для инженерной геологии, где в качестве отраженной волны используется рассеянное изучение от напряженного участка протяженного оптического волокна. В ходе экспериментов также разработан конкурентоспособный набор оптических и магнитных методов измерений, позволяющих исследовать гибридные иммунокомплексы с помощью визуализирующей проточной цитометрии для высокочувствительной количественной детекции внеклеточных везикул, выделенных из раковых клеток и клинических образцов пациентов c онкологическими заболеваниями. Результаты опубликованы в двух статьях в журналах Q1 и одной статье в российском журнале Q2, а также были представлены в виде 10 докладов на ведущих конференциях.

 

Публикации

1. Горшков Б.Г., Алексеев А.Е., Симикин Д.Е., Таранов М.А., Жуков К.М., Потапов В.Т. A Cost-Effective Distributed Acoustic Sensor for Engineering Geology Sensors, V. 22, P. 9482 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/s22239482

2. Орлов А.В., Малкеров Ю.А., Новичихин Д.О., Знойко С.Л., Никитин П.И. Multiplex Label-Free Kinetic Characterization of Antibodies for Rapid Sensitive Cardiac Troponin I Detection Based on Functionalized Magnetic Nanotags International Journal of Molecular Sciences, V. 23, P. 4474 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/ijms23094474

3. Орлов А.В., Новичихин Д.О., Пушкарёв А.В., Малкеров Ю.А., Знойко С.Л., Гутенева Н.В., Орлова Н.Н., Горшков Б.Г., Никитин П.И Регистрация кинетики взаимодействий молекул на основе низкокогерентной интерферометрии для разработки иммуноанализов биомаркеров сердечно-сосудистых заболеваний Доклады Российской академии наук. Физика, технические науки, T. 505, № 1, стр. 39-44 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.31857/S2686740022040101

4. Знойко С.Л., Брагина В.А., Малкеров Ю.А., Орлов А.В., Горшков Б.Г. Label-free method for screening antibodies against thyroxin Proceedings of 20th International Conference Laser Optics (ICLO 2022), IEEE Xplore, 21955712 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1109/ICLO54117.2022.9839877

5. Мочалова Е.Н., Буренин А.Г., Веремьева М.В., Скирда А.М., Горшков Б.Г. Study of Biodistribution and Accumulation of Nanoparticles in a Tumor Using Various Detection Techniques Proceedings of 20th International Conference Laser Optics (ICLO 2022), IEEE Xplore, 21955641 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1109/ICLO54117.2022.9840214

6. Никитин П.И. New Opportunities for Nanobiotechnology Based on Ultrasensitive Methods of Physical Measurements Proceedings of 20th International Conference Laser Optics (ICLO 2022), IEEE Xplore, 21955761 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1109/ICLO54117.2022.9839739


Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В течение третьего года проведены исследования по отбору среди синтезированных и использованных ранее в проекте магнитных наночастиц (МНЧ) и твёрдых фаз с развитой реакционной поверхностью таких, которые позволяли достичь в разработанных методах нанобиосенсорики наилучших аналитических параметров. С этой целью были отобраны МНЧ, характеризующиеся коллоидной стабильностью водной суспензии, хорошей миграцией частиц в нитроцеллюлозных пористых мембранах, широко применяемых в иммунохроматографических анализах (ИХА) на основе окрашенных наночастиц с визуальной индикацией порогового результата. Кроме того, выбранные МНЧ обладают необходимой нелинейной зависимостью намагниченности B(Н) при сравнительно небольших магнитных полях Н<150 Э для регистрации по нелинейному перемагничивании частиц, а также позволяют обеспечить удобную иммобилизацию антител и минимальное неспецифическое связывание конъюгатов МНЧ на твёрдых фазах в отсутствие аналита. Развиты методики выбора наиболее эффективных биораспознающих антител для магнитного иммуноанализа. С этой целью проведена оптимизация биосенсорных устройств на основе низкокогерентной интерферометрии для снижения вклада возможных источников шума при высокочувствительных оптических измерениях сверхмалых величин, в частности толщин биослоев на поверхности стекла. Развитые сенсорные методы низкокогерентной интерферометрии были распространены и на высокочувствительные измерения в инженерной геологии. На основе интерферометрических устройств развиты высокопроизводительные методы скрининга и измерения констант ассоциации и диссоциации взаимодействия биомолекул, и проведён выбор оптимальных антител для детекции двух микотоксинов в конкурентном формате и двух онкомаркеров - в сэндвич-формате иммуноанализа. С использованием выбранных антител протестирован конкурентный ИХА на тест-полосках для измерения малых концентраций микотоксинов с использованием как золотых наночастиц, так и МНЧ, применяемых в качестве меток биохимических реакций. Установлено, что оптическая контрастность МНЧ на тестовых линиях уступала золотым меткам. Однако аналитические характеристики тест-систем на основе МНЧ существенно превосходили реализованные с помощью золотых наночастиц. В частности, пороги детекции микотоксинов в продуктах питания с помощью МНЧ в сочетании с прототипами регистраторов МНЧ, основанных на нелинейном перемагничивании частиц, в 20-26 раз лучше, а динамический диапазон на 2 порядка больше, чем при фотофиксации золотых наночастиц. Функционал разработанных подходов протестирован и для детекции двух онкомаркеров в сэндвич-формате ИХА и с использованием магнитных биоконъюгатов. Установлено, что это позволяет с высокой точностью измерять концентрации обоих онкомаркеров в клинически значимых диапазонах путем быстрого 25-минутного магнитного иммуноанализа. Предложен и реализован новый одностадийный метод создания нанобиосенсоров, которые не только селективно выявляют биологическую мишень, но и могут оказывать необходимое терапевтическое воздействие, то есть осуществлять функции тераностики. Созданные нанобиосенсоры успешно испытаны для селективного подавления роста адресных клеток в in vitro экспериментах. Метод создания нанобиосенсоров включает одностадийный синтез комплексов, состоящих из золотых наночастиц, коротких интерферирующих молекул РНК и пептидов, обеспечивающих проникновение комплекса в ядра клеток. Нанобиосенсорные структуры были охарактеризованы как с применением просвечивающей электронной микроскопии, так и по сдвигу спектров локализованного поверхностного плазмонного резонанса (ЛППР) в реальном времени процесса синтеза. Продемонстрирована высокая эффективность синтезированных наносенсорных структур на примере адресной доставки малой интерферирующей РНК внутрь модельных клеток линии APRE-19, предварительно трансфицированных геном, регулирующим синтез эмбриональной щелочной фосфатазы, которую удобно регистрировать методами хемилюминесценции. Показано, что доставленные внутрь клеток молекулы РНК остались неповреждёнными, что позволило осуществить подавление целевого гена клеток, ответственного за деление и рост клеток. Разработанный метод синтеза наноразмерных биосенсорных структур удобно контролировать оптически по спектрам ЛППР и применять для внутриклеточной доставки широкого круга отрицательно заряженных макромолекул, таких как антисмысловые олигонуклеотиды, блокирующие синтез необходимых для роста клеток белков, и разнообразные типы генно-терапевтических молекул РНК. Такие подходы генетически избирательного подавления роста, например злокачественных раковых клеток, представляются перспективными, поскольку почти не воздействуют на доброкачественные клетки. Результаты работ в течение третьего года опубликованы в виде двух статьей в журналах Q1, засчитываемых по рекомендациям фонда экспертам за 4 публикации, а также представлены на ведущих научных конференциях в виде 15 докладов, из которых 1 пленарный, 1 приглашённый и 9 устных.

 

Публикации

1. Горшков Б.Г., Симикин Д.Е., Алексеев А.Е., Таранов М.А., Жуков К.М., Потапов В.Т. Brillouin-Scattering Induced Noise in DAS: A Case Study Sensors, V. 23, N 12, P. 5402 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/s23125402

2. Елизарова Т.Н., Антопольский М.Л., Новичихин Д.О., Скирда А.М., Орлов А.В., Брагина В.А., Никитин П.И. A Straightforward Method for the Development of Positively Charged Gold Nanoparticle-Based Vectors for Effective siRNA Delivery Molecules, V. 28, P. 3318 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/molecules28083318


Возможность практического использования результатов
Полученные результаты и проводимые исследования могут стать основой для создания новых подходов в биохимической in vitro диагностики, контроля качества продуктов питания и биобезопасности.