КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 21-13-00218

НазваниеГетероциклические моно- и диацетилены для получения новых веществ с противоопухолевой активностью и соединений для оптического биоимиджинга

РуководительБалова Ирина Анатольевна, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет", г Санкт-Петербург

Период выполнения при поддержке РНФ 2021 г. - 2023 г. 

Конкурс№55 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-101 - Синтез, строение и реакционная способность органических соединений

Ключевые словаАлкины, диацетилены, гетероциклы, циклизации, ендииновые антибиотики, макроциклизации, реакция Соногаширы, реакция Николаса, клик-реакции, квантово-химические расчеты, антипролиферативная активность, флюоресцентные красители, оптический биоимиджинг

Код ГРНТИ31.21.27

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Наращивание арсенала новых структур, которые могли бы стать основой для поиска новых противоопухолевых препаратов, является важной и актуальной проблемой, с учетом возможности получения на их основе принципиально новых отечественных лекарственных субстанций (не дженериков), а также сохранения резерва для создания новых лекарственных средств для будущих поколений. Природные соединения являются уникальным источником таких молекул. Одним из ярчайших примеров природных соединений с сильным ДНК-повреждающим действием являются ендииновые антибиотики. Структурная уникальность этих соединений заключается в наличии (Z)-3-ен-1,5-дииновой системы, включенной в напряжённый 9- или 10-членный цикл, что обеспечивает способность при температуре человеческого тела претерпевать циклизацию Бергмана, а образующиеся 1,4-фенилдирадикалы обеспечивают 1- и/или 2-нитевым разрывы ДНК, что и приводит к гибели клетки. Несмотря на большое число известных 10-членных природных ендииновых систем и их аналогов, участвовавших в клинических испытаниях, только два препарата были одобрены для фармацевтического рынка: Gemtuzumab ozogamicin («Милотарг»), разрешенный к применению в Европе и США для лечения CD33 (+) острой миелоидной лейкемии и Zinostatin stimalamer (SMANCS), применяющийся в Японии для лечения карциномы печени. Наряду с высокой цитотоксичностью, природные ендииновые антибиотики имеют очень низкую стабильность после выделения, а также низкую избирательность действия в отношении опухолевых и здоровых клеток, что ограничивает их применение. С момента открытия этих уникальных соединений во многих ведущих научных лабораториях продолжается поиск менее токсичных, но эффективных и более селективных противоопухолевых агентов, включающих ендииновый фрагмент. Таким образом, задача по поиску эффективных противоопухолевых средств именно среди аналогов ендииновых антибиотиков остается открытой и актуальной. Ендииновые системы, конденсированные с гетероциклами, а также содержащие 10-членный гетероендииновый фрагмент, являются практически неисследованной группой синтетических аналогов природных ендииновых антибиотиков. В то же время, включение различных гетероциклов в состав молекулы ендиина должно позволить не только влиять на скорость циклоароматизации с образованием ключевого дирадикального интермедиата, но также использовать гетероцикл как сайт для модификации ендииновой молекулы и увеличения ее аффинности к ДНК. В рамках данного проекта запланировано комплексное исследование, нацеленное на создание эффективных противоопухолевых соединений на базе новой группы циклических ендииновых систем, содержащих гетероциклические фрагменты, включая: квантово-химические расчеты для предсказания реакционной способности ендиинов и выбора целевых структур; синтез целевых молекул ендиинов и их коньюгатов с повышенной биодоступностью и коньюгатов, содержащих флуоресцентные метки. Будет также проведено изучение связывания полученных циклических ендииновых систем с ДНК с помощью расчетных и экспериментальных методов, а также их ДНК-повреждающей активности на модельных плазмидах, цитотоксичности и антипролиферативной активности на различных линиях опухолевых клеток (аденокарцинома поджелудочной железы PANC-1, глиобластома T98G, злокачественная меланома кожи SK-MEL-2, карцинома лёгкого А549, аденокарцинома печени SK-Hep-1). Библиотека более простых ациклических ендиинов, конденсированных с разнообразными серу- азот- и кислородсодержащими гетероциклами будет получена, и также проведено их биологическое тестирование с целью поиска новых противоопухолевых средств с отличными от ендииновых антибиотиков механизмами действия: например, обладающих способностью связываться с такой мишенью для противовпухолевых препаратов как тубулин. Расширение спектра молекул, которые могут быть использованы для дизайна флуоресцентрных меток под определенную задачу (с учетом конкретных физиологических параметров и использования конкретного диагностического оборудования), является актуальной задачей для развития методов оптического биоимиджинга. В настоящем проекте запланирован поиск новых флуорофоров среди синтезированных ацетиленов и диацетиленов, конденсированных с различными гетероциклами с небольшим молекулярным весом, что позволит дополнительно модифицировать их с целью смещения максимума флуоресценции в длинноволновую область (>500 нм). В качестве одного из способов модификации будет использована трансформация тройных связей в триазольные фрагменты с использованием медь-катализируемой клик-реакции. Флуоресцентные свойства полученных соединений будут исследованы для выбора наиболее перспективных соединений (высокий квантовый выход, оптимальный диапазон возбуждения и испускания, величины Стоксова сдвига) и выявления структурных особенностей, влияющих на оптические свойства. Далее для этих соединений будут проведено изучение цитотоксичности для возможности использования синтезированных флуоресцентных меток in vivo. Последующая модификация ключевых флуорофоров функциональными группами (амино-реактивными, азидными и этинильными функциями) также будет проводиться для коньюгации с синтезированными и отобранными в качестве молекул-лидеров гетероциклическими ендиинами. Планируется также получение коньюгатов последних с известными красителями группы флуоресцеина, BODIPY, цианинов, а также новыми флуоресцентными метками на основе 4,5-[диарил(гетарил)этинил]-, 4-(арилэтинил)-5-гетарилтриазолов. Задачей данной части проекта будет являться подбор лучшего красителя и оптимального сайта коньюгации нестабильной ендииновой молекулы с красителем для визуализации методами проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии при проведении биологических исследований. Отдельное внимание в проекте будет уделено разработке и исследованию эффективных гомогенных и гетерогенных каталитических систем на основе комплексов Pd(II), Cu(I) с различными органическими лигандами для кросс-сочетания Соногаширы-Хагихары – одного из ключевых инструментов при получении исходных функционализированных ацетиленов и диацетиленов, Сузуки-Мияура или Бухвальда-Хартвига, которые будут использоваться для пост-синтетической функционализации ацетиленовых и диацетиленовых гетероциклов наряду с азид-алкиновым циклоприсоединением. Планируется оптимизация каталитических систем как за счет рационального лигандного дизайна, так и выбора оптимальных условий для проведения реакции.

Ожидаемые результаты
Полученные нами предварительно данные дают основание заключить, что гетероциклический фрагмент действительно является тем ключевым структурным звеном, которое позволяет регулировать реакционную способность всей ендииновой молекулы в циклизации Бергмана, лежащей в основе механизма действия ендииновых антибиотиков. Мультидисциплинарный подход, который будет применен в проекте для решения указанной научной проблемы, включает квантово-химические расчеты для предварительного и рационального отбора целевых молекул гетероциклических ендиинов, обладающих значительной активностью в циклизации Бергмана (подвергаются циклоароматизации при температурах человеческого тела), в то же время, достаточно стабильных при выделении и хранении. На основе квантово-химических расчетов энергий активации в циклизации Бергмана и анализа влияния на активационные параметры стереоэлектронных эффектов будет дано объяснение влиянию природы гетероцикла и природы гетероатома в ендииновом цикле на реакционную способность ендиинов в циклизации Бергмана. Для расчета энергий активации будет использоваться функционал плотности, выбранный на основании результатов предварительных тестовых расчетов. В ходе тестовых расчетов будет проведено сравнение результатов, полученных с использованием различных функционалов плотности (M11, B3LYP, CAM-B3lyp и др) с результатами, полученными на основе ab initio расчетов (MP2, CASPT2, NEVPT2), и экспериментальными данными. Для моделирования будут использоваться методы автоматического поиска переходных состояний (d-ADDF). Для расчетов будут использованы как коммерческие пакеты квантово-химических программ (Gaussian, MOLCA, ORCA, BAGEL, и др), так и программы, разработанные в нашей группе. Также будут изучены процессы, проходящие на триплетных поверхностях потенциальной энергии, и точки их пересечения с синглетной поверхностью. Для расчетов будут использованы многоконфигурационные ab initio методы (CASSF, CASPT2, NEVPT2), а также spin-flip DFT методы. Анализ энергетических состояний и активационных параметров синглет-триплетного расщепления для 1,4-фениленбирадикалов позволит сделать вывод о влиянии структурных элементов в ендииновых молекулах на реакционную способность дирадикалов по отношению к донорам «H». Таким образом, будут сформированы рекомендации по конструированию наиболее перспективных гетероциклических ендииновых систем с точки зрения оптимального баланса реакционная способность/стабильность. Имеющиеся на сегодняшний день представления о взаимосвязи структура ендиинов/активность в циклизации Бергмана будут существенно расширены. Кроме этого, данный анализ будет применен не только к целевым ендииновым системам, конденсированным с гетероциклами, но и для описанных в литературе соединений с экспериментально установленной активностью, что позволит решить важную проблему – сравнение реакционной способности структурно различных ендииновых систем, полученных в других научных группах. Развитие предложенных нами ранее синтетических подходов для получения ациклических ендииновых систем, конденсированных с различными гетероциклами, и предварительная апробация методов макроциклизации, позволят отработать эффективные синтетические методики для получения библиотеки 10-членных гетероциклических ендиинов, в которых макроцикл конденсирован с гетероциклом (5- и 6-членными серу-, азот-, кислородсодержащим) и содержит гетероатом в своем составе (аза- и оксаендиинов) для проведения дальнейших экспериментальных исследований. Для синтеза таких систем будет проведена сравнительная оценка двух синтетических подходов, основанных на иодоциклизации как функционализированных иодацетиленов, так и производных диацетилена. Ряд ациклических ендииновых систем, конденсированных с бензотиофеном, индолом, индолизином, изохроменом, изохинолином, 1,2-тиазином, содержащих при тройных связях различные электроно-акцепторные заместители или группы OH, NH2 при пропаргильном атоме С будут получены с применением наиболее оптимального метода. Получение ендиинов триазольного и изоксазольного ряда запланировано с использованием нового подхода: медь-катализируемого [3+2] циклоприсоединения к 1-иоддиацетиленам. Для полученных соединений с помощью калориметрических или спектрофотометрических методов будут определены константы скорости и активационные параметры циклизации Бергмана для верификации расчетной шкалы активности и установления влияния как природы гетероцикла, так и заместителей при ацетиленовых фрагментах на реакционную способность. Предлагаемый в проекте подход предполагает теоретическое исследование не только активности гетероциклических ендиинов в циклизации Бергмана, но и определение механизма их связывания с молекулами ДНК. Будет проведено моделирование связывания ендиинов с различными гетероциклами и заместителями как в гетероциклическом фрагменте, так и ендииновом цикле, а, следовательно, с различной реакционной способностью в циклизации Бергмана. Для моделирования будут использоваться как методы молекулярного докинга, так и методы молекулярной динамики. Расчетные данные и последующая экспериментальная валидация (определение констант связывания с ДНК методами ЯМР спектроскопии, изотермической титрационной калориметрии и др.) позволят установить взаимосвязь между типом гетероцикла в структуре ендиина, его способностью образовывать дирадикалы, связываться с ДНК и ДНК-повреждающей способностью. Таким образом, будут выявлены ключевые для получения эффективных ендииновых цитостатиков структурные параметры, что позволит создать усовершенствованную шкалу в терминах: строение/реакционная способность/биологический эффект. Выявленные закономерности будут использованы для выбора наиболее оптимальных структур для создания конъюгатов ендиинов с лигандами, ответственными за избирательную доставку в опухолевые клетки, а также за селективное связывание с малой бороздкой ДНК (MGB). Так будут разработаны методы конъюгирования 10-членных ендиинов с полиаминами, сахарами и лигандами к малой бороздке, основанные на тиол-еновой клик-реакции и азид-алкиновом циклоприсоединении. В результате будут получены гибридные молекулы, состоящие из 10-членной ендииновой системы, конденсированной с гетероциклом, и структурного фрагмента, ответственного за адресную доставку ендииновой «боеголовки» в опухолевые клетки или за селективное связывание с ДНК. Будет установлен предпочтительный сайт для модификации и наиболее эффективный синтетический метод для получения таких гибридов. Будет выявлено, какая из модификаций, нацеленная (А) на повышение избирательности действия ендиинов в отношении опухолевых клеток путем конъюгации с полиаминами или углеводными фрагментами, (B) увеличение избирательности связывания с ДНК по механизму интеркаляции или взаимодействия с малой бороздкой, эффективнее как с точки зрения избирательности действия к опухолевым клеткам, так и с точки зрения синтеза. Кроме этого, будут отработаны условия для получения бифункциональных гибридов с обозначенными лигандами. Основным ожидаемым результатом по данному направлению будет получение небольшой библиотеки ендииновых конъюгатов и выбор среди них наиболее перспективных соединений для разработки на их базе противоопухолевых лекарственных субстанций. Второй тип коньюгатов гетероциклических ендиинов будет получен с флуоресцентными красителями, такими как производные флуоресцеина, BODIPY, цианины, 4,5-[диарил(гетарил)этинил]триазолы, что позволить визуализировать их локализацию в клетках в зависимости от типа гетероциклической структуры, а также способности проникать в ядро клетки. Еще одна часть проекта будет посвящена поиску более простых ациклических ендииновых систем с конкурентной реакционной способностью по отношению к макроциклическим аналогам за счет влияния стереоэлектронных эффектов на активационные параметры в циклизации Бергмана. В данном исследовании впервые будет продемонстрировано комбинированное активирующее действие на активность ендииновой системы в циклизации Бергмана природы гетероцикла и природы групп при ендииновом фрагменте. Для полученных соединений также будет проведено тестирование ДНК повреждающей способности и определение антипролиферативных способностей на линиях различных раковых клеток. Итогом этой части проекта должно стать создание библиотеки новых ациклических ендииновых систем, аннелированных с гетероциклами, которые обладают достаточной стабильностью для хранения, выделения и модификации, проявляют выраженный цитотоксический эффект, но, в то же время, не являются высокотоксичными ввиду избирательного действия в отношении опухолевых клеток. Они представляют интерес как структурно новые вещества, на базе которых могут быть разработаны отечественные принципиально новые (не дженерики) противоопухолевые лекарственные средства. Для всех серий синтезированных гетероциклических соединений будут изучены оптические свойства с целью выявления новых флуорофоров. Обнаруженная нами ранее интенсивная флуоресценция для ряда 4,5-(диарилэтинил)триазолов, дает основание предполагать, что флуоресцентными свойствами могут обладать и другие гетероциклы, сопряженные с тройными связями, а также содержащие сопряженные дацетиленовые фрагменты. Для усиления флуоресцентных свойств гетероциклических ацетиленовых производных или выявления флуорогенных свойств будет использована трансформация с помощью медь-катализируемой клик-реакции (CuAAC) с органическими азидами в сопряженные с гетероциклами производные 1,2,3-триазола. Эта область химии триазолов активно развивается в настоящее время и является чрезвычайно востребованной для создания новых флуоресцентных меток, методов биоконъюгирования, новых синтетических методологий и новых соединений с многообещающими биологическими свойствами. В ряду иодэтинилзамещенных гетероциклов с этой целью будет дополнительно проведены реакции Pd-катализируемого цианирования и изучено влияние введённой цианогруппы на оптические свойства гетероциклических производных. Для получения исходных функционализированных ацетиленов и диацетиленов, а также для постсинтетической функционализации библиотек ацетиленовых и диацетиленовых гетероциклов с использованием Pd-катализируемого сочетания (Соногаширы-Хагихары, Сузуки-Мияура или Бухвальда-Хартвига), а также Cu-катализиуемого [3+2]-циклоприсоединения планируется создание оптимизированных каталитические системы. Направленная структурная оптимизация будет осуществляться через рациональный дизайн лигандов вместе с изучением природы катализа (гомогенный, гетерогенный, смешанный) в каждой конкретной системе. При разработке эффективных каталитических систем будет применен подход, основанный на стабилизации каталитически активного металлоцентра с помощью аминокарбеновых или гибридных лигандов. В зависимости от целевой структуры металлокомплекса, синтез соответствующих лигандов будет осуществлен (а) in situ через металлопромотируемое присоединение N-нуклеофилов к изоцианатным лигандам исходного палладиевого комплекса, (б) в случае комплексов меди через предварительный синтез соответствующих имидазолиевых или амидиниевых солей, содержащих объемные алифатические заместители и/или ароматические заместители, функционализированные в орто- и пара-положениях. Сравнительное исследование синтезированных каталитических систем, позволит подобрать оптимальное лигандное окружение обладающее высокой аффинностью к палладию(II) (для кросс-сочетания) и меди(I) (для 1,3-диполярного циклоприсоединения), в то же время достаточной гибкостью, чтобы подстраиваться под стерические и электронные требования каждой стадии каталитического цикла. Исследования в области ендииновых систем и поиска среди них противоопухолевых средств востребованы, актуальны, а результаты этих исследований публикуются ежегодно в высокорейтинговых журналах, несмотря на то, что первый представитель ендииновых антибиотиков был получен около 30 лет назад. Кроме того, ввиду мощного развития металлокомпклексного катализа за последние 10 лет, ендииновые системы используются как важные строительные блоки в синтезе полициклических структур, а также как исходные соединения для полиариленовых полимеров. Поэтому синтетические методы, отработанные в ходе работы над проектом, а также промежуточные ендииновые структуры на пути к целевым молекулам представляют как теоретический, так и практический интерес для специалистов в области органической и металлоорганической химии. Таким образом, наряду с основным результатом проекта – создания принципов предварительной оценки и отбора, разработки методов синтеза для получения библиотек новых перспективных соединений с противоопухолевыми свойствами на базе гетероциклических ендиинов, работа над проектом позволит получить новые знания и расширить фундаментальные представления о ряде проблем в области органической химии и медицинской химии. Так, будут разработаны новые методики в области химии гетероциклов, новые методы получения напряженных циклов среднего размера, к которым относятся все 10-членные ендииновые системы. Будут разработаны новые каталитические системы и продемонстрированы новые возможности клик-химии для модификации достаточно лабильных ендииновых молекул. Будут изучены флуоресцентные свойства ацетиленовых и диацетиленовых гетероциклов и их триазольных производных, что позволит расширить базу соединений для применения в оптическом биоимиджинге. Результаты компьютерного моделирования взаимодействий ендииновых производных с ДНК позволит существенно расширить арсенал методик для проведения как докинговых исследования с молекулами ДНК, которые используются существенно реже, по сравнению с докингом в белковые мишени, так и методов молекулярной динамики.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
По направлению дизайна и синтеза гетероциклических аналогов природных ендииновых антибиотиков на основании результатов биологических исследований полученных модельных бензотиофенсопряженных 10-членных О-,N-,C-ендиинов установлено, что наибольшей антипролиферативной активностью в ряду обладает азаендиин, что коррелирует с данными расчетов с применением молекулярного докинга, выявившими для этой структуры наибольшее сродство с малой бороздкой ДНК. Наименее активным в ряду оказался С-ендиин, который по данным докинга является лучшим интеркалятором. Для дальнейшего направленного дизайна гетероциклических аналогов природных ендиинов проведены расчеты методом молекулярного докинга для определения влияния как природы аннелированного гетероцикла так и природы ендиинового кора на характер связывания с ДНК. В первой серии расчеты выполнены для двенадцати оксаендиинов, аннелированных с пяти- и шестичленными S-, O, N-гетероциклами, как с незамещенными, так и имеющими различные заместители в аннелированном гетерцикле. Полученные расчетные данные позволяют сделать вывод, что на характер связывания большее влияние оказывает не природа гетероцикла, а общая геометрия молекулы: незамещенный по гетероциклическому фрагменту ендиин лучше укладывается и связывается с малой бороздкой, тогда как наличие заместителей в гетероцикле цикле меняет характер связывания в сторону интеркаляции. Данные докинга для десяти карбо-, тиа- и азаендиинов, сопряженных с бензотиофеном, позволяют заключить, что именно аза- ендиины имеют большую способность связываться с малой бороздкой, а не интеркалировать, а введение заместителя к атому азота, имеющего структурное сходство с лигандами малой бороздки, существенно повышает энергетическую выгодность укладки в малую бороздку ДНК. Проведенные исследования позволили выбрать для дальнейшей модификации азаендиин, сопряженный с незамещенным в ядре бензотиофеном, в качестве удобной и эффективной базовой структуры. Наряду с циклическими аналогами природных ендиинов скрининг ДНК-повреждающего и цитотоксического действия был проведен для обширной серии ациклических ендиинов, сопряжённых с различными гетероциклическими ядрами (бензотиофеном, индолом, триазолом) и с различной природой заместителей на концах ендииновой системы. В результате оценки цитотоксического действия синтезированных ендиинов триазольного ряда, а также их предшественников — 5-иод-4-этинил1,2,3- триазолов, на 5 линиях раковых клеток (A549, T98G, MDA-MB-231, Caki-2, MC F7) были выявлены три соединения- хита, что показывает перспективность развития этого направления. По направлению поиска и создания новых реагентов для биоимиджинга разработан новый тип флуорогенного и флуорохромного зонда, основанный на восстановлении слабо флуоресцирующего 4-азидо-6-(4-цианофенил)циннолина до соответствующего флуоресцирующего циннолин-4-амина. Мы обнаружили, что на флуоресценцию 6-(4-цианофенил)циннолин-4-амина сильно влияет природа растворителя. Флуорогенный эффект для амина обнаружен в полярных растворителях с наиболее сильным увеличением флуоресценции в воде. Чувствительные к окружающей среде флуорогенные свойства циннолин-4-амина в воде были объяснены комбинацией двух типов флуоресцентных механизмов: эмиссии, вызванной агрегацией (AIE) и межмолекулярного переноса протонов в возбужденном состоянии (ESPT). Применение пары азид-амин в качестве флуорогенного зонда было протестировано in vivo с использованием раковой клеточной линии HepG2 с помощью флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и ВЭЖХ-анализа клеточных лизатов. Полученные результаты подтверждают возможность превращения азида в амин в клетках и потенциальную применимость обнаруженного флуорогенного и флуорохромного зонда для различных аналитических и биологических применений в водной среде. Результаты исследования опубликованы в Molecules, 2021, 26(24), 7460. Для расширения возможностей молекулярного дизайна и настройки фотофизических свойств циннолин-4-аминов показана возможность функционализации по 6-му положению циннолинового ядра с помощью реакции Сузуки-Мияуры 6-бромциннолин-4-амина в качестве базовой структуры, что дает дивергентный подход к получению подобных структур. Для создания принципиально новых эффективных SPAAC реагентов для биоконъюгации: активных, стабильных и легкодоступных при получении, нами были предложены неизвестные ранее гетероциклононины, имеющие в своем составе гетероатом (азот, кислород или серу) и конденсированные с гетероциклами. Как часть масштабной задачи в рамках проекта осуществлен синтез нового SPAAC реагента для биоимиджинга - азациклононина, сопряженного с изокумарином, модифицированного через атом азота циклоалкинового цикла флуоресцентным красителем BDP-FL (IC9N-BDP-FL). С использованием клеток HEK293, содержащих метаболически меченые азидо-гликаны или азидо-ДНК показано, что флуоресцентное мечение как гликанов, так и ДНК было специфическим. С помощью МТТ-анализа также было продемонстрировано, что IC9N-BDP-FL нетоксичен для клеток, культивируемых до 12 часов, что достаточно для завершения реакции SPAAC в живых клетках. Таким образом созданный реагент имеет хороший потенциал для визуализации пролиферирующих клеток и дальнейшего количественного определения флуоресцентно меченых клеток с использованием анализа изображений и проточной цитометрии. Результаты масштабной работы были опубликованы в JACS, 2021 143 (40), 16519. В рамках настоящего проекта также решалась задача, связанная с разработкой нового метода получения ендииновых систем, конденсированных с гетероциклами. Была изучена возможность использования подхода, основанного на иод-промотируемых циклизациях иодэтиниларенов с образованием 2,3-диодгетероциклов и последующем постадийном региоселективном замещении атомов иода на этинильные фрагменты при помощи реакции Соногаширы. Эффективность нового пути синтеза ендииновых систем была продемонстрирована на примере синтеза 2,3-дииодбензотиофена, для которого были подобраны условия региоселективного замещения атома иода в положении С2 в условиях реакции Соногаширы.

 

Публикации

1. Данилкина Н.А., Андриевская Е.В., Васильева А.А., Ляпунова А.Г., Румянцев А.М., Кузьмин А.А., Бессонова Е.А., Балова И.А. 4-Azidocinnoline—Cinnoline-4-amine Pair as a New Fluorogenic and Fluorochromic Environment-Sensitive Probe Molecules, 26, 24, 7460 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/molecules26247460

2. Данилкина Н.А., Говди А.И., Хлебников А.Ф., Тихомиров А.О., Шаройко В.В., Штыров А.А., Рязанцев М.Н., Брезе С., Балова И.А. Heterocycloalkynes Fused to a Heterocyclic Core: Searching for an Island with Optimal Stability-Reactivity Balance Journal of the American Chemical Society, 143, 40, 16519−16537 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1021/jacs.1c06041

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Для получения коньюгатов гетероендиинов с опухоль-ориентированными лигандами, были отработаны методы синтеза О-,N-ендиинов, функционализированных по 10-членному циклу. Все гетероциклические ендиины проявляли умеренную цитотоксичность в отношении клеток карциномы легкого NCI-H460 при минимальном влиянии на клетки легкого WI-26 VA4 и поэтому являются перспективными соединениями для поиска новых противоопухолевых агентов, которые могут быть преобразованы в конъюгаты. Установлено, что азаендиин с аренсульфонамидным фрагментом является оптимальным для этих целей при введении «кликабельных» функциональных групп: терминальной тройной связи, малеимидного фрагмента или изотиоцианатной функции. Последняя наиболее удобна для синтеза конъюгатов. Также разработан оригинальный метод синтеза 3-йод-2-этинилбензофуранов, на основе которых с помощью циклизации Николаса получен новый тип конденсированного с бензофураном 10-членного гетероендиина и ациклические ендиины для дальнейшего изучения биологических свойств. Для серии ациклических ендиинов, конденсированных с бензотиофеном и индолом выявлена селективность цитотоксического действия в отношении опухолевых клеток по сравнению с нормальными фибробластами легкого. Индольное производное с наибольшей селективностью вызывает дозозависимую гибель клеток в фазе G2/M, что характерно для противоопухолевых препаратов, влияющих на динамику тубулина. Среди несимметрично замещённых ациклических ендиинов с пропаргиламинными заместителями выявлено отсутствие эффекта на пролиферацию клеток карциномы NCI-H460 и фибробластов WI-26VA4 легкого для ендиинов, сопряженных с 1,2,3-1Н-триазолом и умеренная цитотоксичность для бензотиофеновых аналогов. В поисках новых эффективных флуорогенных пар с помощью циклизации Рихтера-типа получен ряд флуоресцентных 6-арилциннолин-4-аминов. Среди синтезированных циннолинаминов наиболее интересными флуоресцентными свойствами обладает соединение с фенильным заместителем в 6-м положении, интенсивность флуоресценции которого возрастает на 3 порядка при переходе от ТГФ к водным растворам, что делает его перспективным для разработки оптических сенсоров на сульфид-анионы и тиолы.

 

Публикации

1. Говди А.И., Токарева П.В., Румянцев А.М., Панов М.С., Штельмахер Дж., Алексиев У., Данилкина Н.А., Балова И.А. 4,5-Bis(arylethynyl)-1,2,3-triazoles—A New Class of Fluorescent Labels: Synthesis and Applications Molecules, 27, 10, 3191 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/molecules27103191

2. Данилкина Н.А., Хмелевская Е.А., Ляпунова А.Г., Дьяченко А.С., Бунев А.С., Гасанов Р.Е., Гуреев М.А., Балова И.А. Functionalized 10-Membered Aza- and Oxaenediynes through the Nicholas Reaction Molecules, 27, 18, 6071 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/molecules27186071

3. - Ученые СПбГУ синтезировали новые реагенты, которые позволяют наблюдать за протекающими в организме процессами в режиме реального времени Сайт Министерства Науки и Высшего образованич, - (год публикации - )

4. - Получены реагенты для наблюдения за процессами в организме в реальном времени ТАСС НАУКА, - (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Завершено исследование взаимодействия ряда 10-членных гетероциклических ендиинов с ДНК методами молекулярного докинга и метадинамики, в ходе которого выявлено, что карбо- и гетероциклические ендииновые системы имеют диспропорциональный характер связывания ДНК. Природа аннелированного гетероцикла принципиально не влияет на путь связывания, но введение в него заместителей меняет характер связывания в сторону интеркаляции. Наибольшая разница в свободных энергиях связывания (интеркаляция – малая бороздка) характерна для азаендиинов, тогда как карбоциклические ендиины, содержащие заместители в ендииновом фрагменте, сохраняют и способность к интеркаляции, и аффинность к малой бороздке. Азаендиины с такими заместителями, как бензильная, бензоильная и тиокарбамоильная группы эффективно укладываются в малую бороздку ДНК. Введение заместителей, сходных по структуре с лигандами к малой бороздке полностью переводит ендиины в режим связывания малой бороздке ДНК. Расчет свободных энергий активации конъюгатов азаендиинов с лигандами к малой бороздке ДНК, связанных через сульфонамидный фрагмент, показывает, что эти соединения должны обладать оптимальным балансом стабильность / реакционная способность в циклизации Бергмана, что делает их перспективными объектами для синтеза и экспериментального изучения противоопухолевых свойств. Основная часть в области синтеза и биологических исследований гетероциклических ендиинов на заключительном этапе проекта была посвящена разработке методов конъюгации и синтезу конъюгатов азаендиинов, выбранных в качестве лидерной структуры, конденсированных с бензотиофеном, с различными лигандами и изучение их цитотоксичности. Для синтеза конъюгатов были выбраны функциональные группы для «клик» биоконъюгирования: изотиоцианат, концевая тройная связь и малеимидный фрагмент. По результатам этих исследований первые два были признаны наиболее удобными с синтетической точки зрения, позволяющими проводить реакции в мягких условиях с сохранением ендиинового ядра. Синтезированная серия из 14 конъюгатов гетероциклических азаендиинов, сопряженных с бензотиофеном с лигандами: повышающими растворимость в воде (ПЭГ-лиганды); позволяющими проводить последующую биоконьюгацию (циклоалкин BCN); флуоресцентными, позволяющими изучать проникновение и локализацию в клетке (красителя ряда BODIPY и группы Hoechst, являющимся также лигандом к малой бороздке ДНК); производные глюкозы для повышения связывания с опухолевой клеткой за счет эффекта Варбурга. Проведенные исследования цитотоксичности полученных коньюгатов выявили два соединенния, проявляющие цитотоксичность на уровне цисплатина (триазол-глюконовый конъюгат) или даже превосходящие цисплатин по цитотоксичности и проявляющий селективность в отношении опухолевых клеток (конъюгат с MGB лигандом), что открывает пути для дальнейшей разработки противоопухолевых препаратов на базе гетероциклических аналогов природных ендииновых антибиотиков. Были получены две серии коньюгатов с ациклическими ендиинами, конденсированными с бензотиофеном и индолом и исследована их цитотоксичность в отношении опухолевых и здоровых клеток. Установлено, что ациклические ендиины ряда бензотиофена и индола, модифицированные через реакцию NCS/амин, также оказывают выраженное цитотоксическое действие. Природа заместителя при тиомочевинном фрагменте, наличие ендииновой системы, а также природа аннелированного гетероцикла в совокупности являются важными факторами для моделирования цитотоксических свойств этих систем. Среди производных бензотиофена и индола выявлены соединения-лидеры, проявляющие цитотоксичность на уровне цисплатина. Их аналог, содержащий только одну тройную связь вместо ендиинового фрагмента, обладал наименьшей цитотоксичностью из всей серии. Таким образом, установлено, что наличие ендииновой системы является важным структурным элементом, ответственным за цитотоксичность ациклических ендиинов, однако мишень их действия остается неизвестной, что и определяет дальнейший возможный путь развития данной темы. Отдельный блок работ был посвящен синтезу 10-членных азаендииновых систем, конденсированных с индолом, с использованием реакции Николаса для замыкания цикла. К сожалению, индольный гетероцикл является ограничением в использовании этого удобного метода циклизации. В случае сопряжения ациклической ендииновой системы с индолом направление реакции меняется, и вместо ожидаемых 10-членных циклов происходит циклизация с участием сульфонамидного атома азота BF3-активироанной тройной связи при атоме С3 с образованием пирролинов, тогда как метоксиметильная группа при тройной связи в виде Со-комплекса остается незатронутой. В результате исследования реакции Соногашира вицинальных дигалогенпроизводных пиразола и тиопиримидина с алкинами показано, что для 5-иод-6-хлорпиридина при использовании ациклических диаминокарбеновых комплексов палладия можно селективно постадийно замещать атом иода на алкин, с последующим замещением атома хлора, что может быть использовано для получения несимметричных ациклических ендииновых систем. Напротив, для 4,5-дииодпиразолов провести монозамещение иода в кросс-сочетании Соногашира не удается, поэтому данный субстрат может быть использован только для получения симметричных ендиинов. Исследована иод-промотируемая циклизация в ряду фениловых эфиров диацетиленкарбоновых кислот как потенциальная ключевая стадия синтеза ендииновых систем, конденсированных с кумарином. Обнаружено, что в отличие от эфиров моноацетиленовых кислот в случае диацетиленовых производных вместо замыкания цикла реакция приводит к образованию продуктов присоединения иода к тройным связям. По ендииновой тематике в третий год проекта было опубликовано две статьи в периодических изданиях, суммирующий результаты предыдущих этапов исследования Mendeleev Commun., 2023, 33, 328; Russ. J. General Chem., 2024 (принята к печати). Полученные за третий год результаты по химии и свойствам конъюгатов ендиинов были представлены на ряде всероссийских конференций. Были проведены комплексные исследования по поиску новых циклоалкиновых молекул с флуоресцентными свойствами. При помощи рационального дизайна были успешно разработаны новые флуоресцентные циклоалкины ‒ оксациклононины, конденсированные с изокумарином IC9O-EWG (EWG = CN, COOMe), которые легко реагируют с азидами с образованием триазолов также способных к флуоресценции. Получить флуоресцентные пары циклоалкин-триазол позволило теоретическое изучение механизма деактивации возбужденного состояния нефлуоресцентного изокумаринового циклоалкина при помощи мультиконфигурационных ab initio и DFT расчетных методов, а также прогнозирование способов устранения нежелательной деактивации. Принципиальным моментом рационального дизайна для появления флуоресцентных свойств, предсказанным теоретически и подтвержденным на практике, оказалось введение пи-акцепторной группы в положении С6 изокумаринового цикла. По результатам этих исследования опубликована статья Chemistry ‒ A European Journal, 2023, e202300540, которая попала в Hot Topic: Click Chemistry издательства Wiley. КНВШ Санкт-Петербурга (http://knvsh.gov.spb.ru/news/view/6164/), Energyland.info (http://energyland.info/news-show-tek-electro-249043), Новости нанотехнологий (https://www.nanonewsnet.ru/news/2023/khimiki-nauchili-poleznye-molekuly-svetitsya-innovatsionnym-sposobom), Научная Россия (https://scientificrussia.ru/articles/himiki-naucili-poleznye-molekuly-svetitsa-innovacionnym-sposobom), Science News (https://ab-news.ru/himiki-nauchili-molekuly-svetitsya-innovaczionnym-sposobom/), Красная весна (https://rossaprimavera.ru/news/0237bef4), Московский Комсомолец - Санкт-Петербург (https://spb.mk.ru/science/2023/10/13/khimiki-spbgu-nauchili-svetitsya-poleznye-molekuly-innovacionnym-sposobom.html) и др.

 

Публикации

1. А.А. Видякина, А.А. Штыров, М.Н. Рязанцев, А.Ф. Хлебников, И.Е. Колесников, В.В. Шаройко, Д.В. Спиридонова, И.А. Балова, С. Брёзе, Н.А. Данилкина Development of Fluorescent Isocoumarin-Fused Oxacyclononyne – 1,2,3-Triazole Pairs Chemistry—A European Journal, 29, e2023005 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1002/chem.202300540

2. А.И. Говди,С.О. Анисимов, Н.А. Данилкина, А.С. Бунев, И.А. Балова Acyclic enediynes fused to triazole and benzothiophene containing propargylamine moieties Mendeleev Communications, 33, 328 - 330 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1016/j.mencom.2023.04.010

3. М. А. Гуреев, Н. А. Данилкина, А. Ф. Хлебников, И. А. Балова Молекулярный докинг и молекулярная динамика для определения предпочтительного способа связывания 10-членных гетероциклических ендиинов с ДНК Журнал Общей Химии, - (год публикации - 2023)

4. - Химики СПбГУ научили полезные молекулы светиться инновационным способом Комитет по науке и высшей школе Санкт-Петербурга, - (год публикации - )

5. - Химики СПбГУ инновационным способом заставили светиться полезные молекулы Красная весна, - (год публикации - )

6. - Химики СПбГУ научили светиться полезные молекулы инновационным способом Московский Комсомолец - Санкт-Петербург, - (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
Синтезированные конъюгаты ендиинов будут протестированы на различных клеточных линиях, в случае положительного результата планируется патентование и разработка на их основе противораковых препаратов