Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В ходе реализации проекта в 2021 году выполнены следующие работы и достигнуты следующие научные результаты: 1. Решение комплекса синтетических задач, направленных на создание амфифильных фотосенсибилизаторов (ФС), обладающих одновременно выраженный гидрофильностью и высоким сродством к атипичным клеткам, позволило уже в первый год реализации проекта получить ряд новых и ранее известных конъюгатов хлорина е6 и дейтеропорфирина-IX цвиттер-ионного, катионного и неэлектролитного типа с L-аминокислотами, D-моносахаридами и этиленгликолями, а также триалкиламмонийными группами. За отчетный период с применением различных синтетических подходов было получено около 30 макрогетероциклических соединений, потенциальных фотосенсибилизаторов для противоопухолевой и антимикробной ФДТ. Все синтезированные соединения были подвергнуты надежной спектральной идентификации и комплексному исследованию их физико-химических и биологических свойств. 2. При выборе синтетических подходов к конъюгированию МГЦ с биологически активными соединениями (L-аминокислоты) подтверждена эффективность метода активированных эфиров с применением N-гидроксисукцинимида для активации карбоксильной группы ФС. Этот подход позволяет ориентировать процесс конъюгации в нужном направлении, получая продукты состава 1-1, а также избежать реакции самоконденсации аминокислот, при этом минуя стадии введения и снятия защиты аминокислотных групп. 3. Анализ электронных спектров поглощения (ЭСП) и флуоресценции (Фл) синтезированных конъюгатов производных хлорина е6 с пентаэтиленгликолем, D-галактозой и L-аргинином, а также катионного хлорина, содержащего триалкиламмонийную группу, показал, что эти ФС интенсивно поглощают излучение в красной области (lgε ≥ 4.5), обладают выраженной флуоресценцией и, несмотря на то, что зачастую склонны к самоассоциации в водных растворах уже при концентрации 10-5 моль/л, могут быть легко переведены обратно в молекулярную форму при действии мицеллярных (Твин 80) или полимерных (ПВП, Р123) ПАВ. 4. На примере монокатионного хлорина показано, что в силу умеренной фотоустойчивости этих ФС при работе с хлориновыми пигментами следует учитывать возможное частичное фотоокисление препарата в ходе процедуры ФДТ. Проведение процесса в присутствии ПАВ (1% Твин 80) снижает константу скорости фотодеструкции и увеличивает значение времени полупревращения приблизительно на 20% из-за экранирующего эффекта мицелл ПАВ. 5. Впервые при определении квантовых выходов генерации синглетного кислорода 1О2 химическим методом в псевдолипидной среде, моделируемой 1-октанолом, установлено, что ди- и трикатионные хлорины, винильная группа которых содержит дикатионный фрагмент, имеют значительно более высокие значения этих величин (~ 0.8), чем это следует из результатов прямых измерений. Причина этого явления состоит в том, что наряду с окислительным действием синглетного кислорода, ди- и три катионные хлориновые ФС (иодиды) с близким расположением катионных фрагментов и, соответственно, с близкой пространственной локализацией атомов йода проявляют дополнительную токсичность в отношении патогенной микрофлоры и/или опухолевых клеток путем генерации молекулярного йода I2/I3– и пероксидных радикалов ROO•, что может иметь определенное клиническое значение. 6. С целью моделирования сродства ФС к липидному окружению и транспорта через липидные мембраны нами в системе 1-октанол – фосфатно-солевой буфер в физиологическом интервале температур было проведено исследование распределения ряда хлориновых ФС, как впервые полученных при реализации проекта, так и синтезированных ранее, в том числе используемых в клинической практике ФС «Фоторан» и «Фотодитазин». Показано, что наиболее гидрофильными объектами являются трехзарядные хлорины – их концентрация в псевдо-липидной среде либо одинакова с водной (трикатионный хлорин), либо превышает ее в среднем в два раза (трианионные «Фоторан» или «Фотодитазин»). Коэффициент распределения Р и гидрофобность молекулы ФС в целом значительно выше в случае монокатионного хлорина и далее возрастает при переходе к цвиттер-ионным и неэлектролитным молекулам, в частности, к конъюгатам хлорина е6 с фрагментами L-аргинина, D-галактозы и, в особенности, к метилфеофорбиду a. 7. Установлена зависимость между коэффициентом распределения ФС и типом белковой фракции крови, осуществляющей его транспорт в организме. Так, гидрофобные ФС, введенные в системный кровоток, связываются преимущественно с липопротеинами (ЛП) низкой плотности, что способствует их накоплению в опухолях, имеющих соответствующие рецепторы для ЛП. Гидрофильные ФС, в частности, тринатриевая соль хлорина е6, напротив, почти полностью связываются сывороточным альбумином. Таким образом, если для растворимого в воде ФС величины коэффициентов межфазного распределения достаточно малы, он будет транспортироваться тяжелыми белками (альбумином). Если же сродство к липидной фазе достаточно велико – Р ~ 10 и выше, то связывание будет протекать преимущественно липопротеинами низкой и/или высокой плотности. 8. Результаты расчета термодинамических параметров переноса ФС из водной фазы в 1-октанол в узком температурном интервале показывают, что все ФС, за исключением трикатионного хлорина, самопроизвольно переходят в псевдо-липидную фазу, при этом для гидрофобного метилфеофорбида а перенос контролируется благоприятным изменением энтальпии, тогда как для амфифильных ФС – исключительно энтропийным фактором. С увеличением заряда ФС тенденция перехода в водную фазу заметно усиливается, при этом для трехзарядных ФС, как катионного, так и анионного типа, изменение свободной энергии близко к нулю. Увеличение гидрофильности молекулы ФС приводит к увеличению энтальпийного вклада процесса переноса. 9. Для преодоления одной из существенных проблем клинической ФДТ макрогетероциклических ФС, какой является их агрегация в водных растворах при терапевтических концентрациях, широко используется взаимодействие ФС со средствами их пассивной доставки. В результате проведенного спектрофотометрического исследования обнаружено образование в водных растворах достаточно прочных молекулярных комплексов между ФС порфиринового и хлоринового ряда и неионогенными мицеллярными ПАВ (Твин 80), а также биосовместимыми полимерами и блок-сополимерами (ПВП и Р123). Показано, что линеаризация кривых титрования фотосенсибилизаторов Твин 80 в рамках предложенной ранее математической модели чаще всего приводит к возникновению зависимостей с двумя линейными участками, каждый из которых характеризуется своей константой и стехиометрией взаимодействия, что может быть связано как с изменением размера мицелл в присутствии электролитов, в частности, катионных ФС, так и с различным характером взаимодействия (распределения) ФС в условиях дефицита и избытка мицелл ПАВ. 10. Методом динамического тушения флуоресценции обнаружено, что исследованные дикатионные ФС локализуются в поверхностном слое мицеллы Твин 80, о чем свидетельствуют высокие значения констант Штерна-Вольмера в водном растворе йодистого калия. Показано, что величины КSV закономерно снижаются при переходе к монокатионному хлорину и далее – к еще менее полярным ФС – конъюгатам хлорина е6 с гликолями, L-аминокислотами и D-моносахаридами, что свидетельствует об увеличении глубины локализации пигмента в мицелле Твин 80 по мере снижения их гидрофильности. 11. Проведена серия микробиологических исследований, направленных на изучение темновой и световой токсичности растворов заряженных ФС – трианионного хлорина е6, монокатионного хлорина и дикатионного порфирина в отношении планктонных форм внутрибольничных антибиотикорезистентных штаммов ряда Грам (-) патогенных бактерий. Установлено, что тринатриевая соль хлорина е6, являющаяся действующим агентом используемых в клинической практике анионных ФС, ожидаемо очень слабо фотоинактивирует синегнойную палочку даже при высокой дозе облучения. Монокатионный хлорин оказался значительно более эффективным ФС при АФДТ грамотрицательных патогенов не только по сравнению с анионным хлорином е6, но и с дикатионным порфирином, в большей степени подверженным агрегации в водных растворах. Введение малотоксичных добавок (0.25-0.5% Твин 80, 0.1% Трилон Б, 0.02% ε-поли-L-лизин, 0.001% H2O2) способствовало снижению дозы и времени облучения, необходимых для полной инактивации патогенной бактериальной флоры. 12. Осуществлен комплекс исследований, направленных на исследование цито- и фотоцитотоксичности производных метилфеофорбида а и хлорина е6 с фрагментами ди-, три- и пентаэтиленгликолей на периферии макроцикла, а также хлоринов с различным числом и расположением катионных групп в отношении культуры опухолевых клеток HeLa. Несмотря на различную гидрофобность, исследованные соединения, содержащие гликольные фрагменты различной длины и вовсе их не имеющие, по всей видимости, обладают сопоставимой мембранотропностью, демонстрируя сопоставимое фотоиндуцированное цитотоксическое воздействие. Фототоксичность, катионных хлоринов, напротив, зависит от положения и числа заряженных групп на периферии макроцикла. Установлено, что максимальная фототоксичность наблюдается для хлоринов, катионные группы которых локализованы в одной части молекулы, то есть по аналогии с молекулами ПАВ проявляют выраженную амфифильность. Для ФС, обнаруживающих выраженную фототоксичность, концентрация, при которой она проявляется, как минимум, на полтора-два порядка ниже концентрации, при которой атипичные клетки начинают массово гибнуть в темноте, что позволяет надеяться на их дальнейшее применение в клинической ФДТ. 13. В ходе реализации настоящего проекта была определена величина полулетальной дозы LD50 монокатионного хлорина, продемонстрировавшего при исследовании in vitro весьма обнадеживающие показатели в качестве фотосенсибилизатора как для антимикробной, так и для противоопухолевой фотодинамической терапии. Величина LD50 хлорина при внутрибрюшинном введении препарата лабораторным животным оказалась приблизительно равной 100 мг/кг, что существенно выше значения, полученного нами ранее для хлорина, содержащего три катионные триалкиламмонийные группы. Этот результат подтверждает сделанные ранее выводы о том, что с увеличением числа катионных групп темновая токсичность производных хлорина е6 возрастает. Полученная величина LD50 в 50-100 раз выше дозы препарата, применяемой в клинической фотодинамической терапии.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. С целью обеспечения более выраженной амфифильности фотосенсибилизаторов, повышения их растворимости в воде и большей селективности накопления в онкологических и патогенных клетках, а также проявления остаточной цитотоксичности после выгорания ФС в процессе ФДТ нами разработаны методики получения катионных конъюгатов хлорина е6 с N-метилглюкозамином, ε-поли-L-лизином и противоопухолевым препаратом «Проспидином». 2. Анализ спектров поглощения и флуоресценции конъюгатов производных хлорина е6 с неионогенными, заряженными или цвиттер-ионными группами показал, что эти ФС интенсивно поглощают излучение в красной области, демонстрируя характерный ЭСП, эффективно флуоресцируют и несмотря на то, что, в отличие от полярных органических растворителей, агрегируют в водных растворах, могут солюбилизироваться, вступая в молекулярное комплексообразование с мицеллярными (Твин 80) и полимерными (ПВП) носителями, которые, в свою очередь, могут быть использованы в качестве средств их пассивной доставки. 3. Химическим методом определены величины квантовых выходов синглетного кислорода ФС хлоринового ряда [Comptes Rendus Chimie, 2022, 25, 97-102; DOI: 10.5802/crchim.158], находящиеся в согласии со значениями, полученными путем прямых люминесцентных измерений. Показано, что обесцвечивание ловушки на основе витамина А требует на порядок более высоких доз световой энергии по сравнению с ДФБФ. 4. В водной фазе как трианионный хлорин е6 – активное вещество препаратов «Фоторан», «Фотодитазин» и др., так и синтезированный нами монокатионный хлорин (МХл) уже при сообщении им световой дозы 60 Дж см-2 подвергаются фотообесцвечиванию на 90 %, в то время как в 1-октаноле фотостабильность ФС на порядок выше. Учитывая преимущественную локализацию МХл в липидной фазе (коэффициент распределения в системе 1-октанол/буфер в 4 раза выше, чем у хлорина е6), можно полагать, что с точки зрения фотостабильности исследуемый ФС является более надежным пигментом по сравнению с хлорином е6. 5. С целью дальнейшего преодоления проблемы агрегации в водных растворах ФС при терапевтических концентрациях, которая оказывает существенное негативное влияние на эффективность генерации синглетного кислорода и фармакодинамику препаратов, нами продолжено изучение связывания ФС с неионогенным ПАВ Твин 80 [Russ. J. Phys. Chem. 2022, 96(4), 793-799; DOI: 10.31857/S0044453722040197], а также с биосовместимым полимером поливинилпирролидоном (ПВП). Установлено образование в водных растворах как заряженных, так и незаряженных ФС достаточно прочных молекулярных комплексов хлориновых ФС с неионогенным ПАВ Твин 80. Линеаризация кривой титрования приводит к возникновению зависимости с двумя линейными участками со своей константой и стехиометрией связывания, что, определяется изменением размера и формы мицелл Твин 80 за счет их взаимодействия друг с другом в присутствии макроциклических ФС. Исследуемые ФС локализуются в поверхностном слое мицеллы Твин 80, о чем свидетельствуют достаточно высокие значения констант динамического тушения их флуоресценции в водном растворе йодистого калия при отношении ФС/ПАВ=1/60. Увеличение концентрации ПАВ приводит к снижению констант, указывая на экранирование ФС от действия тушителя при избытке мицелл в растворе. При одинаковых соотношениях ФС/ПАВ величины KSV всегда больше в случае хорошо гидратированных катионных хлориновых ФС, чем для незаряженных или анионных макроциклов, по-видимому, вследствие высокой аффинности катионных групп к воде. ПВП, как и Твин 80, также демонстрирует выраженную аффинность к молекулам хлориновых ФС независимо от знака их заряда и более удобен в использовании, поскольку, в отличие от Твин 80, является твердым веществом. 6. Характер конкурентного перераспределения ФС между транспортными белками крови при его внутривенном введении оказывает значимое влияние на фармакодинамику препарата. С применением метода гель-фильтрации нами установлено, что, несмотря на более низкое содержание липопротеинов в плазме по сравнению с альбуминами, они эффективно связывают более гидрофобные хлорины, например, конъюгаты с D-галактозой или L-аргинином, тогда как хорошо растворимый в воде анионный хлорин е6 почти полностью переносятся альбуминами. Наличие одной катионной группы, обеспечивающей растворимость МХл в воде, не сказывается на его высокой способности связываться с липопротеинами, в то время как три катионные группы в молекуле хлорина приводят к тому, что данный ФС не связывается ни с одним из белков-переносчиков. Связывание МХл преимущественно с ЛПНП крови играет важную роль в таргетной доставке препарата в опухолевую ткань и может иметь значение для повышения эффективности противоопухолевой ФДТ. 7. Продолжены исследования антимикробной активности хлориновых ФС на примере МХл и анионного ФС «Фоторан е6» (хлорин е6 + ПВП) в отношении внутрибольничных антибиотикорезистентных штаммов Грам (-) бактерий, принадлежащих к группе ESKAPE. Результаты показывают, что МХл обладает выраженной фотодинамической активностью в отношении планктонных форм нозокомиальных бактерий, которая во всех случаях значительно выше, чем у хлорина е6. Оптимальными условиями для эффективной фотоинактивации Грам (-) патогенов являются концентрация ФС – 50 µмоль/кг и доза излучения – 80 Дж/см2 (время облучения 15 мин.) Эти же параметры могут быть использованы для фотоинактивации смешанной микрофлоры, в том числе, и находящейся в состоянии биопленки. Добавка нетоксичных в темноте для грамотрицательных бактерий небольших количеств е-поли-L-лизина или Na2H2Edta (~0.05-0.1 мас. %), дестабилизирующих внешнюю липополисахаридную мембрану, значительно усиливает антимикробное действие ФС и может быть рекомендовано для использования в антимикробной ФДТ. 8. Проведен большой комплекс биологических исследований, направленных на изучение темновой и фотоиндуцированной токсичности производных хлорина е6 в отношении опухолевых клеток лейкемической линии К562. Исследованные ФС накапливаются в опухолевых клетках с разной степенью эффективности, которая возрастает с ростом гидрофобности ФС. Трианионный хлорин е6 наиболее слабо накапливается в опухоли по сравнению с изученными неионогенным и цвиттер-ионным конъюгатами, а также МХл. Эти результаты качественно коррелируют с полученными ранее данными по межфазному распределению [Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5294. DOI: 10.3390/ijms23105294], а также результатами гель-филитрации, указывая на то, что аффинность ФС к клеточным мембранам является доминирующим фактором их накопления в опухолевых клетках. Внутри клетки изученные ФС накапливаются, главным образом, в эндоплазматическом ретикуломе, а также в аппарате Гольджи, при этом их внутриядерной локализации не обнаружено. Анализ фотодинамической активности ФС в отношении клеток К562 показывает, что степень фотоинактивации фактически линейно коррелирует как с дозой светового излучения, так и степенью накопления ФС внутри клетки. Все ФС показывают как крайне низкую темновую, так и острую токсичность (LD 50 ~ 100 мг/кг) [Biomed. Photonics 2022, 11, 23–32; DOI: 10.24931/2413–9432–2022–11-2-23-32], указывая на потенциальную возможность их использования в исследованиях in vivo. Наиболее перспективным, на наш взгляд, является МХл. 9. Проведенные in vivo исследования фотоиндуцированной противоопухолевой активности МХл в отношении перевивной опухоли – саркомы М1 крыс демонстрируют увеличение уровня содержания ФС в опухоли уже через 30 минут после внутривенной инъекции (5 мг/кг) и максимальное накопление через 1 час, которое остается таковым в течение еще 2 часов. При выбранных параметрах фотодинамического воздействия: дозе 5.0 мг/кг, световой дозе D = 150 Дж/см2, плотности мощности излучения Ps = 250 мВт/см2 процент животных с полной регрессией (ПР) опухоли на 21 сутки составил 100 %. При наблюдении до 90 суток полного излечения удалось добиться у 75 % животных, тогда как у 25 % был диагностирован рецидив. Полученные результаты являются многообещающими, особенно принимая во внимание простоту получения МХл, его высокую антимикробную активность и низкую темновую токсичность.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1. С применением реакций нуклеофильного размыкания экзо-цикла, сложноэфирной активации карбоксильных групп, электрофильного замещения в винильной группе, а также реакций N-алкилирования осуществлена наработка катионных и неионогенных тетрапиррольных макрогетероциклов хлоринового и порфиринового типа (21 соединение). 2. Исследовано состояние катионных фотосенсибилизаторов (ФС) в воде, водных растворах электролитов и неионогенных ПАВ. Показано, что изученные водорастворимые производные хлорина е6 в воде и полярных органических средах агрегированы и находятся в виде субнаночастиц, не фиксируемых методом динамического светорассеяния, тогда как в растворах электролитов, а также в неполярных растворителях демонстрируют формирование наноагрегатов J-типа. Присутствие в растворе неионогенного ПАВ Твин 80 приводит к разрушению агрегатов, что подтверждается данными время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии. 3. Изучена генерация синглетного кислорода производными хлорофилла а в воде и водных растворах мицеллярного ПАВ. Установлено, что величины квантовых выходов генерации 1О2 для безметальных хлоринов анионного, неэлектролитного и монокатионного типа, не подверженных внутримолекулярному электронному переносу, находятся в пределах 0.55±0.15, независимо от способа определения величины ΦD. Растворимые в воде ФС способны эффективно генерировать синглетный кислород только при насыщении растворов кислородом воздуха, а добавление пассивных носителей приводит к росту величин ΦD. 4. В ходе изучения взаимодействие порфиринов и хлоринов различного строения с потенциальными средствами пассивной доставки методами ЭСП, Фл и ДРС установлено, что эти ФС образуют с ними в водных растворах достаточно прочные молекулярные комплексы. Линеаризация кривой титрования мицеллярным ПАВ Твин 80 во всех случаях приводит к зависимости с двумя линейными участками, к двум величинам констант и различной стехиометрии взаимодействия. В мицеллах Твин 80 молекулы ФС локализуются вблизи оксиэтиленовых групп, о чем свидетельствуют величины констант тушения их флуоресценции и снижение констант Штерна-Фольмера при мольных отношениях ФС / ПАВ >> 1:60. Среди исследованных ФС наиболее сильному действию тушителя подвержены катионные хлорины, содержащие хорошо гидратированные триметиламмонийные группы. Выявлен смешанный механизм тушения флуоресценции йодидом калия для фотосенсибилизатора, помещенного в мицеллу Твин 80, что свидетельствует о различной локации ФС в ее поверхностных слоях. 5. Методом гель-фильтрационной хроматографии изучено связывание синтезированных в проекте ФС с транспортными белками плазмы крови. Содержание липопротеинов в плазме составляет на порядок меньше, чем альбуминов, однако, они эффективно связывают гидрофобные ФС, содержащие неионогенные или одну катионную группу. Наоборот, хорошо растворимые в воде трианионные ФС почти полностью переносятся альбуминами, а препараты с несколькими катионными группами не связываются ни с одним из белков-переносчиков. Наличие одной катионной группы обеспечивает растворимость изученных хлоринов в воде и сохраняет эффективность связывания ФС (до 50%) с липопротеинами низкой плотности (ЛПНП) – переносчиками холестерина, на которые у опухолевых клеток имеется повышенное количество рецепторов. Поэтому связывание ФС с ЛПНП крови обеспечивает таргетную доставку препарата в опухолевую ткань, повышая эффективность ФДТ. Добавление ПВП или Твин 80 не меняет характера доставки ФС. Связывание монокатионного ФС и его транспорт ЛПНП зависит от положения положительно заряженной группы, которое должно обеспечивать амфифильный характер молекулы хлорина. Например, расположение катионных групп по разные стороны макроцикла с другими полярными группами в моно-, ди- и трикатионном хлоринах, препятствующее амфифильной структуре молекулы ФС, приводит к отсутствию ее связывания с любыми транспортными белками крови. 6. При моделирования фотоиндуцированной антимикробной активности ФС in vitro в отношении ряда антибиотикорезистентных штаммов Грам (-) бактерий, наиболее устойчивыми оказались Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa, требующие для полной инактивации больших концентраций ФС и световых доз. Для всех штаммов фотоинактивация грамотрицательных патогенов с использованием катионных ФС значительно более эффективна, чем в случае анионного хлорина е6 или его неэлектролитных производных, при этом использование потенцирующих агентов – Твин 80 для ингибирования агрегации, Na2H2Edta для дестабилизации внешней мембраны бактерий или иодида калия для образования радикальных форм может существенно повысить эффективность лечения даже анионными ФС. Наиболее эффективным и наименее дорогим препаратом для АФДТ оказался монокатионный хлорин. 7. Моделирование фотоиндуцированной антимикробной активности ФС in vivo было проведено на модели раневой инфекции у лабораторных животных и показано, что проведение одного сеанса ФДТ с монокатионным хлорином позволяет снизить число КОЕ кишечной палочки на 2 порядка, в то время как для синегнойной палочки наблюдается уменьшение на 5 порядков (полное очищение раны). При АФДТ с нанесением патогенов на не поврежденную кожу добровольцев наблюдался аналогичный результат. 8. Осуществлено моделирование фотоиндуцированной противоопухолевой активности ФС на клеточных культурах in vitro для ряда производных хлорина е6 в отношении опухолевых клеток К-562, HeLa, A549 и HT-29. Все исследованные препараты за исключением ди- и трикатионных хлоринов, накапливаются в клетках, проявляют низкую темновую и выраженную фототоксичность в отношении опухолевых клеток различных линий. Величина фотодинамического эффекта существенно зависит от типа клеточной линии, дозы облучения, от структуры молекулы ФС и в целом коррелирует с их аффинностью к клеточным мембранам. Наибольшую фотодинамическую активность при данных условиях обнаруживает хлориновый ФС с пентаэтиленгликольным фрагментом, наименьшую – используемый в клинической практике хлорин е6. 9. Проведено моделирование фотоиндуцированной противоопухолевой активности ФС in vivo на перевивных опухолях лабораторных животных с применением хлоринов, содержащих катионную и неэлектролитную группы. Оба ФС демонстрируют накопление в опухоли в течение 1 часа после введения, причем в случае неэлектролитного ФС достигается максимальный индекс контрастности. Несмотря на это, безусловным лидерным соединением является монокатионный хлорин, позволяющий за один сеанс ФДТ полностью вылечить 75 % лабораторных животных с полной регрессией опухоли на 21 сутки.