Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Митохондрии – это двумембранные органеллы практически всех современных эукариотических клеток. Их основной функцией является обеспечение клетки энергией в форме аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), которая синтезируется на внутренней митохондриальной мембране в результате последовательных реакций окислительного фосфорилирования. Кроме своей энергетической функции, митохондрии также участвует во множестве других процессов – регуляции программируемой клеточной смерти, биосинтезе железо-серных кластеров, метаболизме аминокислот и липидов, а также многих других. Согласно общепринятой теории, митохондрии произошли путем поглощения их предшественника – сходной с современными альфа-протеобактериями прокариотической клетки, клеткой-предшественником современных эукариот. В течение миллиардов лет эволюции митохондрии претерпели множество изменений, связанных с их специализацией к использованию кислорода для получения энергии. Эти изменения привели к тому, что большинство генов генома предшественника митохондрий были утрачены или же перенесены в ядро эукариотической клетки. У современных эукариот подавляющее большинство белков митохондрий кодируется в ядре, синтезируется в цитозоле, а затем транспортируется в митохондрии посредством селективного механизма импорта. Тем не менее, практически все митохондрии современных эукариот сохранили собственный геном, а также аппараты его репликации, репарации, транскрипции и трансляции. Как правило, в митохондриальном геноме закодировано около десяти белков, в большинстве своем являющихся крайне гидрофобными компонентами комплексов окислительного фосфорилирования. Биосинтез этих белков – митохондриальная трансляция, является сложно организованным процессом, который хоть и имеет механистическое сходство с синтезом белка у бактерий, но в ходе эволюции приобрел целый ряд существенных отличий, в первую очередь связанных со строением митохондриальных рибосом и особенностями регуляции. Последнее опосредовано необходимостью строгой координации митохондриальной трансляции с синтезом митохондриальных белков в цитозоле, поскольку митохондриально кодируемые гидрофобные субъединицы комплексов внутренней мембраны, как правило, нуждаются в ко-трансляционном встраивании в собирающиеся комплексы, большинство из компонентов которых синтезируется вне митохондрий. Важно отметить, что любые нарушения в регуляции митохондриальной трансляции у человека приводят к развитию тяжелых неизлечимых заболеваний, в частности – мышечных дистрофий и нейропатий, поэтому понимание механизмов, определяющих эффективность биосинтеза тех или иных митохондриально кодируемых белков может не только помочь в изучении патогенеза указанных заболеваний, но и способствовать разработке персонализированных подходов к лечению данных патологий. Целью нашего проекта является изучение тонких механизмов регуляции трансляции в митохондриях человека. В ходе выполнения работ первого года проекта мы получили линии клеток человека с делециями в генах двух белков, входящих в состав малой субъединицы митохондриальной рибосомы (CHCHD1 и PTCD3), а также охарактеризовали полученные клеточные линии биохимически и молекулярно-биологически. Оказалось, что отсутствие этих белков не приводит к полной остановке биосинтеза белка в митохондриях, но существенно снижает его эффективность. Кроме того, такое снижение эффективности трансляции приводит к драматическим последствиям для функциональности митохондрий – снижению активности отдельных комплексов цепи окислительного фосфорилирования, уменьшению скорости поглощения кислорода, а также изменению состава суперкомплексов – надмолекулярных ассоциатов комплексов внутренней мембраны митохондрий, повышающих эффективность работы электрон-транспортной цепи. Кроме того, в ходе проведения работ по проекту, мы провели исследование протеома клеток человека, в которых был удален ген одного из факторов инициации в митохондриях – mtIF3. Ранее мы показали, что такая делеция не приводит к остановке трансляции в митохондриях, а вызывает снижение эффективности биосинтеза лишь одного из митохондриально кодируемых белков ATP6. Проведенный совместно с нашими коллегами из Сколковского института науки и технологий и НИИ биомедицинской химии им. Ореховича анализ выявил избыточное накопление в модифицированных клетках белка TCTP. Этот полипептид является ортологом белка пекарских дрожжей S. cerevisiae Tma19p. Избыточное накопление этого белка ранее было выявлено нами в клетках дрожжей при делеции того же фактора инициации митохондриальной трансляции. У дрожжей с делецией Tma19p окружает митохондрии и способствует их сохранности в условиях окислительного стресса, вызванного разбалансировкой митохондриальной трансляции. Полученные нами в ходе первого года работ по проекту результаты уникальны и послужат базой для дальнейших структурно-функциональных исследований тонких механизмов регуляции митохондриальной трансляции в клетках человека.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Митохондрии являются важнейшими органеллами эукариотических клеток, помимо основной своей функции – обеспечения клетки энергией с помощью синтеза АТФ, выполняющие множество метаболических и регуляторных функций. Согласно современным представлениям, митохондрии произошли путем поглощения родственной современным риккетсиям бактерии клеткой-предшественником современных эукариот. В ходе миллиардов лет эволюции геном предковой бактерии был существенно редуцирован, большая часть генов была утрачена, или же перенесена в ядро. Подавляющее число митохондриальных белков кодируется и транскрибируется в ядре, транслируется в цитозоле и импортируется в митохондрии. Тем не менее, большинство современных митохондрий сохранили небольшой геном, а также аппараты репликации, транскрипции и трансляции. Митохондриальный геном человека содержит гены двух рибосомных РНК, 22 тРНК, а также 13 белков, являющихся субъединицами комплексов цепи окислительного фосфорилирования. Долгие годы предполагалось, что биосинтез белка в митохондриях организован по бактериальному типу. Однако результаты исследований последних десятилетий показали, что митохондриальная трансляция существенно отличается от трансляции в бактериях. По всей видимости, возникшие в ходе эволюции различия этих процессов обусловлены специализацией аппарата митохондриальной трансляции на биосинтезе небольшого количества высокогидрофобных белков, котрансляционно встраивающихся в формирующиеся на внутренней митохондриальной мембране комплексы электрон-транспортной цепи. Поскольку корректность сборки этих комплексов определяется правильным стехиометрическим соотношением субъединиц, необходима строгая координация митохондриальной трансляции с биосинтезом белка в цитозоле, где образуются большинство субъединиц комплексов. Механизмы такой регуляции достаточно хорошо описаны для пекарских дрожжей, в митохондриях которых обнаружена группа особых белков – трансляционных активаторов. Эти белки специфично взаимодействуют с протяженными 5’-нетранслируемыми областями мРНК и определяют эффективность трансляции той или иной мРНК митохондриальными рибосомами. Митохондриальные мРНК человека лишены значимых 5’-нетранслируемых областей, поэтому существование трансляционных активаторов в митохондриях человека долгое время подвергалось сомнению. Однако сравнительно недавно был обнаружен активатор мРНК белка COI, селективно определяющий эффективность ее трансляции. Несмотря на то, что механизм его действия так и не был раскрыт, само существование регуляции трансляции отдельной митохондриальной мРНК позволило предположить существование системы селективной регуляции биосинтеза белка в митохондриях человека. Наш проект направлен на поиск и изучение новых механизмов регуляции трансляции в митохондриях человека. Для этого мы проводим биоинформатический поиск белков – кандидатов на роль регулятора митохондриальной трансляции, затем с помощью методов редактирования генома модифицируем геном линий клеток человека, внося делеции в соответствующие гены. После этого мы анализируем, изменилась ли эффективность митохондриальной трансляции в таких клетках. Для этого мы блокируем трансляцию в цитозоле с помощью антибиотика циклогексимида, связывающегося с цитозольными рибосомами, но не влияющего на работу митохондриальных рибосом, после чего добавляем в среду радиоактивно меченый метионин. Таким образом радиоактивная метка включается только в продукты митохондриальной трансляции, эффективность биосинтеза которых впоследствии может быть проанализирована количественно. Также мы анализируем биохимические параметры функционирования митохондрий в клетках полученных линий – скорость поглощения кислорода, активности комплексов электрон-транспортной цепи, стехиометрический состав суперкомплексов внутренней мембраны митохондрий. Кроме этого, мы применяем методы дифференциальной протеомики для поиска партнеров исследуемых нами белков. Такие эксперименты позволяют нам получать данные о молекулярных механизмах регуляции митохондриальной трансляции. В ходе работ по проекту в течение второго этапа нами были охарактеризованы два белка, участвующих в регуляции митохондриальной трансляции. Первый из них – белок CHCHD1, ассоциированный с малой субъединицей митохондриальной рибосомы. Мы получили линию клеток человека с делецией в гене этого белка, приводящей к прекращению его биосинтеза в клетке. В клетках этой линии было отмечено существенное снижение эффективности биосинтеза всех митохондриально кодируемых белков. Однако при этом стационарное количество комплексов электрон-транспортной цепи оказалось сравнимым с таковым в клетках без делеции. Более того, снижение основных митохондриальных функций также было незначительным. Мы предположили, что белок CHCHD1 влияет на стадию элонгации трансляции, поэтому его отсутствие снижает скорость биосинтеза белка, но не приводит к уменьшению количества митохондриально кодируемых белков. В подтверждение правильности этого предположения мы получили данные о большем количестве связанной миторибосомами мРНК в клетках с делецией в соответствующем гене в сравнении с клетками дикого типа. Кроме того, в эксперименте по анализу митохондриальной трансляции мы показали, что уровень накопления радиоактивной метки у клеток с делецией в гене CHCHD1 выравнивается с таковым у клеток дикого типа через непродолжительное время после замены радиоактивного метионина на нерадиоактивный. Эти данные свидетельствуют о снижении именно скорости элонгации трансляции в митохондриях клеток с делецией в гене CHCHD1. Таким образом, нам удалось продемонстрировать роль белка CHCHD1 в осуществлении элонгации митохондриальной трансляции. Также нами была получена линия клеток человека HeLa с делецией в гене белка PTCD2, имеющего в своем составе РНК-связывающий пентатрикопептидный мотив. Анализ митохондриальной трансляции в клетках такой линии показал значимое снижение эффективности биосинтеза белка COIII, также было показано и снижение стационарного уровня этого белка. При анализе митохондриальных функций клеток линии с делецией в гене PTCD2 выявлено значительное снижение скорости поглощения кислорода, снижение активности цитохром с оксидазы, а также отсутствие суперкомплексов высокого порядка. Исходя из этого мы предположили, что белок PTCD2 является селективным регулятором трансляции митохондриально кодируемого белка COIII. Также с помощью ко-иммунопреципитации и масс-спектрометрии мы выявили, что белок PTCD2 взаимодействует с белками как малой, так и большой субъединиц митохондриальной рибосомы человека. Эти данные были подтверждены в ходе седиментационного анализа, PTCD2 обнаруживался во фракциях, соответствующих ассоциированным митохондриальным рибосомам после ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Исходя из полученных нами данных можно заключить, что белок PTCD2 регулирует трансляцию митохондриально кодируемого белка COIII в клетках человека линии HeLa посредством взаимодействия с ассоциированными митохондриальными рибосомами.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Митохондрии являются обязательными органеллами практически всех современных эукариотических клеток, осуществляя множество разнообразных функций, основной из которых является синтез энергии в форме АТФ путем окислительного фосфорилирования. Эволюционно митохондрии произошли в результате поглощения предшественником эукариот бактерии, родственной современным альфа-протеобактериям. В ходе эволюции митохондрии утратили большую часть генов предшественников, однако сохранили свой небольшой геном, а также аппараты его репликации, транскрипции и биосинтеза белка. Трансляционный аппарат митохондрий сходен с бактериальным, однако имеет ряд принципиальных отличий, по всей видимости, связанных с необходимостью строгой регуляции биосинтеза белка в органеллах и координацией с трансляцией в цитозоле ядерно кодируемых митохондриальных белков. В геноме митохондрий человека закодировано 13 белков, которые являются коровыми субъединицами комплексов цепи окислительного фосфорилирования и абсолютно необходимыми для корректной работы электрон-транспортной цепи. Очевидно, что существует система специфической регуляции биосинтеза этих белков, поскольку их мРНК образуются в равном количестве в результате синтеза общего протяженного транскрипта и его последующего сплайсинга, при этом для корректной работы электрон-транспортной цепи необходимы не стехиометрически эквивалентные количества субъединиц различных комплексов. В то же время мРНК митохондрий человека лишены важнейшего регуляторного участка – 5’- нетранслируемой области, с которой могли бы взаимодействовать специфические белковые регуляторы трансляции. Тем не менее, к настоящему времени обнаружены как минимум два специфических регулятора трансляции митохондриальных мРНК человека – TACO1 (регулирует трансляцию белка CO I) и PTCD2 (повышает эффективность трансляции мРНК CO III, что показано нами в ходе выполнения предыдущего этапа проекта). Наш проект направлен на поиск других факторов регуляции митохондриальной трансляции в клетках человека. В ходе 3 этапа выполнения проекта мы с помощью системы редактирования генома получили линии клеток человека с делециями в генах SLIRP и LETM1. Клетки с делецией в гене LETM1 оказались нежизнеспособными, причем ни в одном из вариантов, проведенных нами делеций. Клетки с делецией в гене SLIRP могли расти на питательных средах с высоким содержанием глюкозы. Далее перед нами возникла дополнительная и, как выяснилось, нетривиальная задача – разработать новый метод изучения эффективности митохондриальной трансляции in vivo. Обычно для этого используется подход, заключающийся в мечении продуктов биосинтеза белка в митохондриях радиоактивным изотопом серы путем добавления в питательную среду 35S-метионина в условиях ингибирования цитозольной трансляции антибиотиком циклогексимидом. Однако в настоящее время получение или закупка 35S-метионина невозможны. Тем не менее, исследование регуляции трансляции невозможно без рабочего метода изучения ее эффективности. В разработанном нами подходе используется схожий с описанным выше принцип – блокировка цитозольного биосинтеза белка циклогексимидом и мечение продуктов остающейся функциональной митохондриальной трансляции, однако в качестве метящего агента используется неприродная аминокислота – гомопропаргилглицин (HPG). Эта аминокислота проникает в клетки и митохондрии, где узнается метиониновой аминоацил-тРНК-синтетазой, которая присоединяет ее к метиониновой тРНК. В результате этого HPG встраивается в новосинтезируемые в митохондриях белки вместо метионина. HPG имеет в своем составе алкиновую группу, что позволяет с помощью клик-химии присоединить к ней азидное производное флуоресцентного красителя AF488, после чего электрофоретически разделить продукты митохондриальной трансляции в геле и визуализировать их с помощью флуоресцентного сканера. Разработка описанного метода позволила нам оценить влияние отсутствия белка SLIRP на митохондриальную трансляцию. Оказалось, что функциональная делеция в гене SLIRP приводит к снижению биосинтеза митохондриально кодируемых субъединиц цитохром c-оксидазы (CO I, CO II и CO III), а также субъединиц НАДН-дегидрогеназы, в то время как эффективность трансляции компонентов цитохром bc1 комплекса и АТФ-синтазы оставалась неизменной. Далее мы оценили скорость поглощения кислорода нокаутными по SLIRP клетками в обычных условиях, а также при добавлении ингибиторов отдельных комплексов цепи окислительного фосфорилирования. Оказалось, что в митохондриях нокаутных клеток существенно снижена скорость потребления кислорода в сравнении с клетками дикого типа, при этом отсутствие значимых изменений в скорости потребления кислорода в ответ на разобщение электрохимического потенциала свидетельствует о дисфункции цитохром c-оксидазы. Последнее было подтверждено оценкой количества собранных комплексов с помощью нативного электрофореза и вестерн-блот анализа, а также изучения активности комплексов в геле. Помимо этого, мы показали, что SLIRP взаимодействует с митохондриальной рибосомой, соосаждаясь с ее малыми субъединицами в градиенте плотности сахарозы при ультрацентрифугировании. По всей видимости, это взаимодействие и определяет регуляторную роль SLIRP в митохондриальном биосинтезе белка в клетках человека. В совокупности, полученные нами данные позволяют заключить, что белок SLIRP является регулятором трансляции митохондриально кодируемых субъединиц цитохром c-оксидазы, осуществляющим свое действие путем связывания с малой рибосомной субъединицей.