КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер 21-14-00028

НазваниеДве стратегии накопления металлов у растений: причины и следствия

РуководительСерегин Илья Владимирович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2021 г. - 2023 г.

Конкурс№55 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-206 - Физиология и биохимия растений

Ключевые словаArabidopsis halleri, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Microthlaspi perfoliatum, Noccaea caerulescens, цинк, никель, транспорт и распределение металлов, гистохимия, гипераккумуляция и устойчивость к металлам, деление и растяжение клеток, рост и развитие растений, жирные кислоты, мембраны, клеточный цикл

Код ГРНТИ34.31.00

СтатусУспешно завершен

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
Минеральное питание растений является важной составляющей, определяющей их продуктивность. C одной стороны, дефицит питательных элементов является лимитирующим фактором, снижающим продуктивность сельскохозяйственных культур и широко распространенной причиной, вызывающей заболевания человека и детскую смертность. С другой стороны, загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами в результате хозяйственной деятельности человека является серьезной проблемой во всем мире, так как именно тяжелые металлы являются одними из самых распространенных токсикантов. Проект направлен на решение фундаментальной проблемы современной физиологии растений и биологии развития –– выяснение специфики механизмов транспорта, детоксикации и ростингибирующего действия металлов у растений, контрастно различающихся по устойчивости к металлам и способности к их накоплению в корнях и побегах. Повышение содержания металлов в растениях выше оптимальных значений может привести к проявлению множественного токсического действия металлов на различные физиологические процессы, что в конечном итоге приведет к нарушению роста и морфогенеза растений [обзоры Серегин, Иванов, 2001; Серегин, Кожевникова, 2006]. Нарушение роста и морфогенеза – один из важнейших видимых симптомов воздействия различных стресс-факторов, который часто используется для оценки их фитотоксичности. Изучение металл-индуцированных изменений роста и морфогенеза растений позволяет в полной мере оценить связь между особенностями распределения металлов и механизмом их токсического действия. До настоящего времени остаются недостаточно изученными механизмы трансмембранного, радиального и дальнего транспорта металлов, а также механизмы их ростингибирующего действия. Принципиально новым подходом для решения поставленной проблемы является комплексное сравнительное изучение поглощения, транспорта, накопления и распределения металлов в растениях, а также влияния металлов на ростовые процессы у растений двух контрастных групп: исключателей, накапливающих металлы в корнях и гипераккумуляторов, накапливающих металлы в побегах. Поэтому основной задачей данного проекта является выяснение физиологических механизмов, определяющих избирательное накопление никеля (Ni) и цинка (Zn) в корнях исключателей (Arabidopsis thaliana, Arabidopsis lyrata, Microthlaspi perfoliatum) или побегах гипераккумуляторов (Arabidopsis halleri, Noccaea caerulescens), а также сравнительный клеточный анализ действия этих металлов на рост. A. thaliana широко используется для изучения роста и морфогенеза растений [Dello Ioio et al., 2007; Petricka et al., 2012], а A. halleri и N. caerulescens являются модельными растениями для изучения феномена гипераккумуляции и обладают высокой устойчивостью к Zn и Zn/Ni, соответственно [Sterckeman et al., 2017; Seregin, Kozhevnikova, 2020; Kozhevnikova et al., 2020]. В ходе выполнения проекта предполагается комплексное решение поставленной задачи, включающее детальное изучение транспорта и распределения металлов по тканям и органам растений, а также изучение механизмов ростингибирующего действия металлов на клеточном уровне. С этой целью будут использованы разнообразные методы и подходы, которыми на экспертном уровне владеют члены научного коллектива. К ним относятся: гистохимические методы анализа распределения металлов по тканям и органам растений; световая и флуоресцентная микроскопия; атомно-абсорбционная спектрофотометрия; методы выделения везикулярных препаратов тонопласта и плазмалеммы для оценки эффективности транспорта металлов через биологические мембраны, а также изменений жирнокислотного состава липидного бислоя мембран; газовая хроматография с масс-стектрометрической детекцией для идентификации жирных кислот; биохимические методы для определения интенсивности перекисного окисления липидов; иммуноцитохимические методы с применением антител к транспортерам и флуоресцентных меток к ним; методики оценки общего количества поглощенного металла и эффективности его загрузки в сосуды ксилемы; комплекс цитологических методов и подходов, направленных на анализ роста корней на клеточном уровне. Реализация проекта впервые позволит: 1) выяснить общие черты и специфические особенности в распределении и накопления Ni и Zn в различных клетках, тканях, органах, растущих участках корней и побегов, листьях разного возраста изучаемых гипераккумуляторов и исключателей; 2) изучить влияние Ni и Zn на водный режим у растений двух контрастных групп; 3) оценить эффективность транспорта металлов через плазмалемму и тонопласт; 4) провести сравнительный анализ влияния Ni и Zn на качественный и количественный состав жирных кислот липидов мембран у гипераккумуляторов и исключателей; 5) установить тканевую локализацию транспортера MTP1, играющего ключевую роль в детоксикации металлов в вакуоли; 6) оценить роль гистидина в радиальном транспорте Ni и Zn у A. halleri и A. lyrata; 7) расширить представления о роли антоцианов в накоплении Zn у гипераккумуляторов и исключателей; 8) выяснить, специфично или неспецифично действие Ni и Zn на отдельные ростовые процессы (деление и растяжение клеток, переход клеток к растяжению и др.); 9) количественно оценить изменение ростовых процессов в корнях гипераккумуляторов и исключателей, интенсивность поглощения металлов, а также изменение пространственной конфигурации корневой системы при действии Ni и Zn. Изучение морфофизиологических особенностей растений, определяющих их способность избирательно накапливать металлы в корнях или побегах имеет не только большое фундаментальное значение, связанное с пониманием механизмов трансмембранного, радиального и дальнего транспорта металлов у растений, механизмов гипераккумуляции, устойчивости и ростингибирующего действия металлов, но и имеет важное практическое значение, так как лежит в основе подходов, использующихся в технологиях биообогащения, фиторемедиации и фитомайнинга. Анализ ростингибирующего действия металлов несомненно важен для разработки технологии мониторинга загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами, что входит в число критических технологий Российской Федерации. Решение поставленной в проекте задачи имеет мультидисциплинарное значение и внесет важный вклад в современную экологическую физиологию растений, биологию развития, иономику и токсикологию.

Ожидаемые результаты
В ходе выполнения проекта будут получены следующие новые результаты: 1)Будет проанализировано действие Ni и Zn в различных концентрациях на взрослые растения и проростки гипераккумуляторов Noccaea caerulescens, Arabidopsis halleri и близкородственных исключателей Microthlaspi perfoliatum, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, что позволит построить концентрационную кривую и выбрать рабочие концентрации солей Ni и Zn. Будет оценено токсическое действие Ni и Zn по накоплению сухой и сырой биомассы для взрослых растений, а также по приросту корня на 1-е, 2-е и 3-ьи сутки инкубации у проростков. Будут подобраны концентрации солей Ni и Zn, при которых наблюдается сходное ингибирование роста корня у гипераккумуляторов и исключателей. Сравнительный анализ концентрационной кривой и ингибирования роста корня со временем позволит провести первичную оценку специфичности или неспецифичности действия металла на деление и растяжение клеток. 2)Будет проведена сравнительная оценка общего количества поглощенного металла как суммы общего содержания металла в корневой системе и общего содержания металла в пасоке в расчете на единицу сухой массы корневой системы. Будет впервые проведен сравнительный анализ влияния Ni и Zn на пространственную конфигурацию корневых систем гипераккумуляторов и исключателей. С помощью классических физиологических подходов будет оцениваться объем корневой системы по объему вытесненной воды. Затем корневые системы будут подкрашены проционовым красным (для увеличения контраста) и отсканированы, что сделает возможным проведение измерений и подсчетов разных параметров с помощью компьютерной программы WinRhizo. С помощью этой программы будет проведен общий анализ корневых систем: общая длина корней, средний диаметр корней, общая площадь, количество апексов, степень разветвленности корневой системы. 3)Будет оценено действие Ni и Zn на деление клеток в меристеме корня, переход клеток к растяжению и их растяжение в зоне растяжения корня у гипераккумуляторов и исключателей. Будет проведена оценка размера меристемы, размера переходной области, числа меристематических клеток в ряду, профиля изменения длин клеток по зоне растяжения и длины закончивших рост клеток, а также измерен диаметр корня в начале зоны растяжения. Будет определена продолжительность клеточного цикла, а также вычислено время жизни клеток в меристеме, то есть время от момента образования клеток на границе покоящегося центра до их выхода из меристемы, и относительная скорость роста растягивающихся клеток. Обобщение результатов клеточного анализа и оценка специфичности и избирательности действия Ni и Zn на ростовые процессы позволят впервые подойти к пониманию механизма действия этих металлов на рост корня на клеточном уровне. 4) С помощью атомно-абсорбционной спектрометрии будет проведен количественный анализ содержания Ni и Zn в корнях и побегах гипераккумуляторов и исключателей (на единицу массы и в расчете на орган), а также вычислен фактор транслокации. Для более детального анализа распределения металла по тканям корня и побега будет проведен гистохимический анализ распределения Ni и Zn в различных участках корня и листьях разного возраста. Гистохимический анализ распределения Ni будет проводиться с помощью металлохромного индикатора диметилглиоксима, а Zn – помощью металлохромного индакатора цинкон и флуоресцентного индикатора Zinpyr-1. Анализ интенсивности флуоресценции комплексов Zn с индикатором Zinpyr-1 будет проведен с использованием программы ZEISS ZEN Lite, что позволит полуколичественно оценить накопление Zn в клетках разных тканей. Полученные данные принципиально важны, так как распределение металлов может быть крайне гетерогенно не только в разных тканях, но и в разных клетках одной и той же ткани, что может быть причиной различного проявления их токсического действия. 5)Будет выяснено, существует ли связь между накоплением Zn и антоцианов в разных типах клеток в листьях гипераккумулятора A. halleri и исключателей A. lyrata и A. thaliana. Для этого на одних и тех же срезах листьев или препаратах эпидермы будет изучено распределение Zn и накопление антоцианов. Кроме того, будет проведена оценка содержания и распределения Zn у мутантов ttg1-1 A. thaliana с заблокированным синтезом антоцианов с одновременной оценкой устойчивости этих растений к Zn по накоплению сырой и сухой массы, интенсивности транспирации и накоплению малонового диальдегида в качестве стресс-маркера. Будет определено общее содержание антоцианов в листьях изучаемых видов, что в совокупности с другими полученными результатами позволит оценить их участие в качестве антиокидантов и/или хелаторов металлов в разных типах клеток листа. 6)Будет проведен сравнительный анализ влияния Ni и Zn на содержание воды и интенсивность транспирации у гипераккумуляторов и исключателей. Полученные данные позволят оценить степень металл-индуцированного водного дефицита у растений двух контрастных групп. В совокупности с данными количественного и гистохимического анализа полученные данные не только дадут дополнительную информацию о степени проявления токсического действия металлов на водный режим, но и позволят оценить вклад транспирационного тока в накопление металлов в листьях. 7)Будет изучен вклад гистидин-зависимого радиального транспорта у гипераккумулятора A. halleri и исключателя A.lyrata. С помощью современного метода LC-MS/MS будет определено содержание свободного гистидина в корнях и побегах этих видов при инкубации в присутствии различных концентраций Zn и Ni, а также проведена оценка эффективности загрузки Ni и Zn в сосуды ксилемы без предобработки и после предобработки гистидином или аланином (в качестве контроля). Для этого будет определена не только концентрация Ni и Zn в пасоке, но и вычислен процент загруженного в ксилему металла от общего количества поглощенного металла. Будет проведен сравнительный анализ транспорта Ni и Zn в форме сульфатов и комплексов этих металлов с гистидином в различных соотношениях (1:1 и 1:2) в выделенные из корней и побегов везикулы тонопласта. В совокупности с ранее полученными результатами, эти данные позволят не только оценить эффективность механизма детоксикации Ni и Zn в корнях и побегах гипераккумулятора и исключателя, но и расширит наши знания о роли низкомолекулярного хелатора гистидина в механизмах гипераккумуляции. Кроме того, совокупность полученных данных позволит проверить сформулированную нами ранее альтернативную гипотезу: сформировался ли гистидин-зависимый путь транспорта как часть важнейшего механизма гипераккумуляции Ni, а его участие в гипераккумуляции Zn является своеобразным «побочным продуктом» или же мы имеем дело с обратной ситуацией. Для сравнительного количественного анализа эффективности поступления металлов в клетки у гипераккумулятора и исключателя планируется оценить поглощение Ni и Zn выделенными из корней и побегов везикулами плазмалеммы, а для сравнительного анализа эффективности экспорта металлов из симпласта в апопласт в корнях – оценить АТФ-зависимый транспорт Ni и Zn в выделенные из корней инвертированные (цитоплазматической стороной наружу) везикулы плазмалеммы. 8) Под действием металлов может изменяться проницаемость мембран, что в свою очередь является результатом изменения липидного состава мембран и перекисного окисления липидов мембран в результате металл-индуцированного окислительного стресса. Поэтому нами будет проведена сравнительная оценка степени перекисного окисления липидов при действии Ni и Zn, что принципиально важно не только для оценки степени токсического действия металлов, но и для интерпретации результатов по антиоксидантной роли антоцианов. Кроме того, в корнях и побегах гипераккумуляторов и исключателей будет проведен сравнительный анализ влияния Ni и Zn на качественный и количественный состав жирных кислот липидов мембран. 9)Учитывая, что транспортер МТР1 играет ключевую роль в транспорте различных металлов в вакуоль [обзор Seregin, Kozhevnikova, 2020], а корневая система является основным путем поступления их в растение, в ходе выполнения проекта будет проведено сравнительное изучение локализации транспортера МТР1 в клетках разных тканей корня гипераккумуляторов и исключателей. С использованием иммуноцитохимических методов с применением антител к транспортерам и флуоресцентных меток к ним будет установлено, существует ли тканеспецифичность в локализации транспортера MTP1 у гипераккумуляторов и исключателей. В совокупности с данными по гистидин-зависимому пути транспорта металлов, полученные результаты существенно дополнят наши представления о транспорте металлов в корнях гипераккумуляторов и исключателей. Результаты этих исследований в совокупности позволят впервые подойти к пониманию механизма проявления ростингибирующего действия Ni и Zn на разных уровнях организации, а также существенно расширят наши знания о физиологических механизмах, определяющих феномен гипераккумуляции и высокую устойчивость растений гипераккумуляторов. Полученные данные имеют важное фундаментальное значение, связанное с пониманием механизмов трансмембранного, радиального и дальнего транспорта металлов у растений, механизмов гипераккумуляции, устойчивости и ростингибирующего действия металлов, могут быть основой для разработки подходов, использующихся в технологиях биообогащения, фиторемедиации, фитомайнинга, а также мониторинга загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами с помощью корневых тестов. Полученные в ходе выполнения проекта результаты могут быть использованы в различных образовательных курсах в ВУЗах и в экологическом воспитании школьников.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---