Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Липидные рафты – обогащенные холестерином и сфинголипидами мембранные микродомены, в которых концентрируются многие сигнальные молекулы и ионные каналы. Рафты в изобилии присутствуют в синаптических мембранах, где их функция до сих пор слабо исследована. В ходе реализации настоящего проекта выявлены эффекты ферментов, холестерин оксидазы (ХО) и сфингомиелиназы (СМ), модифицирующих компоненты липидных рафтов, на свойства синаптических мембран и пресинаптические процессы в периферических синапсах (нервно-мышечных контактах и симпатических варикозах предсердий мыши). Было обнаружено, что окисление даже небольшой фракции мембранного холестерина ферментом ХО способно дестабилизировать липидные рафты, что сопровождается нарушением кластеризации и упорядоченности упаковки липидов, а также увеличением текучести мембран избирательно в синаптическом регионе. Особенно заметно снижалась целостность липидных рафтов мембран синаптических везикул в условиях, когда ХО получала к ним доступ. Свойства мембран экстрасинаптических регионов изменялись только при действии ХО в более высокой концентрации, окисляющей существенно большую часть холестерина мембран. Следовательно, состояние холестерина (окисленное или нет) важно для формирования липидных рафтов синаптических мембран, в особенности мембран синаптических везикул, а ХО может быть использована как инструмент для выявления синаптических процессов, наиболее чувствительных к мембранным свойствам. В синапсах существует несколько видов секреции нейромедиатора (квантовая спонтанная и вызванная, а также неквантовая), которые реализуются относительно независимыми механизмами, часто имеют свои уникальные пути регуляции и играют определенные физиологические роли. Более того, вызванная секреция, обеспечивающая быструю нейропередачу, при разных режимах (частотах) активности может осуществляться за счет вовлечения в экзоцитоз синаптических везикул из различных пулов. Было обнаружено, что окисление небольшой фракции холестерина поверхностных мембран, не влияя на спонтанную секрецию и вызванное освобождение нейромедиатора при низкочастотной (0.5 Гц) активности, существенно потенцирует секрецию квантов нейромедиатора при умеренно (20 Гц)- и высоко (70Гц)-частотной стимуляции в нервно-мышечных синапсах. Это сопровождалось усилением мобилизации (транспорт в сайты экзоцитоза) и эндоцитоза синаптических везикул. Окисление мембранного холестерина также влияло на тип экзоцитоза: с полным встраиванием мембраны везикулы в пресинаптическую мембрану или с образованием поры слияния, которая быстро закрывается после освобождения нейромедиатора (“kiss-and-run” вариант). Было обнаружено, что при высокочастотной активности в норме значительная часть синаптических везикул освобождает нейромедиатор через пору слияния, тогда как окисление мембранного холестерина направляет освобождение нейромедиатора по пути “полного” экзоцитоза. При этом, окисление холестерина плазматических мембран приводило к ослаблению неквантовой секреции ацетилхолина, что определялось снижением активности антипорта ацетилхолина и протонов, чувствительного к везамиколу (вероятно, везикулярного транспортера ацетилхолина, VAChT, встроенного в пресинаптическую мембрану). Для воздействия на мембраны синаптических везикул, во время аппликации ХО производилась стимуляция двигательного нерва. В результате, ХО получала доступ к мембранам экзоцитировавших синаптических везикул, которые впоследствии захватывались эндоцитозом. Было обнаружено, что после подобной процедуры секреция нейромедиатора в ответ на умеренно- и высокочастотную стимуляцию была существенно подавлена в нервно-мышечных синапсах. Это сопровождалось угнетением мобилизации и снижением интенсивности эндоцитоза синаптических везикул. Наоборот, неквантовое освобождение ацетилхолина, осуществляемое VAChT и сопровождаемое закислением цитоплазмы, увеличивалось. Стоит отметить, что в экспериментах, где ХО получает доступ к мембранам рециклирующих синаптических везикул, окисляется и холестерин поверхностных мембран, но мы наблюдали противоположные изменения в нейросекреции, что указывает на доминирование эффектов модификации везикулярного пула холестерина. Схожим образом, в симпатических варикозах предсердий окисление холестерина поверхностных мембран усиливало вызванный деполяризацией экзоцитоз, компенсаторный эндоцитоз и заполнение синаптических везикул нейромедиатром, а в условиях, когда окислялся холестерин синаптических везикул, наблюдались прямо противоположные эффекты. Также в процессе исследования симпатических варикозов предсердий было обнаружено, что для них характерен большой размер немедленно готового к освобождению нейромедиатора пула синаптических везикул, которые обладают высокой способностью к рециклированию и повторному заполнению нейромедиатором. Другой подход для воздействия на мембраны за счет гидролиза сфингомиелина показал, что СМ даже в низкой концентрации, не влияя на текучесть мембран, снижает целость липидных рафтов в синаптических и экстрасинаптических регионах нервно-мышечных препаратов и в мембранах предсердий мыши. Примечательно, что липидные рафты мембран синаптических везикул оказались устойчивыми к действию СМ, указывая на разную композицию мембранных микродоменов пресинаптической и везикулярной мембран. Было обнаружено, что СМ в низкой концентрации, не влияя на спонтанную секрецию и вызванное освобождение нейромедиатора в ответ на низкочастотную активность, значительно увеличивает секрецию нейромедиатора при умеренно-частотой стимуляции двигательного нерва. Это сопровождалось усиленной мобилизацией синаптических везикул и их последующим эндоцитозом. Интересно, что СМ направляла освобождение нейромедиатора по пути полного экзоцитоза (препятствуя kiss-and-run механизму) при высокочастотной активности, однако количество квантов, секретируемых при высокочастотной стимуляции существенно не изменялось. Неквантовая секреция медиатора подавлялась СМ за счет снижения активности везамикол-чувствительного антипорта АХ и протонов. Таким образом, гидролиз мембранного сфингомиелина, вероятно, тормозит неквантовое освобождение АХ, но усиливает вызванную секрецию при умеренно-частотной активности в нервно-мышечных синапсах. В симпатических варикозах предсердий СМ также потенцировала вызванный деполяризацией экзо-эндоцитоз синаптических везикул и их заполнение нейромедиатором для повторного использования в нейросекреции. Важно отметить, что если СМ получала дополнительно доступ к мембранам рециклирующих синаптических везикул в ходе аппликации, то ее эффекты сохранялись такими же, что и в условиях, когда СМ действовала только на поверхностные мембраны. Это указывает на доминирующее значение сфингомиелина пресинаптических мембран (а не мембран синаптических везикул) в протекании пресинаптических процессов, обеспечивающих секрецию нейромедиатора. В работе применялись в десять раз отличающиеся концентрации ферментов, однако эффекты на синаптические процессы низкой и высокой концентрации были выражены в схожей степени. Исключение составляет спонтанная секреция, которая усиливалась только в ответ на высокую концентрацию ХО и СМ. Также высокая концентрация ХО увеличивала продукцию активных форм кислорода, перекисное окисление липидов и подавляла образование NO в синаптических регионах; а высокая концентрация СМ повышала цитозольный уровень кальция. Низкие концентрации ферментов не обладали подобными эффектами, поэтому их влияния на пресинаптические процессы могут быть результатом непосредственных изменений мембранных свойств. Таким образом, на данном этапе реализации проекта получены данные, указывающие на то, что окисление мембранного холестерина и гидролиз сфингомиелина снижают стабильность липидных рафтов поверхностных синаптических мембран, в результате чего существенно усиливается секреция нейромедиатора при интенсивной активности в нервно-мышечных синапсах диафрагмы и варикозах предсердий мыши. Это происходит за счет усиления ключевых этапов цикла синаптических везикул (процессов экзоцитоза, мобилизации и эндоцитоза). Интересно отметить. что неквантовое выделение ацетилхолина, наоборот, ослабляется за счет снижения активности антипорта АХ и протонов (VAChT), встроенного в плазматическую мембрану в нервно-мышечных синапсах. Липидные рафты мембран синаптических везикул устойчивы к действию СМ, но могут быть дестабилизированы ХО. Нарушение липидных рафтов мембран синаптических везикул ослабляет секрецию нейромедиатора при интенсивной активности за счет угнетения вовлечения синаптических везикул в экзоцитоз в двигательных и симпатических нервных окончаниях. В этих условиях неквантовая секреция медиатора, наоборот, усиливается в нервно-мышечных синапсах. В целом, полученные данные указывают на разную композицию и роль липидных рафтов пресинаптических мембран и мембран синаптических везикул. Если рафты плазматических мембран ограничивают нейропередачу при умеренной/интенсивной стимуляции, способствуют освобождению нейромедиатора через пору слияния и поддерживают неквантовую секрецию; то рафты мембран везикул необходимы для эффективного вовлечения синаптических везикул в вызванную секрецию и сдерживают неквантовое освобождение нейромедиатора.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Используя микроэлектродную регистрацию постсинаптических сигналов, тензометрию, флуоресцентные методы, а также фармакологические подходы, были получены новые данные о роли липидных рафтов в регуляции пресинаптических процессов в нервно-мышечных синапсах и симпатических варикозах предсердий мыши. Было обнаружено, что в двигательных нервных окончаниях синаптические везикулы можно разделить на два функциональных пула. Везикулы первого пула (назвали “house-keeping”) вовлекаются в экзоцитоз при низкочастотной активности (5-10Гц), а также менее эффективно при повышении частоты стимуляции нерва. Синаптические везикулы второго (“plug-in” или “подключаемого”) пула рекрутируются избирательно при интенсивной активности (20Гц и более), и для них характерен феномен “ротации”, когда в ходе циклов экзо-эндоцитоза “более и менее активные” везикулы меняются местами. Под влиянием низких концентраций сфингомиелиназы и холестерин оксидазы, происходит нарушение липидных рафтов преимущественно в синаптических мембранах. Эти разрушающие липидные рафты воздействия усиливали вовлечение в экзоцитоз синаптических везикул, в основном обеспечивающих нейропередачу при низкочастотной (10Гц) активности. Потенцирующий эффект сохранялся, хотя и менее выраженно, при повышении частоты стимуляции нерва. В условиях, когда фермент, нарушающий рафты, получал доступ не только к плазматическим мембранам, но и мембранам экзо-эндоцитирующих синаптических везикул, усиления мобилизации везикул при низкочастотной активности не происходило. Таким образом, целостность липидных рафтов пресинаптических мембран в основном ограничивает участие в экзоцитозе “house-keeping” пула синаптических везикул, и в меньшей степени ““plug-in” пула везикул. Липидные рафты в мембранах синаптических везикул важны для способности везикул вовлекаться в экзоцитоз при низкочастотной активности. Следовательно, липидные рафты пресинаптической и везикулярных мембран имеют противоположные значения для рекрутирования в экзоцитоз синаптических везикул, составляющих пул, обеспечивающий нейропередачу при низкочастотной активности. Катехоловые амины играют ведущую роль в адаптации функции скелетной мускулатуры к стрессу. В скелетных мышцах основными являются β2-адренорецепторы (АР), активация которых имеет защитную роль в моделях миастений и бокового амиотрофического склероза. Обнаружено, что активация β2-АР, не влияя на спонтанный выброс ацетилхолина и секрецию нейромедиатора в ответ на одиночные стимулы, существенно усиливает мобилизацию синаптических везикул и секрецию нейромедиатора при повышении частоты стимуляции двигательного нерва. Блокирование β2-АР имело угнетающий эффект на нервно-мышечную передачу в ex vivo препарате, указывая на освобождение эндогенного норадреналина из варикозов симпатических нервов, расположенных в скелетных мышцах. В экспериментах с разрушением липидных микродоменов с помощью сфингомиелиназы и холестерин оксидазы, было показано, что после дестабилизации рафтов, активация β2-АР, наоборот, угнетает мобилизацию синаптических везикул и секрецию нейромедиатора при интенсивной стимуляции нерва. Таким образом, целостность липидных рафтов необходима для опосредуемой β2-АР позитивной регуляции экзо-эндоцитоза синаптических везикул, и дестабилизация рафтов ведет к проявлению угнетающего экзоцитоз эффекта стимуляции β2-АР. АТФ и его производные – ключевые локальные регуляторы нервно-мышечной передачи, которые во многом определяют депрессию нервно-мышечной передачи in vivo. Было показано, что экзогенный АДФ, в основном через активацию P2Y13 пуринорецепторов, оказывает сильное подавляющее действие на вызванный экзоцитоз и мобилизацию синаптических везикул в двигательном нервном окончании. Ингибирование P2Y13 рецепторов, наоборот, усиливает экзоцитоз синаптических везикул, выявляя угнетающее действие эндогенного АТФ/АДФ. Нарушение липидных рафтов при окислении холестерина и гидролизе сфингомиелина предотвращает угнетающий эффект, опосредуемый активацией P2Y13 рецепторов. Следовательно, целостность липидных рафтов требуется для проявления депрессантного эффекта на экзоцитоз АТФ/АДФ, реализуемого через P2Y13 рецепторы. Кроме того, было показано, что эффекты стимуляции пуринорецепторов могут модулироваться активацией K(ATP) каналов, функционирование которых зависит от липидных рафтов. В покое абсолютно большая часть ацетилхолина выделяется неквантовым путем в нервно-мышечных синапсах. Это выделение ацетилхолина принимает участие в нейротрофических процессах. Было обнаружено, что активация β2-АР увеличивает внеклеточное содержание ацетилхолина, что сопровождается снижением цитоплазматического рН в синаптическом регионе и зависит от активности везамикол-чувствительного транспортера (антипорта ацетилхолина и протонов). В отличие от β2-АР, активация пуринорецепторов P2Y13 уменьшала концентрацию внеклеточного ацетилхолина за счет снижения активности везамикол-чувствительного антипорта ацетилхолина и протонов. Предварительное нарушение липидных рафтов за счет действия сфингомиелиназы или холестерин оксидазы предотвращало опосредуемое активацией β2-АР и пуринорецепторов P2Y13 изменение внеклеточного уровня ацетилхолина и цитоплазматического pH. Таким образом, β2-АР и P2Y13 пуринорецепторы противоположным образом регулируют внеклеточный уровень ацетилхолина (в покое), определяемый активностью везамикол-чувствительного транспортного белка; при этом для осуществления этой регуляции необходима целостность липидных микродоменов. β2-АР и P2Y13 пуринорецепторы экспрессируются на пресинаптических варикозах симпатической нервной системы. Было обнаружено, что активация β2-АР облегчает вызванный деполяризацией экзоцитоз и компенсаторный эндоцитоз синаптических везикул в симпатических варикозах предсердий. Для реализации этого стимулирующего эффекта β2-АР необходима целостность мембранных микродоменов, поскольку разрушение липидных рафтов при гидролизе сфингомиелина и окислении холестерина изменяет эффект стимуляции β2-АР на противоположный (т.е. угнетающий экзоцитоз). Было выявлено, что АДФ значительно подавляет индуцированный деполяризацией экзоцитоз синаптических везикул в симпатических варикозах предсердий. Этот эффект АДФ частично реализовался через активацию P2Y13 рецепторов, и после нарушении липидных рафтов опосредуемое P2Y13-рецепторами угнетение экзоцитоза не проявлялось. Следовательно, в симпатических нервных окончаниях липидные рафты имеют ключевое значение в реализации стимулирующего и ингибирующего эффектов активации β2-АР и P2Y13-пуринорецепторов соответственно. Сократительные ответы зависят как от свойств мышечных волокон, так и надежности нервно-мышечной передачи. Было показано, что гидролиз сфингомиелина, окисление или удаление части мембранного холестерина не влияют на сокращения при прямой стимуляции диафрагмальной мышцы, однако существенно подавляют сократительную активность при непрямой (через нерв) стимуляции, в условиях, когда этим модификациям подвергаются плазматические мембраны и мембраны синаптических везикул. Если же сфингомиелиназа, холестерин оксидаза, метил-бета-циклодекстрин (1мМ; холестерин-экстрагирующий агент) действуют преимущественно на плазматические мембраны, сократительные ответы достоверно не изменяются при непрямой стимуляции. Следовательно, нарушения липидных рафтов мембран синаптических везикул в первую очередь может вести к сократительной дисфункции диафрагмальной мышцы. Таким образом, нарушения компонентов рафтов, сфингомиелина и холестерина, приводящие к дестабилизации липидных рафтов, существенно изменяют регуляцию пресинаптических процессов в нервно-мышечных синапсах и симпатических нервных окончаниях, что может вести к альтерациям мышечной активности и деятельности сердца.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе текущего этапа реализации проекта проведено исследование эффектов употребления аторвастатина (ингибитор биосинтеза холестерина) в течение недели и месяца на свойства мембран и синаптическую передачу в диафрагмальных мышцах мышей. Аторвастатин добавлялся в питьевую воду, контрольная группа животных получала воду с растворителем диметилсульфоксидом (без статина). Было установлено, что применение аторвастатина в течение недели значительно снижает уровень мембранного холестерина, внутриклеточных накоплений фосфолипидов, не влияя на стабильность липидных рафтов и размер концевых пластинок (постсинаптических областей). Потребление аторвастатина в течение месяца нарушало целостность липидных рафтов (особенно выражено в синаптических регионах) и уменьшало размер концевых пластинок, а также способствовало появлению внутриклеточных фосфолипидных включений и признаков перекисного окисления липидов. При этом уровень мембранного холестерина снижался, но увеличивалась способность захвата холестерина в форме липопротеиновых частиц. Исследование нервно-мышечной передачи с помощью микроэлектродной регистрации потенциалов концевой пластинки и экзо-эндоцитозных FM-красителей выявило, что применение аторвастатина в течение месяца снижает вызванный экзоцитоз синаптических везикул в ответ на одиночные стимулы и высокочастотную стимуляцию нерва (особенно заметно). При этом чувствительность постсинаптической мембраны к нейромедиатору увеличивалась, что может представлять компенсаторный ответ для поддержания нервно-мышечной передачи в условиях снижения эффективности процессов вызванного экзоцитоза синаптических везикул. Также было обнаружено, что после применения аторвастатина в течение месяца существенно снижается неквантовая секреция нейромедиатора, определяющая, в основном, внеклеточный уровень ацетилхолина в покое (без синаптической активности). Применение аторвастатина в течение недели вызывало существенно менее выраженные изменения в нервно-мышечной передаче (по сравнению с последствиями потребления аторвастатина в течение месяца) в форме небольшого угнетения экзоцитоза синаптических везикул в условиях длительной интенсивной стимуляции нерва. Следовательно, при действии аторвастатина первые синаптические изменения заключаются в ослаблении участия синаптических везикул в экзоцитозе. Другая часть проекта была нацелена на выяснение механизмов β2-адренергической регуляции нервно-мышечной передачи и роли в этом липидных микродоменов. Используя микроэлектродную запись постсинаптических ответов, экзо-эндоцитозные FM-красители, селективные блокаторы сигнальных молекул, а также метки, чувствительные к активным формам кислорода (АФК) и оксиду азота (NO), был идентифицирован механизм усиления мобилизации синаптических везикул при фармакологической активации β2-адренорепторов фенотеролом. В частности, было обнаружено, что активация β2-адренорецепторов ведет к повышению продукцию АФК НАДФН оксидазой, что подавляет образование NO. В свою очередь, уменьшение синтеза NO усиливало мобилизацию синаптических везикул при интенсивной синаптической активности. Также было выявлено, что этот стимулирующий нервно-мышечную передачу эффект активации β2-адренорецепторов зависит от аденилатциклазы и не зависит от Gi белка. При применении аторвастатина в течение месяца, как и при разрушении липидных рафтов в остром опыте за счет гидролиза сфингомиелина или окисления мембранного холестерина, эффект активации β2-адренорецептров на нервно-мышечную передачу менялся на противоположный, со стимулирующего на ингибирующий. Эксперименты с использованием гидролиза сфингомиелина, как модели для дестабилизации липидных микродоменов, позволили установить механизм инверсии β2-адренергической регуляции нервно-мышечной передачи. Было показано, что изменение эффекта агониста β2-адренорецепторов после нарушения целостности липидных рафтов опосредуется переключением сигнализации β2-адренорецепторов на Gi белок и увеличением продукции NO, который подавляет вовлечение синаптических везикул в экзоцитоз. Далее был идентифицирован механизм, ответственный за угнетение секреции и мобилизации синаптических везикул при активации P2Y13-пуринорецепторов в нервно-мышечном синапсе. Было обнаружено, что активация P2Y13-рецепторов угнетает экзоцитоз синаптических везикул за счет существенного увеличения продукции АФК НАДФН-оксидазой через путь, зависимый от Gi белка, освобождения ионов кальция из внутриклеточного депо и активации протеинкиназы С. При этом нарушение целостности липидных рафтов за счет гидролиза сфингомиелина, окисления холестерина и потребления аторвастатина (в течение месяца) подавляло зависимое от P2Y13-рецепторов угнетение секреции нейромедиатора и вовлечения синаптических везикул в экзоцитоз. Одновременно, дестабилизация липидных рафтов предотвращала увеличение продукции АФК при активации P2Y13-рецепторов в нервно-мышечных препаратах. Таким образом, целостность липидных рафтов необходима для сохранения способности АДФ/P2Y13-рецепторов стимулировать образование АФК, угнетающих нервно-мышечную передачу. В заключение, было показано, что ионы цинка в наномолярных и низких микромолярных концентрациях угнетают как вызванную, так и спонтанную секрецию, а в высокой микромолярной концентрации усиливают спонтанный экзоцитоз и десинхронизируют события вызванного экзоцитоза в нервно-мышечных синапсах. Также было обнаружено, что ионы цинка в высокой микромолярной концентрации частично нарушают целостность липидных рафтов (более выражено в синаптических регионах). Однако, действие ионов цинка в высокой концентрации на целостность липидных рафтов, не вносило основного вклада в эффекты цинка на секрецию нейромедиатора. Таким образом, нарушение формирования липидных микродоменов и изменения свойств плазмалеммы могут существенным образом модулировать опосредуемую β2-адренорецепторами и P2Y13-рецепторами регуляцию нервно-мышечной передачи; в то время как эффекты ионов цинка могут в существенно меньшей степени зависеть от целостности липидных рафтов.