Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Имеющиеся на настоящий момент схемы терапии опухолей головного мозга не обеспечивают значимое улучшение качества и увеличение продолжительности жизни пациентов. Разработка эффективных методов терапии этого типа опухолей с использованием опухолевых моделей, максимально сохраняющих молекулярно-биологические характеристики первичной опухоли (персонализированные культуры клеток), и детальным анализом механизма действия предлагаемых лекарственных препаратов, несомненно, являются актуальными задачами современных биомедицинских исследований. При выполнении проекта создана коллекция клеточных культур, полученных из образцов опухолей пациентов (первичные и персонализированные культуры). Созданная коллекция на данном этапе включает 10 культур клеток глиом человека, полученных из образцов первичных опухолей разной степени злокачественности (6 культур глиобластомы 4ой степени злокачественности, 3 культуры астроцитомы 3ей степени злокачественности и 1 культура олигодендроглиомы 3ей степени злокачественности). Образцы опухолей и данные гистологического анализа образцов предоставлены НИИТО им. Я.Л. Цивьяна (Новосибирск, Россия) с информированного согласия пациентов. Установлено, что пять персонализированных культур способны формировать нейросферы в условиях культивирования в отсутствии сыворотки и с добавлением факторов роста и питательных добавок. Полученные культуры могут являться основой для разработки релевантной опухолевой модели для оценки потенциала противоопухолевых агентов in vitro и in vivo. Персонализированные культуры (как адгезивные, так и содержащие нейросферы), а также иммортализованные культуры U87 MG, U343 MG были охарактеризованы по содержанию маркеров стволовых опухолевых клеток (СОК): CD133, CD44, CD15, CD171, SOX2 и MYC, а также по содержанию рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR) и фактора роста тромбоцитов (PDGFRA). Представленность CD133, CD44, CD15 и CD171 и рецепторов EGFR и PDGFRA на клетках оценивали методом проточной цитометрии с использованием соответствующих антител. Уровень маркеров SOX2 и MYC в клетках исследованных культур оценивали методами ОТ-ПЦР и вестерн-блот анализа. Показано, что уровни данных маркеров в исследованных культурах значительно варьируют и не зависят от степени злокачественности первичной опухоли. Исследование цитотоксической активности онколитического вируса - рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины в отношении клеток полученных культур показало, что VV-GMCSF-Lact эффективно снижает жизнеспособность клеток всех исследованных культур. Наиболее чувствительными к действию вируса оказались клетки астроцитом BR2.20 и AS2 (3 степень злокачественности), наиболее устойчивыми - клетки астроцитома BR5.21 и глиобластомы BR4.21 (4 степень злокачественности). Чувствительность к вирусу различалась также в парах «адгерентная культура – культура, содержащая нейросферы», соответствующих культур. Установлено, что культуры клеток, более чувствительные к действию VV-GMCSF-Lact, характеризуются большей популяцией клеток, несущих маркеры СОК, в частности, CD133+/CD44+ клетки. Согласно полученным данным чувствительность клеток к онкотоксическому действию VV-GMCSF-Lact не зависит напрямую от степени злокачественности опухоли. Анализ изменений пролиферативного потенциала и миграционной активности клеток полученных персонализированных культур глиом человека под действием VV-GMCSF-Lact показал, что VV-GMCSF-Lact эффективно тормозит пролиферацию клеток всех исследуемых культур глиом, а также отрицательно влияет на их способность к миграции. Изучение апоптотических процессов в клетках глиом человека под воздействием онколитического вируса VV-GMCSF-Lact показало, что в клетках исследованных персонализированных культур под действием вируса реализуется как некротический, так и апоптотический путь клеточной гибели. Гибель клеток иммортализованных линий глиобластомы происходит преимущественно по пути некроза. Проведено высокоэффективное секвенирование (Illumina 1500) РНК иммортализованных и персонализованных культур клеток опухолей головного мозга человека как в условиях роста адгерентных культур, так и в условиях образования нейросфер. Проведен биоинформатический анализ NGS-данных, который позволил провести детальную характеризацию транскриптомов полученных культур клеток глиом: - выявить индикаторные транскрипты, уровень которых существенно различается по сравнению с большим набором транскриптомов клеток человека; - выявить диагностические транскрипты глиобластом, уровень которых повышен или понижен по сравнению с культурами клеток - ближайшими немалигнизированными транскриптомными гомологами; - определить SNP, которые ранее не ассоциировали с глиомами; - описать изменения вариантов альтернативного сплайсинга пре-мРНК/днРНК по сравнению с транскриптами немалигнизированных клеток мозга; - выявить и каталогизировать хромосомные транслокации, характерные для исследуемых культур опухолей. Мета-анализ данных проекта The Cancer Genome Atlas (TCGA), позволил составить набор транскриптов, уровень которых в препаратах опухолей головного мозга человека может быть использован в качестве диагностического критерия классификации опухолей на глиобластомы и глиомы низкой степени злокачественности (Low-Grade Glioma); выявить ряд транскриптов, уровень которых положительно или отрицательно коррелирует с общей выживаемостью пациентов. Таким образом, задачи первого этапе проекта выполнены в полном объеме: - создана коллекция первичных и персонализированных культур клеток глиом человека, в том числе содержащих нейросферы; - полученные культуры глиом охарактеризованы по содержанию маркеров стволовых опухолевых клеток (СОК) и рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR) и фактора роста тромбоцитов (PDGFRA). - проведена оценка влияния онколитического вируса VV-GMCSF-Lact на жизнеспособность, пролиферацию и миграционную активность клеток иммортализованных и полученных персонализированных культур глиом; - проведено изучение апоптотических процессов в клетках глиом человека под воздействием онколитического вируса VV-GMCSF-Lact; - проведено детальное исследование транскриптомов полученных в проекте персонализованных культур глиом человека. - выявлены потенциальные диагностические транскрипты для определения глиом и дифференциальной диагностики глиом. В том числе: по уровням наборов транскриптов; по однонуклеотидным полиморфизмам; изменениям в вариантах сплайсинга, хромосомным транслокациям. - разработаны системы ОТ-ПЦР-анализа уровней мРНК и регуляторных днРНК глиом, которые могут быть использованы для исследования действия онколитичекого вируса VV-GMCSF-Lact на следующих этапах проекта. - полученные данные NGS-анализа могут быть использованы для выявления ключевых факторов про-нейрально-мезенхимального перехода злокачественных опухолей головного мозга.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Лечение глиобластомы на сегодняшний день основано на комбинировании максимальной хирургической резекции, радио- и химиотерапии. Удаление опухоли позволяет снизить масс-эффект, а также получить ткань для последующего гистологического анализа и молекулярной характеристики [1]. Однако даже при максимальной хирургической резекции возникают рецидивы, поскольку клетки глиом способны мигрировать в отдаленные отделы мозга [2, 3]. Стандартным адъювантным химиопрепаратом для терапии глиобластомы является темозоломид [4]. Используют и другой химиотерапевтический способ лечения глиобластомы – PCV-режим. PCV -это комбинация алкилирующих агентов прокарбазина (procarbazine) и ломустина (CCNU) и ингибитора микротрубочек винкристина (vincristine) [5]. В результате выполнения второго этапа проекта проведены следующие работы и получены результаты: 1. Проведена оценка чувствительности к действию химиотерапевтических агентов (темозоламид, ломустин, прокарбазин и винкристин) клеток иммортализованных линий глиобластомы U87 MG и U343 MG и персонализированных культур BR2.20 и BR5.21. Показано, что исследуемые культуры обладают различной чувствительностью к действию химиопрепаратов. Самыми чувствительными к действию ломустина, винкристина и темозоломида являются клетки линии U343 MG. Наиболее устойчивы к темозоломиду клетки линии U87 MG, к винкристину и ломустину – клетки культуры BR5.21. Клетки всех исследованных культур устойчивы к действию прокарбазина. 2. Проведен анализ действия VV-GMCSF-Lact в комбинации с темозоламидом в отношении клеток иммортализованных линий U87 MG и U343 MG и персонализированных культур BR2.20 и BR5.21, обладающих различной чувствительностью к VV-GMCSF-Lact. Чувствительность клеток исследуемых культур к вирусу убывает в ряду BR2.20>U 343 MG>U87 MG>BR5.21. 2.1 Показано, что цитотоксическая активность комбинации «VV-GMCSF-Lact –темозоломид» в отношении клеток культуры BR5.21, наиболее устойчивой к VV-GMCSF-Lact, выше онкотоксической активности вируса в режиме монотерапии. Клетки остальных исследуемых культур демонстрируют устойчивость к комбинации «VV-GMCSF-Lact – темозоломид» при добавлении темозоломида через 24 часа после инфекции клеток вирусом. При добавлении темозоломида через 60 часов наблюдается синергический, либо аддитивный эффект используемых препаратов для всех культур, кроме U87 MG. На основании полученных данных можно сделать вывод, что VV-GMCSF-Lact способен ингибировать действие темозоламида. 2.2 При оценке противоопухолевой эффективности комбинации «темозоломид - VV-GMCSF-Lact», при добавлении вируса через 24 часа инкубации клеток с темозоломидом показано, что применение препаратов по данной схеме обеспечивает их синергический либо аддитивный эффект для большинства исследуемых культур. Однако в отношении клеток наиболее чувствительной к VV-GMCSF-Lact культуры BR2.20 использование комбинации «темозоломид-VV-GMCSF-Lact» приводит к антагонистическому действию препаратов. На основании полученных данных предложена схема комбинированной терапии: введение темозоломида в терапевтическую схему должно происходить не ранее 8-9 суток после обработки резекционного поля VV-GMCSF-Lact, что позволит минимизировать риск ингибирования действия темозоломида вирусным препаратом. 3. Для выявления генетических особенностей, биологических процессов, а также фундаментальных характеристик клеток опухолей головного мозга человека при терапии VV-GMCSF-Lact проведен полнотранскриптомный анализ РНК клеток иммортализованных и персонализированных культур опухолей головного мозга до и после инкубации с вирусом. Временные интервалы инкубации опухолевых клеток с онколитическим вирусом (12 и 24 часа) и множественность вирусной инфекции (1 БОЕ на клетку) определены на основании литературных данных и данных предварительных экспериментов. Получены массивы экспериментальных NGS-данных, позволяющие описать изменения экспрессии генов в культурах клеток опухолей головного мозга человека в условиях инфекции VV-GMCSF-Lact. Создана уникальная, аннотированная база референсных последовательностей генома человека (hg38) со вставкой генома вируса VV-GMCSF-Lact, которая позволяет проводить биоинформатический анализ уровней РНК клеток человека и, отдельно, уровней РНК, кодируемых геномом вируса, в инфицированных клетках. Собраны массивы данных, содержащие информацию о вкладе индивидуальных транскрипов (в том числе и вирусных) в общем наборе РНК клеток 4х персонализированных и 2х иммортализованных культур опухолей головного мозга и контрольных немалигнизированных клеток мозга на разных стадиях инфекции VV-GMCSF-Lact. Создано детальное описание изменения уровней вирусных транскриптов в процессе инфекции, определены вирусные гены, активация которых связана с онколитическим действием VV-GMCSF-Lact на клетки злокачественных опухолей головного мозга человека. Создано детальное описание изменения уровней клеточных транскриптов, выявлены и описаны группы генов, активация или подавление которых происходит в процессе развития инфекции. В целом результаты биоинформатического анализа данных полнотранскриптомного исследования позволили создать детальное описание процессов ответа глиом/глиобластом на инфекцию VV-GMCSF-Lact и выявить отдельные факторы и их группы, определяющие чувствительность клеток к онколитическому действию вируса. 4. С использование клеток персонализированных культур глиобластомы человека, полученных на первом этапе проекта, разработаны две ксенографтные опухолевые модели глиобластомы, которые будут использованы для реализации задач дальнейших этапов проекта. Модели ксенографтов получены при трансплантации мышам линии SCID клеток BR3.20, культивируемых в стандартных условиях, и клеток GK2.22ns, культивируемых в условиях формирования нейросфер. Клетки культур BR1.20ns, BR2.20ns, BR3.20ns и BR5.21ns оказались не способны инициировать формирование опухолей у иммунодефецитных животных. Возможно, использовании для разработки опухолевой модели мышей линии NSG, у которых отсутствует NK-клеточный ответ, позволит получить более широкую панель ксенографтов, однако линия NSG в данное время не доступна в SPF-виварии ИЦиГ СО РАН. В рамках второго этапа проекта опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах, из них 2 - в журналах первого квартиля (Q1) Результаты проекта представлены на Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 31 октября – 1 ноября 2022, г. Москва. Симпозиум: «Лечение онкозаболеваний человека с помощью природных и рекомбинантных вирусов». По результатам проекта опубликована статья в издании «Наука в в Сибири» https://www.sbras.info/articles/nauka-dlya-obschestva/dannye-ob-izmenenii-transkriptoma-pomogut-razrabotat-metody-dlya и Интерфакс Россия https://www.interfax-russia.ru/view/virus-protiv-raka Все работы, запланированные на второй этап проекта, выполнены в полном объеме. Полученные результаты соответствуют задачам проекта на 2022 г. Список использованных источников 1. Omuro A, DeAngelis LM. Glioblastoma and other malignant gliomas: a clinical review. JAMA, 2013, Nov 6;310(17):1842-50. doi: 10.1001/jama.2013.280319. 2. A. Armento, J. Ehlers, S. Schötterl, U. Naumann, S. De Vleeschouwer. Molecular Mechanisms of Glioma Cell Motility. In: Glioblastoma [Internet]. Brisbane (AU): Codon Publications; 2017 Sep 27. Chapter 5. doi: 10.15586/codon.glioblastoma.2017.ch5 3. C. J Liu, G. A Shamsan, T. Akkin, D. J Odde. Glioma Cell Migration Dynamics in Brain Tissue Assessed by Multimodal Optical Imaging. Biophys J., 2019, Oct 1;117(7):1179-1188. doi: 10.1016/j.bpj.2019.08.010. 4. R. Stupp, W. P Mason, M. J van den Bent. Radiotherapy plus Concomitant and Adjuvant Temozolomide for Glioblastoma). N Engl J Med. 2005 Mar 10;352(10):987-96. doi: 10.1056/NEJMoa043330. 5. Solimando DA Jr, Waddell JA. Procarbazine, Lomustine, and Vincristine (PCV) Regimen for Central Nervous System Tumors, Hosp Pharm. 2017 Feb;52(2):98-104. doi: 10.1310/hpj5202-98.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Виротерапия является на сегодняшний день одной из наиболее перспективных технологий терапии злокачественных новообразований. Однако, несмотря на явные преимущества данного подхода, существует и ряд ограничений, таких как способность опухоли избегать иммунного ответа даже при его дополнительной индукции за счет распространения вирусных частиц; вязкость внеклеточного матрикса, влияющая на распространение вирусных частиц от клетки к клетке; наработка вируснейтрализующих антител, снижающих эффективность виротерапии при повторных инъекциях вируса и др. Минимизировать указанные ограничения можно при использовании вирусных препаратов в комбинации с другими терапевтическими агентами, в частности с химиотерапевтическими препаратами. Применение онколитических вирусов в комбинации с химиопрепаратами может усилить противоопухолевый эффект за счет воздействия компонентов на различные сигнальные пути и системы клетки, например, систему репарации ДНК, которая является ключевым фактором формирования резистентности опухолевых клеток к химиотерапии [Kanai et.al., 2012]. При этом, одним из наиболее информативных инструментов является полнотранскриптомный анализ изменений экспрессии генов в клетках, опухолях и тканях который, в сочетании с современными биоинформатическими подходами, позволяет описать не только изменения уровней отдельных РНК, но и выявить групповые характеристики, включая ключевые опухолевые, тканевые и клеточные процессы. Таким образом, для разработки наиболее эффективных схем терапии необходимо всестороннее изучение противоопухолевого действия исследуемого препарата как в режиме монотерапии, так и в комбинации с другими противоопухолевыми агентами, а также исследование задействованных в модуляции ответа на терапию сигнальных путей и отдельных молекул с целью формирования списка дополнительных мишеней, воздействие на которые позволит усилить противоопухолевый эффект используемой комбинации. В результате выполнения третьего этапа проекта (2023г.) проведены следующие работы и получены результаты: 1. Проведена оценка противоопухолевой эффективности рекомбинантного вируса осповакцины VV-GMCSF-Lact в отношении опухолей, полученных при подкожной трансплантации иммунодефицитным мышам клеток иммортализованных линий глиобластомы и персонализированных культур глиом человека с высоким туморогенным потенциалом. Показано, что VV-GMCSF-Lact обладает противоопухолевой эффективностью в отношении глиобластомы человека in vivo. При внутриопухолевом введении вируса было полностью элиминировано 30% опухолей U343 MG и 10% опухолей MG4ns (персонализированная культура глиобластомы человека) https://doi.org/10.3390/life11101084. 2. С помощью полнотранскриптомного анализа РНК ксенографтов глиобластом человека, трансплантированных мышам линии SCID, установлено, что инфекция онколитического вируса VV-GMCSF-Lact вызывает следующие изменения: - В трансплантированных клетках глиом человека происходит активация транскрипционных факторов семейств IRF, NFY, ESR и подавление активности транскрипционного фактора SOX2, что приводит к активации экспрессии генов: интерферонового ответа; ответа на гипоксию; фокальной адгезии; мембран эндоцитарного и фагоцитарного путей, а также к подавлению процессов образования веретена деления и клеточного цикла. - В строме трансплантированных опухолей происходит активация экспрессии генов, контролируемых транскрипционными факторами семейств IRF, NFKB, STAT, и подавление экспрессии генов, находящихся под контролем факторов SUZ12, MYOD1, CEBPA и MEF2C. При этом происходит активация генов интерферонового ответа, подавление процессов ответа на гипоксию, подавление гликолиза, а также процессов эпителиально-мезенхимального перехода. Транскриптом вируса VV-GMCSF-Lact в инфицированных опухолях представлен РНК-продуктами генов EL3, BR15R, BR8 и др, которые кодируют модуляторы иммунного ответа, а также РНК рекомбинантного гена CSN3, кодирующего проапоптотический пептид, лактаптин. 3. Обобщение результатов проекта позволило сформулировать кумулятивную схему модуляции активности транскрипционных факторов и биологических процессов, а также связи этих процессов с чувствительностью клеток к цитотоксическому действию VV-GMCSF-Lact и, отдельно, с процессами в метастазах глиобластом. Выявлены отдельные транскрипты, уровень которых меняется при инфекции VV-GMCSF-Lact, собраны и проанализированы групповые характеристики наборов транскриптов, такие как транскрипционные факторы, сигнальные каскады, биологические процессы и др. для всего массива данных. Полученные данные указывают на то, что активность процессов транспорта, в том числе транспорта с участием эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи снижает цитотоксическое действие VV-GMCSF-Lact. При этом, активность ядерного процессинга Pol II-транскриптов, сплайсинга мРНК повышает чувствительность клеток к цитотоксическому действию вируса. Важно, что экспрессия генов ядерного процессинга Pol II-транскриптов и сплайсинга мРНК повышена в клетках метастазов опухолей человека, трансплантированных мышам SCID. https://www.mdpi.com/2073-4409/12/22/2616 4. Проведено исследование противоопухолевой эффективности онколитического вируса VV-GMCSF-Lact в режиме монотерапии и в комбинации с темозоломидом на модели ксенографтов глиобластомы человека. Показано, что VV-GMCSF-Lact, как в режиме монотерапии, так и в комбинации с ТМЗ, обладает высокой противоопухолевой эффективностью в отношении глиобластомы. Достоверных отличий противоопухолевой эффективности VV-GMCSF-Lact в режиме монотерапии и различных комбинаций вирусного препарата с ТМЗ не выявлено. Индексы ТРО для групп «VV-GMCSF-Lact», «VV-GMCSF-Lact+ТМЗ» и «ТМЗ+VV-GMCSF-Lact» составили 93%, 93% и 96%, соответственно. Однако, согласно данным гистологического анализа опухолей экспериментальных животных показано, что применения комбинации препаратов («VV-GMCSF-Lact+ТМЗ» и «ТМЗ+VV-GMCSF-Lact») приводит к более значительной деструкции опухолевой ткани. Таким образом, показано, что VV-GMCSF-Lact в комбинации с темозоломидом эффективен в отношении глиобластомы человека in vivo. Предложена схема терапии, которая включает обработку резекционного поля онколитическим вирусом и последующий курсовой прием темозоломида не ранее, чем через 7 дней после применения VV-GMCSF-Lact. Результаты проекта были представлены на следующих конференциях: 1. IV Всероссийская научно-практическая конференция «Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе», Иркутск, октябрь 2023, Кулигина Е.В. «Фармакологическая эффективность онколитического вируса VV-GMCSF-Lact в отношении опухолевых моделей глиом in vitro и in vivo», Устный доклад. 2. VIII Всероссийская Конференция по молекулярной онкологии с международным участием, 20-22 декабря 2023, г. Москва, Васильева Н.С. "Онколитический вирус VV-GMCSF-Lact как средство терапии глиом человека", устный доклад 3. VIII Всероссийская Конференция по молекулярной онкологии с международным участием, 20-22 декабря 2023, г. Москва, Агеенко А.Б. "Эффективность терапии глиобластомы человека комбинацией онколитического вируса VV-GMCSF-Lact и темозоломида", постерный доклад Все работы, запланированные на третий этап проекта, выполнены в полном объеме. Полученные результаты соответствуют задачам проекта на 2023 г. Список использованных источников 1. Kanai R. и др. Oncolytic Virus-Mediated Manipulation of DNA Damage Responses: Synergy With Chemotherapy in Killing Glioblastoma Stem Cells // JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 2012. V. 104. № 1. P. 42–55.