Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Теоретическое исследование кинетики образования льда на поверхностях с различными особенностями показало, что время зарождения слоя льда и в толще воды, и на связывающей лёд ровной поверхности обращается в бесконечность, когда температура воды (как то имеет место в среде обитания арктических рыб) не намного ниже 0°C. Это происходит из-за потери межмолекулярных контактов на периферии слоя льда. Однако этой потери можно избежать, если связывающая лёд поверхность имеет не "гладкую", а гофрированную или рифленую форму, так как тогда контакт между молекулами нарастающего слоя льда падает во много раз, и потому соответствующая потеря энергии контактов на периферии этого слоя льда невелика. Анализ структуры «нормального» гексагонального льда Ih показал, что его слои прилипают друг к другу именно таким образом, ибо молекулы H2O имеют водородные связи либо с нижней, либо с верхней базисной плоскостью, но не в пределах одного и того же слоя. По результатам теоретического исследования кинетики образования льда написано 2 работы. Экспериментально и теоретически (методом молекулярной динамики) проверено связывание трех белков-антифризов (AFP) с поверхностью льда. Выполненные исследования позволят количественно оценивать эффективность белков-антифризов. Проведены эксперименты по замерзанию и плавлению льда в присутствии AFP белков. Достоверно определено, что ни один из белков не понижает температуру замерзания воды, то есть не работает как низкомолекулярные антифризы. Проведены предварительные эксперименты по определению криопротекторных свойств белков при их экспрессии в клетках. Клетки, экспрессирующие белки sfAFP-GFP, rmAFP-GFP, fbAFP-GFP, выживали при их многократном охлаждении до -15 оС и последующем нагревании до +25 оС. Сконструирована и протестирована установка, позволяющая с точностью до 0.05 оС определять температуру замерзания раствора, температуру сосуществования льда и воды и температуру плавления льда. Проведены эксперименты по влиянию разных веществ на возникновение зародышей льда. Показано что из протестированных низкомолекулярных веществ только присутствие меди повышает температуру зарождения льда в среднем на один градус. Протестировано влияние бактерий E.coli и P.syringae на процесс замерзания воды и плавления льда. Клетки P.syringae обладают свойством запускать процесс замерзания льда при околонулевых температурах. Определены концентрации P.syringae, влияющие на этот процесс. Впервые обнаружено влияние клеток P.syringae на температуру сосуществования льда и воды. Стоит подчеркнуть, что это удалось сделать благодаря точности собранной нами установки. По полученным экспериментальным данным написано три работы.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Проанализированы и классифицированы наблюдаемые в биологических системах (как в норме, так и при патологиях) фазовые переходы. Из внутримолекулярных фазовых переходов наиболее хорошо изучены процессы самоорганизации («сворачивания») молекулы белка (как в «правильную», нативную структуру, так и в «неправильные», что может быть связано с патологиями). Наиболее простой случай межмолекулярного фазового перехода - фазовый переход при индуцированном сворачивании, например, молекулы «нативно-развёрнутого» белка при стабилизирующем взаимодействии с молекулой лиганда. Если стабильность приобретается при большем количестве молекул в комплексе - наблюдаются либо олигомеры, либо ещё более крупные агрегаты в различных вариантах: «одномерные» - вроде различных фибрилл, в том числе амилоидов (часто – патогенных); «двумерные» - вроде мембран или биопленок (порой также патогенных), «трёхмерные» - кристаллы, тела включения, гели, тромбы и т.п. Агрегаты могут быть как аморфными (где молекулы уложены по-разному), так и иметь более или менее упорядоченную структуру (вроде амилоидных фибрилл, кристаллов (особо интересен для нас в данной работе лёд)). Кроме чисто физических процессов, все перечисленные варианты могут сопровождаться химическими реакциями вроде ковалентной модификации участвующих молекул (например, при образовании тромбов, бляшек, хрящей и т.д.). См. [1, 2] и цитируемую там литературу. Предложен универсальный подход, позволяющий оценивать константы связывания молекул [3]. Благодаря высокой скорости и универсальности, он может быть применён к различным фазовым переходам, - как внутримолекулярным, так и межмолекулярным (взаимодействию белков с лигандами, агрегации и т. п.). [1] Finkelstein A.V., Bogatyreva N.S., Ivankov D.N., Garbuzynskiy S.O. Protein Folding Problem: Enigma, Paradox, Solution. Biophysical Reviews 2022. doi: 10.1007/s12551-022-01000-1. [2] Katina N., Mikhaylina A., Ilina N., Eliseeva I., Balobanov V. Near-Wall Aggregation of Amyloidogenic Aβ 1- 40 Peptide: Direct Observation by the FRET. Molecules. 2021 Dec; 26(24): 7590. Published online 2021 Dec 15. doi: 10.3390/molecules26247590 [3] Garbuzynskiy S.O., Finkelstein A.V. Calculation of Crystal-Solution Dissociation Constants. Biomolecules, 2022, том 12, №2, с.147. doi: 10.3390/biom12020147 Исследована способность ряда нерастворимых низкомолекулярных веществ, поверхностей, а также некоторых белков на поверхности бактерий влиять на температуру замерзания воды и температуру сосуществования льда и воды. Изучены, с точки зрения влияния на нуклеацию льда, оксиды ряда металлов (меди, никеля, олова, серебра, хрома, цинка, бария, железа, титана), а также оксид кремния, слюда, кристаллический кремний, несколько видов пластика и стекла. Получены температуры замерзания образцов воды с разными добавками. В результате обнаружены оксиды, которые повышают температуру замерзания воды, являясь нуклеаторами льда. Подобные эксперименты проведены с клетками P. syringae (имеющими на своей поверхности белки - природные нуклеаторы льда) и E. coli. [1] Мельник Б.С., Финкельштейн А.В. Физический Базис Функционирования Белка-Антифриза. Мол. Биол., 2022, 56, № 2, 343-352. [2] Finkelstein A.V., Garbuzynskiy S.O., Melnik B.S. How Can Ice Emerge at 0 °C? Biomolecules, 2022, 12, № 7, 981. Проведено экспериментальное исследование влияния белков-антифризов из Choristoneura fumiferana (сfAFP), Rhagium mordax (rmAFP), Flavobacteriaceae (fbAFP) и их фюжн-вариантов на особенности процесса замерзания воды и плавления льда. Проведены эксперименты in vivo, in vitro и in silico. В результате экспериментов с эукариотическими и прокариотическими клетками показано, что при низких температурах для белков антифризов есть «мишени» для их связывания как внутри, так и снаружи клетки - на поверхности клеточных мембран. Изучение влияния белков-антифризов на температуру замерзания воды и температуру сосуществования льда и воды в присутствии различных веществ (оксидов металлов и бактериальных стенок) показало, что добавление белков- антифризов сfAFP, rmAFP, fbAFP понижает температуру замерзания воды, и этот эффект связан с тем, что белки-антифризы могут связываться с поверхностями, на которых происходит возникновение зародышей льда. Таким образом, на нескольких белках и с несколькими вариантами нуклеаторов показано, что белки антифризы блокируют «работу» нуклеаторов льда. При исследовании белка rmAFP обнаружено, что он также влияет и на температуру сосуществования льда и воды, что может быть связано с особенностями его взаимодействия с поверхностью льда. Компьютерные эксперименты, проведенные с использованием метода молекулярной динамики, показали, что особенности взаимодействия белков-антифризов и льда можно анализировать теоретически, и результаты согласуются с экспериментами in vitro. Подбор параметров моделирования и сравнение результатов моделирования с экспериментальными данными позволит в дальнейшем предсказывать свойства белков антифризов и, возможно, проектировать их новые варианты. [1] B.S. Melnik, A.V. Finkelstein. Physical Basis of Functioning of Antifreeze Protein Molecular Biology (Moscow), 2022, Vol 56 №2 p. 297-305; DOI 10.1134/S002689332202008X [2] A. A. Deeva, K. A. Glukhova, L. S. Isoyan, Y. D. Okulova, V. N. Uversky, B. S. Melnik. Design and Analysis of a Mutant form of the Ice Binding Protein from Choristoneura fumiferana. The Protein Journal 2022, https://doi.org/10.1007/s10930-022-10049-6 [3] V.R. Veselova, M.A. Majorina, B.S. Melnik. An experimental technique for accurate measurement of the freezing point of solutions and ice melting in the presence of biological objects on the examples of P. syringae and E. coli. Opera Medica et Physiologica. 2022. Vol. 9 (1), 19-30. [4] Maria A. Majorina, Victoria R. Veselova, Bogdan S. Melnik. The influence of Pseudomonas syringae on water freezing and ice melting. PLoS ONE 17(5): e0265683 (2022). Экспериментально исследованы особенности адсорбции белков и пептидов на границе раздела фаз. Исследования выполнены на примере амилоидогенных пептидов, однако выявленные эффекты применимы для различных пептидов и белков. Показано, что Аβ пептид 1-40 адсорбируется на поверхностях, что приводит к усиленной агрегации этих пептидов. Это означает, что граница раздела фаз может быть местом, где появляются зародыши амилоидов. Дополнительные исследования показали, что амилоидогенные белки и их концентрация на поверхностях не влияют на процесс замерзания воды. [1] N. Katina, A. Mikhaylina, N. Ilina, I. Eliseeva, V. Balobanov. Near-Wall Aggregation of Amyloidogenic Aβ 1- 40 Peptide: Direct Observation by the FRET. Molecules. 2021 Dec; 26(24): 7590. Published online 2021 Dec 15. doi: 10.3390/molecules26247590. Проведены эксперименты, позволяющие проанализировать влияние белков антифризов cfAFP, rmAFP, fbAFP на выживаемость и скорость роста прокариотических клеток E. coli и P. syringae, то есть, проверены возможные крио- протекторные свойства этих белков. Полученные результаты, подтверждают наше предположение, что белки cfAFP, rmAFP, fbAFP не способны защитить клетку в процессе замерзания. Для популяризации направления наших исследований подготовлена и опубликована научно-популярная статья о белках-антифризах в газете «КоммерсантЪ» в приложении «Коммерсантъ Наука» 15.09.2022 №170. https://www.kommersant.ru/doc/5558573.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
На данном этапе проекта исследованы белки-антифризы и порошки низкомолекулярных веществ, являющиеся нуклеаторами льда. Обнаружена мощная нуклеирующая лед активность для нескольких веществ, для которых это не было описано ранее в литературе. Исследованы криопротекторные свойства белков-антифризов и нуклеаторов льда. Также исследована локализация белков-антифризов в эукариотических клетках. Показано, что белки-антифризы блокируют действие биологических и небиологических нуклеаторов льда. Белки-антифризы сами по себе, ни снаружи (во внешней среде), ни внутри бактериальной клетки, не способствуют выживанию этих клеток при замораживании. Однако такую устойчивость показали клетки, в которых белки-антифризы были экспонированы на внешней клеточной мембране. С помощью различных методов микроскопии исследованы бактериальные клетки E. coli, P. syringae, а также эукариотические SKBR-3. В результате исследований показано, что в эукариотических клетках белок-антифриз точечно локализуется при понижении температуры. Использование красителей, позволяющих идентифицировать основные клеточные структуры, позволило выяснить, что локализация белков-антифризов происходит вне клеточного ядра, но при этом белок антифриз не взаимодействует ни с клеточными филаментами, ни с митохондриями, ни с лизосомами. Методом молекулярной динамики с использованием пакета GROMACS2020.4 в силовом поле CHARMM22 было выполнено моделирование процесса связывания белков-антифризов сfAFP, rmAFP, fbAFP с поверхностью льда. Результаты моделирования позволили провести анализ множества структурных параметров. Оказалось, что для изученных белков-антифризов характерна низкая подвижность остатков треонина, формирующих поверхность связывания. Все изученные белки демонстрировали связывание со льдом, при этом рост льда останавливался. Треонины, расположенные вне поверхности связывания со льдом, бОльшую часть времени имеют водородную связь только с одной молекулой воды, в то время как треонины на связывающей лёд поверхности белка чаще формируют водородную связь с двумя молекулами воды. Кроме того, мы предприняли специальное исследование, чтобы выяснить особенности работы и возможностей применения программы AlphaFold для дизайна мутантных белков. Оказалось, что AlphaFold делает ошибки при проектировании мутантных форм белка c небольшим количеством аминокислотных замен и при проектировании циркулярных пермутантов. Исследовано влияние различных поверхностей, необходимых для появления зародышей льда в переохлажденной воде. Для этого были выбраны различные нерастворимые вещества и исследовано их влияние на температуру замерзания воды (Tf), температуру сосуществования льда и воды (Tiw) и температуру плавления льда (Tm). В результате исследований нами обнаружена мощная нуклеирующая активность нескольких веществ, которые не описаны в литературе как мощные нуклеаторы льда. Это оксид меди, оксид цинка, оксид олова и хлорид серебра. Кроме того, нами обнаружен новый эффект, который ещё предстоит объяснить: влияние некоторых оксидов металлов на температуру сосуществования льда и воды Tiw. Исследовано влияние белков-антифризов на температуру замерзания раствора, температуру сосуществования льда и воды и температуру плавления льда (Tf, Tiw, Tm). Оказалось, что добавление белков-антифризов в воду или в буферный раствор не оказывает влияния на эти температуры, но если в пробирке присутствуют нуклеаторы льда, то белки-антифризы блокируют их влияние и, соответственно, понижают температуру замерзания воды. Проведенные эксперименты подтвердили нашу гипотезу о том, что белки-антифризы блокируют влияние биологических и небиологических нуклеаторов льда. Исследован процесс роста клеток после замораживания и влияние на этот процесс белков-антифризов и нуклеаторов льда. Клетки, трансформированные плазмидами сfAFP, rmAFP, fbAFP, GFP, а также клетки в присутствии в среде белков-антифризов и нуклеаторов льда подвергали циклам замораживания-нагрева, после чего часть клеток высевали на жидкой среде. В результате этих исследований можно сделать следующий вывод: белки-антифризы сами по себе - ни во внешней среде, ни внутри бактериальной клетки - не способствуют выживанию клеток при замораживании. Однако такую устойчивость показали клетки, в которых белки-антифризы были экспонированы на внешней клеточной мембране. Кроме того, обнаружено положительное влияние нуклеаторов льда на процент выживаемости клеток.