Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Для выявления молекулярных механизмов взаиморегуляции метаболизма NAD и поддержания плюрипотентности и контроля дифференцировки была использована экспериментальная модель на основе эмбриональных стволовых клеток мыши (мЭСК) линии E14. Плюрипотентное состояние мЭСК E14 поддерживалось при культивировании клеток в присутствии сыворотки и LIF; дифференцировка с целью получения клеток, лишённых плюрипотентных свойств, запускалась заменой фактора LIF на ретиноевую кислоту (RA). Используя ЯМР-спектроскопию, мы провели количественный анализ NAD и его основных метаболитов в мЭСК E14 при поддержании плюрипотентного состояния, а также после запуска дифференцировки клеток. Через 24 часа после добавления к плюрипотентным клеткам нуклеозида NAR (предшественник NAD, который стимулирует деамидированный путь его биосинтеза) мы наблюдали значительное накопление в клетках динуклеотида NAAD,- уровень NAAD значительно превышал уровень NAD. Концентрация NAAD снижалась в процессе дифференцировки, и уже через 72 часа инкубации с RA добавление к клеткам NAR приводило лишь к незначительному накоплению данного динуклеотида в клетках E14. Динуклеотид NAAD, принимает участие во всех деамидированных путях синтеза NAD и является его прямым предшественником. Реакцию амидирования NAAD до NAD в клетках млекопитающих катализирует фермент NAD синтетаза (NADS). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что активность фермента NADS может быть подавлена в клетках E14 при поддержании плюрипотентного состояния, тогда как после запуска дифференцировки происходит его активация. В подтверждение данного предположения мы продемонстрировали, что в мЭСК E14, поддерживаемых в плюрипотентном состоянии, NAD синтезируется гораздо более эффективно из Nam и NR (по амидированному пути синтеза), чем из NAR (по деамидированному пути синтеза через NAAD). При помощи ПЦР в реальном времени мы охарактеризовали изменения профилей экспрессии генов, кодирующих ключевые белки биосинтеза NAD, при переходе мЭСК E14 из плюрипотентного в дифференцированное состояние. Мы установили, что через 4 дня инкубации мЭСК E14 с RA значительно снижается экспрессия генов, кодирущих фосфорибозилтрансферазы Nampt и Naprt, которые катализируют синтез мононуклеотидов NMN и NAMN (первый этап синтеза NAD) из соответствующих оснований Nam и NA. Также при потере клетками плюрипотентных свойств наблюдалось подавление экспрессии гена Nmnat2, кодирующего фермент, отвечающий за синтез NAD из NMN в цитозоле, тогда как экспрессия функционального аналога (гена Nmnat1), отвечающего за синтез NAD в ядре, а также гена, кодирующего Nads, оставались неизменными. Напротив, экспрессия гена, кодирующего белок Nmnat3, который отвечает за синтез NAD в митохондрии, была вдвое выше в дифференцированных клетках по сравнению с плюрипотентными. Также примерно двукратное увеличение экспрессии наблюдалось для гена, кодирующего митохондриальный переносчик Slc25a51, который, как было недавно установлено, отвечает за импорт NAD из цитозоля в митохондриальный матрикс. Также при помощи иммуноблоттинга мы установили, что уровень ацетилирования альфа-тубулина по лизину 40 – мишени NAD-зависимой деацетилазы Sirt2 – в дифференцированных клетках существенно превышает аналогичный в клетках E14, находящихся в плюрипотентном состоянии. Возможно, это является следствием того, что в процессе дифференцировки понижается уровень NAD в цитозоле, что, в свою очередь, приводит к подавлению активности белка Sirt2. Таким образом, подавление синтеза NAD в цитозоле и активацию процессов, ведущих к накоплению данного динуклеотида в митохондрии, можно рассматривать в качестве потенциального регуляторного механизма при переходе мЭСК E14 из плюрипотентного состояния в дифференцированное. Полученные в 2021 году результаты указывают на то, что регуляция уровня NAD в разных клеточных компартментах, а также переключение между деамидированными и амидированными путями синтеза данного динуклеотида могут играть важную роль при поддержании мЭСК E14 в плюрипотентном состоянии и в процессе их дифференцировки.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Для выявления молекулярных механизмов взаиморегуляции метаболизма NAD и поддержания плюрипотентности и контроля дифференцировки в 2022 году была использована экспериментальная модель на основе эмбриональных стволовых клеток мыши (мЭСК) линии E14, позволяющая поддерживать гомогенную культуру наивных клеток (ЭСК), осуществлять контролируемый переход из наивного через промежуточное (ЭпиПК) в праймированное (ЭпиСК) состояние, а также проводить дифференцировку ЭпиСК в мезодермальном и эндодермальном направлениях. Используя ЯМР-спектроскопию, мы показали, что концентрация NAD в клетках Е14, находящихся в наивном состоянии, составляет порядка 4,6 нмоль/мг белка. Уровень NAD остается неизменным после перевода клеток в промежуточное состояние и увеличивается на 40% в праймированных клетках. После дифференцировки праймированных клеток Е14 в мезодермальном и эндодермальном направлениях концентрация внутриклеточного NAD не меняется. Также мы продемонстрировали, что при культивировании наивных клеток E14 в присутствии рибозида никотиновой кислоты (NAR) в них наблюдается значительное накопление динуклеотида NAAD, однако концентрация NAAD существенно снижается после перехода клеток в праймированное состояние. Кроме того, установлено, что в праймированных клетках Е14 NAD синтезируется из NAR (по деамидированному пути синтеза через NAAD) более эффективно, чем в наивных клетках. Таким образом, активность фермента Nads может быть подавлена в наивных клетках E14, тогда как после их перехода в праймированное состояние Nads активируется. При помощи иммуноблоттинга мы установили, что переход клеток E14 из наивного в промежуточное и праймированное состояния стимулирует Sirt2-зависимое деацетилирование альфа-тубулина по лизину 40 (К40). Возможно, это является следствием понижения уровня NAD в цитозоле, что, в свою очередь, приводит к подавлению активности белка Sirt2, который использует NAD в качестве субстрата. Также мы показали, что уровень ацетилирования альфа-тубулина (K40) в клетках Е14, находящихся в праймированном состоянии, не меняется после их дифференцировки в мезодермальном или эндодермальном направлении. При помощи qPCR мы охарактеризовали изменения профилей экспрессии генов, отвечающих за разные пути биосинтеза NAD и NAD-зависимый сигналинг при переходе мЭСК E14 из наивного в праймированное состояние, а также после их направленной дифференцировки. Мы установили, что при переходе клеток E14 из наивного в праймированное состояние экспрессия Nampt и Naprt не изменяется; увеличивается экспрессия Qprt; существенно снижается экспрессия Nrk1; на 60-70% подавляется экспрессии генов Nmnat3 и Nmnat2, тогда как экспрессия Nmnat1 не изменяется; более чем в 2 раза повышается уровень экспрессии Nadsyn1; более чем в 1,5 раза увеличивается экспрессия Slc25a51; значительно снижается экспрессия Nnmt и Nadk. Кроме того, в праймированных клетках (по сравнению с наивными) наблюдается выраженное снижение экспрессии большинства генов, кодирующих ключевые белки NAD-зависимого сигналинга: Sirt1, Sirt2, Sirt3, Sirt4, Sirt6, Sirt7, Parp1 и Cd38, тогда как экспрессия Sirt3, Parp2 и Sarm1 остается неизменной. Также мы показали, что после направленной дифференцировки праймированных клеток E14 в мезодермальном направлении снижается экспрессия Nampt, Qprt, Nadsyn1 и Sirt1, тогда как экспрессия Nmnat2, Nadk, Sirt6 и Sirt7 повышается. Статистически значимых отличий в экспрессии других исследуемых генов выявлено не было. Дифференцировка в эндодермальном направлении не приводила к заметным изменениям профилей экспрессии за исключением гена Nmnat2,- его экспрессия увеличивалась на 70% по сравнению с праймированными клетками. Нами была проведена оценка возможного влияния фармакологической модуляции уровня NAD на поддержание клеток Е14 в наивном и праймированном состояниях. Мы продемонстрировали, что стимуляция биосинтеза NAD никотинамидрибозидом (нуклеозидная форма витамина B3) не влияет на экспрессию маркеров плюрипотентности в наивных и праймированных клетках Е14. Также мы показали, что в условиях критического снижения концентрации внутриклеточного NAD после подавления его синтеза из никотинамида ингибитором FK866 праймированные клетки Е14 экспрессируют маркеры Oct6 и Oct4 на контрольном уровне. В свою очередь, наивные клетки Е14 после действия FK866 продолжали экспрессировать маркеры Klf4 и Oct4, однако уровень их экспрессии понижался примерно в 2 раза по сравнению с контрольными необработанными клетками. Для оценки роли белка Nads (и деамидированного пути синтеза NAD, в целом) в регуляции плюрипотентности и дифференцировки мЭСК E14 нами была создана линия клеток E14 с нокаутом по гену Nads, а также линия клеток, стабильно экспрессирующих белок Nads на высоком уровне.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Мы провели детальный анализ экспрессии белка Nads при переходе мЭСК Е14 из одного плюрипотентного состояния в другое, а также в процессе их дифференцировки. Была создана репортерная линия клеток E14 Nads-GFP для оценки экспрессии Nads по флуоресценции GFP-сенсора, который экспрессируется с Nads в эквимолярных количествах, но отдельно от него, а не как слитый белок. К сожалению, чувствительности данной репортерной модели оказалось недостаточно, поэтому в качестве альтернативного экспериментального подхода использовали ПЦР в реальном времени (qPCR). Экспрессию Nads оценивали в наивных ЭСК, промежуточных эпибластоподобных клетках (ЭпиПК), праймированных эпибластных стволовых клетках (ЭпиСК), в клетках после дифференцировки ЭпиПК в мезодермальном направлении, а также в клетках, находящихся в переходных состояниях. Для подтверждения нахождения клеток в каждом конкретном состоянии оценивали экспрессию соответствующих маркеров: Nanog и Oct4 для плюрипотентного состояния, в целом; Klf4 для наивного состояния; Fgf5 для праймированного состояния; Hand1 и Brachyury для мезодермальной дифференцировки. Мы показали, что при переходе наивных ЭСК в ЭпиПК экспрессия Nads снижалась в 2 раза. В процессе дальнейшей дифференцировки в праймированном направлении уровень транскриптов Nads значительно повышался и в ЭпиСК превышал аналогичный в ЭпиПК более чем в 3 раза. Экспрессия Nads в мезодермальных клетках не отличалась от наблюдаемой в наивных ЭСК. Для оценки роли белка Nads (и деамидированного пути синтеза NAD, в целом) в регуляции плюрипотентности и дифференцировки мЭСК E14 ранее нами была создана линия клеток E14 с нокаутом гена Nads (E14-Nads ko), а также линия клеток, стабильно экспрессирующих белок Nads на высоком уровне (E14-Nads ki). В 2023 году при помощи ЯМР-спектроскопии мы установили, что в клетках E14-Nads ko после инкубации с NAR наблюдалось более существенное накопление NAAD, чем в Е14 wt. Напротив, в E14-Nads ki NAAD не детектировался, то есть, сверхэкспрессия Nads эффективно стимулирует амидирование NAAD до NAD. Однако, в данных условиях стимуляции биосинтеза NAD (сверхэкспрессия NAAD и добавление в среду NAR) увеличения его внутриклеточной концентрации не наблюдалось. Также мы установили, что клетки E14-Nads ko более чувствительны к подавлению синтеза NAD из никотинамида ингибитором FK866 по сравнению с клетками дикого типа (Е14 wt) и E14-Nads ki. Их обработка FK866 приводила к более существенному падению метаболической активности по сравнению с клетками, экспрессирующими Nads. Более того, мы наблюдали в 2 раза меньше живых и, соответственно, в 2 раза больше мертвых клеток нокаутных по Nads после обработки FK866 по сравнению с клетками Е14 wt и E14-Nads ki. Данный феномен может быть обусловлен активностью de novo пути синтеза NAD из триптофана в мЭСК Е14, поскольку триптофан является единственным альтернативным никотинамиду предшественником NAD в стандартных условиях культивирования клеток, и последним этапом синтеза NAD по этому пути является амидирование динуклеотида NAAD, за которое отвечает фермент Nads. Далее мы выясняли, каким образом нокаут Nads и стабильная экспрессия гибридного белка Nads повлияют на поддержание плюрипотентности мЭСК E14 и их дифференцировку. Клетки Е14 wt, E14-Nads ko и E14-Nads ki выращивали в течение 4-х дней в присутствии LIF или ретиноевой кислоты и затем проводили количественный анализ экспрессии маркеров плюрипотентности и дифференцировки при помощи qPCR. Нокаут и стабильная сверхэкспрессия Nads не приводила к изменению уровня экспрессии Nanog и Oct4 в плюрипотентных клетках и генов Foxa2, Sox17 и Gata6 в клетках Е14 после их дифференцировки. Также мы показали, что профили экспрессии маркеров плюрипотентности практически не отличаются в клетках Е14 wt и E14-Nads ko, находящихся в наивном и в праймированном состоянии. Интересно, что обработка клеток FK866 приводила к подавлению экспрессии Nanog и Oct4 в наивных, но не в праймированных мЭСК Е14. Истощение пула внутриклеточного NAD также вело к пониженной экспрессии Klf4 в наивных и Hand1 в мезодермальных клетках. Нокаут Nads вызывал значительное увеличение экспрессии Brachyury в мезодермальных клетках, причем, предобработка клеток FK866 никак не влияла на степень изменения экспрессии Brachyury. Также в рамках выполнения Проекта мы установили каким образом модуляция биосинтеза NAD влияет на эффективность окислительного фосфорилирования и гликолиза при переходе мЭСК E14 из наивного в праймированное состояние, а также после их направленной дифференцировки в мезодермальном направлении. Скорости поглощения кислорода мЭСК E14 в наивном состоянии и в клетках после их направленной дифференцировки в мезодермальном направлении практически не отличались. Тогда как, при переходе клеток из наивного в праймированное состояние эффективность окислительного фосфорилирования уменьшалась почти в 2 раза. При этом, предобработка клеток FK866 никак не влияла на клеточное дыхание в наивных и праймированных мЭСК E14. Эффективности окислительного фосфорилирования в наивных и праймированных мЭСК E14 нокаутных по Nads ничем не отличались от аналогичных в клетках дикого типа вне зависимости от обработки клеток FK866. Эффективность гликолитического пути метаболизма в мЭСК E14 оценивали по кинетике образования лактата из глюкозы при помощи количественной ЯМР-спектроскопии кондиционированной питательной среды. Мы показали, что скорости образования лактата из глюкозы в мЭСК E14, находящихся в наивном состоянии, и в клетках после их направленной дифференцировки в мезодермальном направлении сравнимы. Тогда как, при переходе клеток из наивного в праймированное состояние эффективность гликолиза увеличивается почти в 2 раза. При этом, подавление синтеза NAD ингибитором FK866 приводит к полной блокировке гликолиза в наивных мЭСК E14. В мезодермальных клетках наблюдалось 80% падение скорости образования лактата. Праймированные мЭСК E14 были наименее чувствительны к FK866,- в них гликолиз проходил лишь в 2 раза менее эффективно, чем в контрольных клетках, способных синтезировать NAD из никотинамида. Интересно, что стимуляция биосинтеза NAD никотинамидрибозидом никак не влияла на скорость поглощения кислорода и на эффективность гликолиза в плюрипотентных и дифференцированных клетках.