КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 21-14-00333

НазваниеВлияние автохтонных микробных сообществ месторождений минеральных вод на формирование бальнеологических ресурсов региона Кавказские Минеральные Воды

РуководительГаврилов Сергей Николаевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2021 г. - 2023 г. 

Конкурс№55 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые словаПодземные месторождения минеральных вод, подземная биосфера, микробные сообщества, биогеохимические циклы элементов, анаэробные микроорганизмы, некультивируемые микроорганизмы, генезис минеральных вод

Код ГРНТИ34.27.00, 62.99.29, 38.61.00


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Месторождения природных минеральных вод используются в лечебных целях с древнейших времён. На территории региона Кавказских Минеральных Вод (КМВ) известно и эксплуатируется несколько крупных подземных месторождений минеральных вод. Несмотря на почти 200-летнюю историю изучения бальнеологических ресурсов этого региона, целый ряд основополагающих вопросов, касающихся гидрогеохимии, динамики и происхождения наиболее ценных в лечебном отношении вод, остаётся неясным. Соответственно, слабо изучены и процессы естественного восполнения этих ценных минеральных ресурсов. Проблема обусловлена весьма сложным геолого-тектоническим строением территории, её гидрогеодинамическими и гидрогеохимическими условиями. В последнее время появились данные, свидетельствующие о существенной роли микроорганизмов, обитающих в подводных водоносных горизонтах, в формировании химического состава минеральных вод региона КМВ. В частности, было обнаружено достаточно высокое содержание лёгкого изотопа углерода в СО2, т.е., биогенного СО2, в водах Ессентукского месторождения. При этом, именно газовая составляющая считается одним из основных факторов, определяющих бальнеологическую ценность этих вод. В 2019-2020 годах коллективом заявителей по настоящему проекту было получено ещё одно подтверждение предположения о значительном влиянии микробных процессов на формирование вод Ессентукского месторождения. Нами был проведён молекулярно-экологический анализ минеральных вод нескольких глубинных скважин этого месторождения по заданию организации, софинансирующей проект РНФ № 17-74-30025. Анализ показал наличие в пластовых минеральных водах таксономически разнообразных сообществ прокариот, среди которых доминируют представители некультивируемых групп бактерий и архей. Особый интерес вызывают некультивируемые археи групп ANME-1 и Hadarchaeales. Микроорганизмы, относящиеся к филогенетическому кластеру ANME-1 (англ. ANaerobic MEthanotrophs – анаэробные метанотрофы), являются первыми археями, для которых был получен целый ряд доказательств, указывающих на их способность к окислению метана до углекислого газа в анаэробных условиях. В свою очередь, археи, выделенные ранее на основе анализа геномных данных в филум Hadarchaeales, предположительно обладают новыми путями метаболизма одноуглеродных соединений. Кроме того, нами в ходе предварительных исследований было выявлено несколько групп экстремофильных гетеротрофных бактерий, которые могут вносить значительный вклад в функционирование подземных микробных сообществ и таким образом, также оказывать существенное влияние на формирование состава минеральных вод. Так как большинство этих организмов является некультивируемым, невозможно оценить их экологическую функцию и геохимическую активность без проведения широких микробиологических и молекулярно-биологических исследований. Следует отметить, что естественная микрофлора природных минеральных вод и ранее привлекала внимание исследователей, но рассматривались, в основном, либо сульфатредукторы, либо потенциально патогенные для человека олиготрофные микроорганизмы, осуществляющие в естественных условиях деградацию рассеянного органического вещества. Целью нашего проекта является описание метаболического разнообразия автохтонных микробных сообществ минеральных вод нескольких месторождений региона КМВ, определение спектра геохимической активности отдельных членов этих сообществ и прогноз вклада этой активности в формирование состава и естественных запасов бальнеологических ресурсов этого региона. В ходе выполнения проекта будут решаться следующие задачи: 1. Оценка филогенетического разнообразия микробных сообществ в различных горизонтах геологического разреза региона КМВ посредством отбора и анализа проб из эксплуатационных скважин месторождений подземных минеральных вод. 2. Характеристика метаболического разнообразия исследуемых сообществ микробиологическими методами культивирования на селективных средах и молекулярными методами, включающими как метагеномное секвенирование сообществ, так и реконструкцию отдельных геномов микроорганизмов, доминирующих в этих сообществах (в чаcтности, архей группы ANME-1). 3. Получение накопительных и чистых культур микроорганизмов, осуществляющих ключевые биогеохимические процессы в формировании минеральных вод. В первую очередь, будут рассмотрены процессы циклов углерода и серы, а также процессы микробной трансформации минералов железа и других переменновалентных элементов, использование которых в качестве доноров или акцепторов электронов обеспечивает энергией разнообразные процессы метаболизма у прокариот. 4. Определение кинетических параметров биогеохимически значимых процессов, осуществляемых полученными изолятами (в частности, скорости потребления метана, образования и фиксации СО2, восстановления железа или сульфатов). Прогнозирование на основе этих данных роли микроорганизмов в формировании и поддержании состава минеральных вод. В ходе проекта будут получены не только уникальные сведения о новых, ранее не изученных микробных сообществах подземных минеральных вод, но и будет впервые дана оценка биогеохимической активности этих сообществ и их влияния на формирование бальнеологических ресурсов. Полученные данные, помимо фундаментально научного интереса в исследовании новых групп микроорганизмов и путей их метаболизма, будут иметь практическую значимость для оценки запасов и разработки оптимальных режимов эксплуатации месторождений минеральных вод региона КМВ. К работе по проекту будут привлечены не только микробиологи и молекулярные биологи, но и гидрогеологи и геохимики, занимающиеся переоценкой запасов месторождений Кавказских Минеральных Вод, а также геологи Пятигорского НИИ курортологии, разрабатывающие оптимальные режимы эксплуатации этих месторождений. Междисциплинарный подход, обеспеченный совместной работой высококвалифицированных специалистов-микробиологов, гидрогеологов и геохимиков существенно увеличивает вероятность успешного выполнения предполагаемого проекта и получения важных научных результатов.

Ожидаемые результаты
В ходе выполнения проекта будут получены сведения о филогенетическом составе микробных сообществ в различных интервалах геологического разреза региона, на которых оборудованы эксплуатационные скважины, и в местах естественной разгрузки месторождений минеральных вод региона КМВ. Следует отметить, что в настоящее время сведения о составе микробных сообществ глубинных пластов минеральных вод крайне скудны. Известны лишь единичные работы, сфокусированные, в основном, на характеристике микрофлоры, обнаруживаемой в бутилированной минеральной воде, либо в местах естественной разгрузки подземных минеральных вод на поверхности земли. Ещё меньше сведений доступно в настоящее время о метаболическом разнообразии микроорганизмов, населяющих водоносные горизонты месторождений минеральных вод. Наш проект направлен на то, чтобы восполнить этот пробел. В ходе проекта мы планируем охарактеризовать метаболическое разнообразие микробных сообществ КМВ методами функциональной метагеномики. Нами будут секвенированы метагеномы исследуемых микробных сообществ и реконструированы in silico геномы отдельных представителей этих сообществ. Биоинформатическими методами будут выявлены основные пути метаболизма С1-соединений, соединений серы и железа, предсказаны возможные пути межвидовых метаболических взаимодействий в сообществах. Полученные данные позволят выявить геохимическую активность микробных сообществ и их отдельных представителей и, соответственно, оценить её вклад в формирование состава минеральных вод исследуемого региона. Параллельно будет проводиться мониторинг состава и физико-химических свойств исследуемых подземных минеральных вод. На основании полученных гидрохимических данных и сведений о путях метаболизма представителей исследуемых микробных сообществ будут разработаны селективные среды для выделения их в накопительные и чистые культуры. В результате будут получены культуры микроорганизмов, способных к осуществлению биогеохимических процессов, ключевых для формирования минеральных вод. К таковым процессам мы относим процессы окисления метана и органического вещества до СО2, а также процессы фиксации неорганического углерода, окисления и восстановления соединений серы и железа. С учётом предварительных данных о филогенетическом разнообразии исследуемых микробных сообществ мы ожидаем получения чистых культур глубоких филогенетических групп, для которых ранее культивируемые представители известны не были. По нашим сведениям такая подробная характеристика микробных сообществ подземных месторождений минеральных вод будет дана впервые в мировой микробиологической практике. Для полученных изолятов нами будут определены кинетические параметры осуществляемых ими биогеохимически значимых процессов, в частности, скорости потребления метана, образования и фиксации СО2, восстановления соединений железа и серы. На основе полученных данных, с учётом результатов геохимического и геологического мониторинга будет дан прогноз влияния микроорганизмов на формирование и поддержание состава минеральных вод нескольких месторождений региона КМВ. Такой прогноз будет востребован при разработке и корректировке оптимальных режимов добычи бальнеологических ресурсов региона, не истощающих их запасы.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В ходе первого года проекта разработана схема отбора проб подземных минеральных вод Ессентукского месторождения (ЕММВ), позволяющая изучить широкое разнообразие подземных экосистем, в которых формируются исследуемые микробные сообщества. Согласно намеченной схеме, отобраны пробы для гидрогеохимической характеристики, микробиологических и молекулярно-биологических работ из 6-ти различных скважин ЕММВ, вскрывающих различные водоносные горизонты (верхне- и нижнемеловые, верхнеюрские) на глубинах от 200 м до 1 км и различном расстоянии от зоны питания месторождения. Из отобранных проб выделена тотальная ДНК и проанализирована методом NGS-секвенирования на платформе Illumina. По результатам секвенирования получены филогенетические профили микробных сообществ по гену 16S рРНК 6-ти различных подземных экосистем, вскрываемых добывающими скважинами ЕММВ. Кроме того, из метагеномных данных собран 151 «композитный геном» (MAG) индивидуальных представителей микробных сообществ с полнотой сборки от 70,1 до 100% и контаминацией от 0 до 4,93% (усреднённые значения 90,8% и 1,43%, соответственно). Полученные геномные последовательности аннотированы и проанализированы. В них выявлены детерминанты биохимических процессов, активность которых может повлиять на состав минеральных вод и водовмещающих пород, а именно: процессов сульфатредукции, окисления и восстановления серы и соединений железа, нитрат- и нитритредукции, окисления аммония, азотфиксации, аэробного дыхания, метаногенеза и метанотрофии, СО-трофии, потребления и образования молекулярного водорода, автотрофной фиксации СО2 и полного окисления органических веществ до CO2. Результаты филогенетического профилирования исследуемых микробных сообществ выявили, что несмотря на «гидравлическую открытость» водоносных горизонтов ЕММВ и предполагаемый активный водообмен между ними, микробиота этих горизонтов существенно различается. Такой результат подразумевает, что исследуемые микробные сообщества развиваются, главным образом, в разнообразных микронишах в толще водовмещающих пород, и не подвержены активным процессам миграции между водоносными горизонтами. Результаты нашей работы показали, что в микробных сообществах вод Ессентукского месторождения доминируют представители глубоких филогенетических линий, которые могли длительное время эволюционировать обособленно от поверхностной биосферы. Это касается в том числе и микробных сообществ пресных вод ЕММВ испытывающих наибольшее гидрогеохимическое влияние метеорных вод. Наиболее интригующим результатом изучения филогенетического разнообразия микробиоты Ессентукских минеральных вод стало выявление доминирования архей нового некультивируемого филума Hadarchaeota (до 30% разнообразия сообщества) в микробном сообществе воды типа Ессентуки №17 верхнемелового горизонта, вскрываемого скважиной 46. Неожиданным результатом явилось также обнаружение микробного сообщества, 90% разнообразия которого покрывается одним филотипом – новым представителем семейства Thermoanaerobacteraceae, имеющим согласно метагеномным данным гомоацетогенный тип метаболизма. Такое сообщество было обнаружено в водах верхнеюрского горизонта (скважина 75-бис), имеющих наибольшее содержание углекислого газа, что вероятно, является ключевым фактором, обуславливающим термодинамические преимущества гомоацетогенного восстановления CO2 по сравнению с гидрогенотрофным метаногенезом, который является более энергетически выгодным при использовании СО2 в качестве акцептора электронов в строго анаэробной, восстановительной обстановке. Анализ метагеномных данных позволил выявить две ключевые физиологические группы микроорганизмов во всех исследуемых микробных сообществах. Это, в первую очередь, микроорганизмы, метаболизирующие С1-соединения, гидрогенотрофные метаногены а также хемоавтотрофные микроорганизмы, которые могут использовать другие акцепторы электронов, помимо СО2. Наиболее значимыми из таких акцепторов могут быть соединения Fe(III), что коррелирует с широкой представленностью потенциальных железоредукторов практически во всех исследованных микробных сообществах. В некоторых из них могут также идти активные процессы нитратредукции и сульфатредукции. Важным источником энергии для исследованных микробных сообществ, по-видимому, являются соединения Fe(II), способность к окислению которых широко представлена во многих проанализированных метагеномах. Таким образом, наши данные указывают на то, что сопряжение биогеохимических циклов железа и углерода, особенно, в части метаболизма одноуглеродных соединений является наиболее значимым фактором в поддержании жизнедеятельности микробных сообществ различных водоносных горизонтов ЕММВ. С другой стороны, именно геохимическая активность микроорганизмов, восстанавливающих или окисляющих минералы железа, потребляющих СО2 с образованием биомассы и метана, или окисляющих биогенный и абиогенный метан, может оказывать самое существенное влияние на формирование гидрохимического облика минеральных вод ЕММВ. Такое предположение подтверждается результатами наших микробиологических исследований. Из отобранных нами проб минеральных вод ЕММВ было получено около 30 устойчивых накопительных культур с разнообразными энергетическими и углеродными субстратами. В большинстве этих культур доминировали метаногены, либо железоредуцирующие прокариоты. По одному представителю каждой из этих физиологических групп нам также удалось выделить в чистые культуры. Это типичный гидрогенотрофный метаноген Methanothermobacter wolfeii и железовосстанавливающий представитель нового семейства в порядке Deferribacterales, который был нами подробно охарактеризован на уровне фенотипа и генотипа в рамках отчётной публикации по проекту в журнале Микробиология. Помимо двух чистых культур, ещё как минимум, 2 устойчивых накопительных культуры, полученных нами из минеральных вод ЕММВ заслуживают особого внимания – это культура железоредуктора, относящегося к некультивируемому порядку OPB41 класса Coriobacteriia актинобактерий, и культура нового органотрофа порядка Ignavibacteriales. Оба этих филотипа составляют значительные доли биоразнообразия микробных сообществ минеральных вод и являются наиболее перспективными объектами для выделения в чистые культуры и фенотипического описания. Однако дальнейшая работа по получению накопительных и чистых культур новых групп микроорганизмов из глубинных минеральных вод затруднена тем, что физико-химические условия подземных водоносных горизонтов далеко не всегда можно точно определить или предсказать на основании параметров, определяемых на устьях добываемых скважин. В связи с этим, в ходе работ первого этапа нашего проекта был проведён длительный мониторинг и анализ литературных данных, позволяющий оценить динамику изменений гидрохимических параметров исследуемых минеральных вод и на основании полученных сведений точнее предсказать физико-химические особенности водовмещающих пород. Полученные нами данные о катионно-анионном, микроэлементном, газовом, изотопном составе минеральных вод и вмещающих пород ЕММВ создают необходимую базу для дальнейшего корреляционного анализа, который позволит выявить статистически значимые связи между газо-гидрохимическими, литологическими и микробиологическими факторами в формировании минеральных вод ЕММВ на следующем этапе нашего проекта. Результаты этой работы позволят сделать выводы о возможных механизмах влияния микробных сообществ, развивающихся в водоносных горизонтах ЕММВ, на состав бальнеологически ценных минеральных вод этого месторождения, а также позволят модифицировать селективные питательные среды для выделения целевых групп микроорганизмов, трудно поддающихся культивированию.

 

Публикации

1. Гаврилов С.Н., Потапов Е.Г., Прокофьева М.И., Клюкина А.А., Меркель А.Ю., Маслов А.А., Заварзина Д.Г. Разнообразие новых некультивируемых прокариот в микробных сообществах минеральных подземных вод Ессентукского месторождения Микробиология, том 91, вып.1, с. 32-49 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.31857/S0026365622010037

2. Заварзина Д.Г., Прокофьева М.И., Пихтерева В.А., Клюкина А.А., Маслов А.А., Меркель А.Ю., Гаврилов С.Н. Deferrivibrio essentukiensis sp. nov., gen. nov. – предcтавитель нового семейства Deferrivibrionaceae, fam. nov., выделенный из глубинного подземного водоносного горизонта Кавказских минеральных вод Микробиология, - (год публикации - 2022)


Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На втором этапе проекта общая схема работ по характеристике микробных сообществ подземных минеральных вод, состоящая из молекулярно-биологической, биоинформатической, микробиологической (культивирование) и гидрогеохимической частей, была использована для исследования микробных сообществ Нагутского месторождения (НММВ) – крупнейшего в регионе Кавказских Минеральных Вод. Полученные филогенетические профили микробных сообществ минеральных вод, вскрываемых 4-мя скважинами Нагутского месторождения, подтвердили выявленную ранее для Ессентукского месторождения (ЕММВ) зональность подземных экосистем региона, проявляющуюся в уникальном фенотипическом составе разных участков одного и того же водоносного горизонта и в уменьшении биоразнообразия микробных сообществ с глубиной. Полученные нами данные о филогенетическом и метаболическом разнообразии микроорганизмов, основанные на результатах молекулярно-экологического анализа и работ с накопительными культурами микроорганизмов, в целом, подтвердили существующую гипотезу о тесной гидравлической связи меловых водоносных горизонтов ЕММВ и НММВ и, соответственно, о взаимовлиянии геохимической и микробиологической составляющих этих экосистем друг на друга. Выполненный на втором этапе наших работ анализ изменений гидрогеохимических условий подземных водоносных горизонтов ЕММВ, состава их минеральных вод и метаболических возможностей их микробных сообществ выявил корреляционные связи между бальнеологическими параметрами (концентрацией СО2, ортоборной кислоты, брома и йода) минеральных вод типов Ессентуки №17 и №4 и присутствием архей в микробных сообществах этого участка ЕММВ. Кроме того, были выявлены статистически значимые корреляционные связи между рядом гидрохимических и физико-химических параметров вод трёх водоносных горизонтов ЕММВ и составом населяющих их микробных сообществ. В результате продолженных на втором этапе проекта работ с чистыми культурами микроорганизмов, выделенных из водоносных горизонтов ЕММВ, завершено таксономическое описание двух ранее некультивируемых филогенетических групп – представителей группы OPB41 и нового семейства в порядке Ignavibacteriales. Штамм Es71-Z0120T (группа OPB41) отнесён к новому роду и виду Parvivirga hydrogeniphila gen. nov., sp. nov. в новом семействе Anaerosomaceae fam. nov., нового порядка Anaerosomales ord. nov. Штамм 09-MeT, представляющий отдельную линию в семействе Melioribacteraceae класса Ignavibacteria, отнесён к новому роду и виду, Stygiobacter electus gen. nov., sp. nov. В результате метагеномного анализа были выявлены основные метаболические группы прокариот в каждом из исследованных микробных сообществ ЕММВ и доказана существенная роль автотрофов с полным набором генов пути Вуда-Льюнгдаля в функционировании этих микробных сообществ. Показано, что в верхнемеловом горизонте по мере падения пласта возрастает доля метаногенных автотрофов, железоредукторов и гомоацетогенных микроорганизмов, использующих водород в качестве донора электронов. Выявлено, что основную часть микробного сообщества наиболее глубокого, верхнеюрского горизонта, характеризующегося высоким газовом фактором и газовой фазой, состоящей практически полностью из CO2, составляют литоавтотрофные гомоацетогены. Проведенные работы по модификации метода селективных сред для получения накопительных культур микроорганизмов ранее некультивируемых филогенетических групп с использованием различных неполярных органических соединений в качестве факторов роста позволили получить ряд перспективных накопительных культур, работа с которыми будет продолжена на третьем этапе проекта.

 

Публикации

1. Гаврилов С.Н., А.С. Барашкова, Т.А. Чердынцева, М.И. Прокофьева, О.В. Тресвятский, И.А. Остерман, Д.А. Лукьянов, Т. Эртле, А.Ю. Меркель, Е.А. Бонч-Осмоловская, Е.А. Рогожин Новые галофильные и галотолерантные продуценты антимикробных соединений из различных экстремальных экосистем Микробиология, Микробиология, 2023, Т.92, №3 (год публикации - 2023)

2. Хомякова М.А., Заварзина Д.Г., Меркель А.Ю., Клюкина А.А., Пихтерева В.А., Гаврилов С.Н., Слободкин А.И. The First Cultivated Representatives of the Actinobacterial Lineage OPB41 Isolated from Subsurface Environments Constitute a Novel Order Anaerosomatales Frontiers in Microbiology, Frontiers in Microbiology. 2022. 13:1047580. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.1047580


Аннотация результатов, полученных в 2023 году
На заключительном этапе проекта были проанализированы метагеномы микробных сообществ минеральных вод верхнемелового горизонта Нагутского месторождения. Анализ выявил, что только 10% метагеномных последовательностей принадлежало археям – метаногенным термофилам рода “Candidatus Methanosuratus” и органотрофным гипертермофилам вида Thermococcus sibiricus, штамм которого был выделен в чистую культуру из воды скважины 47. Среди бактериальных генотипов более половины обладали ключевыми генами пути Вуда-Льюнгдаля автотрофной фиксации СО2 и, могут быть способны к автотрофному росту. Существенную долю метагеномных прочтений составляли генотипы сульфатредукторов, многие из которых принадлежали глубоким филогенетическим линиям фирмикут. Большинство генотипов сульфатредукторов содержало также детерминанты других процессов анаэробного дыхания, в первую очередь, железоредукции. Эта ситуация контрастирует с нашими данными по микробным сообществам ЕММВ, в которых микроорганизмы циклов серы и железа были узко специализированы и представлены разнообразными генотипами, составляющими существенную долю метагеномов. Ещё одним отличием микробных сообществ НММВ и ЕММВ стало обнаружение в нагутских метагеномах генов обратных гираз, характерных только для гипертермофилов. Общая представленность генотипов гипертермофилов составила в нагутских метагеномах 10%, тогда как в ессентукских этот геномный маркер экстремофилии обнаружен не был, что соотносится с большими глубинами и предполагаемыми большими температурами водоносных горизонтов НММВ по сравнению с ЕММВ. В ходе культуральных исследований на 3-м году проекта была получена чистая культура структурообразующего микроорганизма-продуцента микробного сообщества верхнеюрского водоносного горизонта ЕММВ из воды скважины 75-бис. Процент сходства нового гомоацетогенного штамма 75b-Ac с последовательностью 16S рРНК Aceticella autotrophica 3443-3Acᵀ, выделенного ранее из горячего источника Камчатки, составил 99,62 %. Кроме того, методом предельных разведений из вод скважин 46 и 49-Э того же горизонта ЕММВ на анаэробной среде с Н2 и ферригидритом удалось выделить чистые культуры железовосстанавливающих бактерий новой глубокой филогенетической группы. Обе культуры относятся к одному виду, являются термофилами и нейтрофилами, используют в качестве акцептора электронов ферригидрит, восстанавливая его в сидерит с Н2 или формиатом в качестве доноров электронов, способны к литоавтотрофному росту. Полногеномный анализ показал, что выделенная бактерия представляет новый класс внутри Actinomycetota. В культурах, полученных в прошлом году из вод скважин 47 НММВ и 46 ЕММВ с H2, алевролитом, S2O3 и SO42- при рН 6,9 и 45оС, на текущем этапе проекта удалось накопить новых представителей описанного нами порядка железоредукторов Anaerosomatales. В чистую культуру был выделен один из этих организмов, из нагутской скважины, который оказался неспособным к железоредукции. Неожиданной стала идентификация ранее выделенных нами анаэробных железоокисляющих бактерий из скважин 9 и 46 ЕММВ как представителей родов Bradyrhizobium и Ciceribacter, соответственно. Обе рода являются типичными компонентами почвенной микрофлоры, ассоциированной с ризосферой. Наши изоляты относятся к видам B. lupini и C. ferooxidans, однако в отличие от типовых штаммов являются факультативными литотрофными анаэробами, окисляющим Fe(II) аэробно или анаэробно. Кроме того, для нового штамма C. ferooxidans было выявлено существенное стимулирующее влияние примесей магнитных оксидов железа на скорость роста и урожай клеток. В верхнемеловом горизонте ЕММВ и НММВ по результатам профилирования по гену 16S рРНК в составе сообществ было обнаружено, соответственно, 30% и 10% филотипов архей филума Hadarchaeota. В поисках карбоксидотрофных и анаэробных углеводородокисляющих микроорганизмов, как возможных представителей этой группы в верхнемеловом горизонте, были получены устойчивые накопительные культуры, потребляющие СО или растущие на смеси различных углеводородов. Накопительные культуры из проб воды скважин 46 ЕММВ и 47 НММВ были представлены морфологически однородными одиночными мелкими кокками и полностью потребляли 10% СО в газовой фазе за 10 дней инкубирования при 70°С и 55°С, соответственно. В культуре 47Н, единственным продуктом потребления СО оказался формиат, что является уникальным для карбоксидотрофов и указывает на наличие у них необычной комбинации ферментов. Для некультивируемых Hadarchaeota по результатам геномного анализа была предсказана способность к окислению СО (Baker et al., 2016), это, вместе с результатами 16S-профилирования микробного сообщества, позволяет предположить накопление этой группы организмов в нашей культуре 47Н. Проведенный нами комплексный анализ тамбуканских грязей однозначно указал на наличие генетической связи их микробных сообществ с сообществами минеральных вод верхнемелового горизонта ЕММВ и НММВ. Действительно, помимо естественной подпитки Тамбуканских озёр грунтовыми водами, в течение более 45 лет эти водоёмы искусственно пополняются пресными термальными водами нижнемелового водоносного горизонта, что может обеспечивать привнос микроорганизмов, характерных для ЕММВ. С этим соотносится и близость филогенетического состава микробных сообществ лечебных грязей и погруженных областей верхнемеловых горизонтов ЕММВ и НММВ, обнаруженная при анализе бета-разнообразия всей совокупности проанализированных нами экосистем. В то же время, культуральные эксперименты показали, что разнообразная микрофлора цикла серы озера Большой Тамбукан достаточно своеобразна и не имеет прямой связи с микроорганизмами этой группы из водоносных горизонтов ЕММВ и НММВ. Вероятно, это обусловлено химическим составом воды озера, обеспечивающим формирование стабильного и активного аборигенного микробного сообщества. Результаты корреляционного анализа по геохимическим данным и биоразнообразию микробных сообществ показали, что сообщества погруженной части верхнемелового горизонта ЕММВ (скв. 49-Э и 71) и НММВ (скв. 47) достаточно близки по своему составу и могут рассматриваться как родственные. При этом, отдельные компактные группы составили микробные сообщества вод из трёх скважин нижнемелового горизонта НММВ, связанных общим процессом генезиса, и сообщества низкоминерализованных тёплых и оксигенированных вод ЕММВ – зоны питания (скв. 70) и нижнемелового горизонта (скв. 9), характеризующихся наиболее активным водообменом с земной поверхностью. Кроме того, микробное сообщество верхнеюрского горизонта ЕММВ (скв. 75-бис), представляющего собой уникальную экосистему, в которой ведущую роль играет процесс гидрогенотрофного ацетогенеза, не нашло пересечений ни с одной из изученных экониш. Таким образом, существующая гипотеза гидрогеологического единства месторождений ЕММВ и НММВ нашла частичное подтверждение в нашей работе. Обобщение всех полученных геологических, гидрогеохимических и микробиологических данных по окончании работ по проекту выявило, что исследованные месторождения подземных минеральных вод, Ессентукское и Нагутское, представляют собой систему нескольких пространственно разделенных подземных экосистем со своими физико-химическими и гидрогеологическими особенностями, которые определяют филогенетическое и метаболическое разнообразие населяющих их микроорганизмов. Для каждой из этих подземных экосистем складывается уникальное микробное сообщество, геохимическая активность которого довершает формирование состава минеральных вод конкретного горизонта, в первую очередь, влияя на газовый и макрокомпонентный состав вод и степень их восстановленности через процессы восстановления минералов железа и соединений серы, а также образования метана.

 

Публикации

1. Д.Г. Заварзина, А.Ю. Меркель, А.А. Клюкина, И.М. Елизаров, В.А. Пихтерева, В.С. Русаков, Н.И. Чистякова, Р.Х. Зиганьшин, А.А. Маслов, С.Н. Гаврилов Iron or sulfur respiration - an adaptive choice determining the fitness of a natronophilic bacterium Dethiobacter alkaliphilus in geochemically contrasting environments Frontiers in Microbiology, 14:1108245. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1108245

2. Д.Г. Заварзина, В.А. Пихтерева, А.А. Клюкина, А.Ю. Меркель, С.Н. Гаврилов New Anaerobic Iron-Cycling Bacteria Isolated from the Yessentukskoye Mineral Water Deposit Microbiology (Moscow) / Микробиология, Vol. 92, Suppl. 1, pp. S12-S16 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1134/S0026261723603718

3. О.А. Подосокорская, А.Г. Ельченинов, С.Н. Гаврилов, Н.Ф. Петрова, А.А. Клюкина, Д.Г. Заварзина, А.Ю. Мерекль New Representatives of the Class Ignavibacteria Inhabiting Subsurface Aquifers of Yessentuki Mineral Water Deposit Water, 2023, 15, 3451. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/w15193451


Возможность практического использования результатов
Полученные результаты, в первую очередь накопленные базы данных о микрофлоре бальнеологически ценных питьевых минеральных вод, активно используемых в практике бальнеолечения, а также о микробных процессах, задействованных в формировании и поддержании химического состава этого ценного природного ресурса, представляют собой важный задел для мониторинга количества и качества запасов минеральных вод и регулярной переоценки их запасов на разрабатываемых месторождениях. Кроме того, наработанный опыт молекулярно-биологической и химической характеристики минеральных вод уже востребован недропользователями и производителями бутилированной минеральной воды в регионе КМВ для повышения уровня контроля качества выпускаемой продукции и расследования сложных случаев нарушений технологической цепочки розлива минеральных вод. Этот опыт может быть распространён и на другие производства лечебных питьевых минеральных вод в регионе КМВ и других курортных зонах России.