Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В ходе первого года проекта разработана схема отбора проб подземных минеральных вод Ессентукского месторождения (ЕММВ), позволяющая изучить широкое разнообразие подземных экосистем, в которых формируются исследуемые микробные сообщества. Согласно намеченной схеме, отобраны пробы для гидрогеохимической характеристики, микробиологических и молекулярно-биологических работ из 6-ти различных скважин ЕММВ, вскрывающих различные водоносные горизонты (верхне- и нижнемеловые, верхнеюрские) на глубинах от 200 м до 1 км и различном расстоянии от зоны питания месторождения. Из отобранных проб выделена тотальная ДНК и проанализирована методом NGS-секвенирования на платформе Illumina. По результатам секвенирования получены филогенетические профили микробных сообществ по гену 16S рРНК 6-ти различных подземных экосистем, вскрываемых добывающими скважинами ЕММВ. Кроме того, из метагеномных данных собран 151 «композитный геном» (MAG) индивидуальных представителей микробных сообществ с полнотой сборки от 70,1 до 100% и контаминацией от 0 до 4,93% (усреднённые значения 90,8% и 1,43%, соответственно). Полученные геномные последовательности аннотированы и проанализированы. В них выявлены детерминанты биохимических процессов, активность которых может повлиять на состав минеральных вод и водовмещающих пород, а именно: процессов сульфатредукции, окисления и восстановления серы и соединений железа, нитрат- и нитритредукции, окисления аммония, азотфиксации, аэробного дыхания, метаногенеза и метанотрофии, СО-трофии, потребления и образования молекулярного водорода, автотрофной фиксации СО2 и полного окисления органических веществ до CO2. Результаты филогенетического профилирования исследуемых микробных сообществ выявили, что несмотря на «гидравлическую открытость» водоносных горизонтов ЕММВ и предполагаемый активный водообмен между ними, микробиота этих горизонтов существенно различается. Такой результат подразумевает, что исследуемые микробные сообщества развиваются, главным образом, в разнообразных микронишах в толще водовмещающих пород, и не подвержены активным процессам миграции между водоносными горизонтами. Результаты нашей работы показали, что в микробных сообществах вод Ессентукского месторождения доминируют представители глубоких филогенетических линий, которые могли длительное время эволюционировать обособленно от поверхностной биосферы. Это касается в том числе и микробных сообществ пресных вод ЕММВ испытывающих наибольшее гидрогеохимическое влияние метеорных вод. Наиболее интригующим результатом изучения филогенетического разнообразия микробиоты Ессентукских минеральных вод стало выявление доминирования архей нового некультивируемого филума Hadarchaeota (до 30% разнообразия сообщества) в микробном сообществе воды типа Ессентуки №17 верхнемелового горизонта, вскрываемого скважиной 46. Неожиданным результатом явилось также обнаружение микробного сообщества, 90% разнообразия которого покрывается одним филотипом – новым представителем семейства Thermoanaerobacteraceae, имеющим согласно метагеномным данным гомоацетогенный тип метаболизма. Такое сообщество было обнаружено в водах верхнеюрского горизонта (скважина 75-бис), имеющих наибольшее содержание углекислого газа, что вероятно, является ключевым фактором, обуславливающим термодинамические преимущества гомоацетогенного восстановления CO2 по сравнению с гидрогенотрофным метаногенезом, который является более энергетически выгодным при использовании СО2 в качестве акцептора электронов в строго анаэробной, восстановительной обстановке. Анализ метагеномных данных позволил выявить две ключевые физиологические группы микроорганизмов во всех исследуемых микробных сообществах. Это, в первую очередь, микроорганизмы, метаболизирующие С1-соединения, гидрогенотрофные метаногены а также хемоавтотрофные микроорганизмы, которые могут использовать другие акцепторы электронов, помимо СО2. Наиболее значимыми из таких акцепторов могут быть соединения Fe(III), что коррелирует с широкой представленностью потенциальных железоредукторов практически во всех исследованных микробных сообществах. В некоторых из них могут также идти активные процессы нитратредукции и сульфатредукции. Важным источником энергии для исследованных микробных сообществ, по-видимому, являются соединения Fe(II), способность к окислению которых широко представлена во многих проанализированных метагеномах. Таким образом, наши данные указывают на то, что сопряжение биогеохимических циклов железа и углерода, особенно, в части метаболизма одноуглеродных соединений является наиболее значимым фактором в поддержании жизнедеятельности микробных сообществ различных водоносных горизонтов ЕММВ. С другой стороны, именно геохимическая активность микроорганизмов, восстанавливающих или окисляющих минералы железа, потребляющих СО2 с образованием биомассы и метана, или окисляющих биогенный и абиогенный метан, может оказывать самое существенное влияние на формирование гидрохимического облика минеральных вод ЕММВ. Такое предположение подтверждается результатами наших микробиологических исследований. Из отобранных нами проб минеральных вод ЕММВ было получено около 30 устойчивых накопительных культур с разнообразными энергетическими и углеродными субстратами. В большинстве этих культур доминировали метаногены, либо железоредуцирующие прокариоты. По одному представителю каждой из этих физиологических групп нам также удалось выделить в чистые культуры. Это типичный гидрогенотрофный метаноген Methanothermobacter wolfeii и железовосстанавливающий представитель нового семейства в порядке Deferribacterales, который был нами подробно охарактеризован на уровне фенотипа и генотипа в рамках отчётной публикации по проекту в журнале Микробиология. Помимо двух чистых культур, ещё как минимум, 2 устойчивых накопительных культуры, полученных нами из минеральных вод ЕММВ заслуживают особого внимания – это культура железоредуктора, относящегося к некультивируемому порядку OPB41 класса Coriobacteriia актинобактерий, и культура нового органотрофа порядка Ignavibacteriales. Оба этих филотипа составляют значительные доли биоразнообразия микробных сообществ минеральных вод и являются наиболее перспективными объектами для выделения в чистые культуры и фенотипического описания. Однако дальнейшая работа по получению накопительных и чистых культур новых групп микроорганизмов из глубинных минеральных вод затруднена тем, что физико-химические условия подземных водоносных горизонтов далеко не всегда можно точно определить или предсказать на основании параметров, определяемых на устьях добываемых скважин. В связи с этим, в ходе работ первого этапа нашего проекта был проведён длительный мониторинг и анализ литературных данных, позволяющий оценить динамику изменений гидрохимических параметров исследуемых минеральных вод и на основании полученных сведений точнее предсказать физико-химические особенности водовмещающих пород. Полученные нами данные о катионно-анионном, микроэлементном, газовом, изотопном составе минеральных вод и вмещающих пород ЕММВ создают необходимую базу для дальнейшего корреляционного анализа, который позволит выявить статистически значимые связи между газо-гидрохимическими, литологическими и микробиологическими факторами в формировании минеральных вод ЕММВ на следующем этапе нашего проекта. Результаты этой работы позволят сделать выводы о возможных механизмах влияния микробных сообществ, развивающихся в водоносных горизонтах ЕММВ, на состав бальнеологически ценных минеральных вод этого месторождения, а также позволят модифицировать селективные питательные среды для выделения целевых групп микроорганизмов, трудно поддающихся культивированию.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На втором этапе проекта общая схема работ по характеристике микробных сообществ подземных минеральных вод, состоящая из молекулярно-биологической, биоинформатической, микробиологической (культивирование) и гидрогеохимической частей, была использована для исследования микробных сообществ Нагутского месторождения (НММВ) – крупнейшего в регионе Кавказских Минеральных Вод. Полученные филогенетические профили микробных сообществ минеральных вод, вскрываемых 4-мя скважинами Нагутского месторождения, подтвердили выявленную ранее для Ессентукского месторождения (ЕММВ) зональность подземных экосистем региона, проявляющуюся в уникальном фенотипическом составе разных участков одного и того же водоносного горизонта и в уменьшении биоразнообразия микробных сообществ с глубиной. Полученные нами данные о филогенетическом и метаболическом разнообразии микроорганизмов, основанные на результатах молекулярно-экологического анализа и работ с накопительными культурами микроорганизмов, в целом, подтвердили существующую гипотезу о тесной гидравлической связи меловых водоносных горизонтов ЕММВ и НММВ и, соответственно, о взаимовлиянии геохимической и микробиологической составляющих этих экосистем друг на друга. Выполненный на втором этапе наших работ анализ изменений гидрогеохимических условий подземных водоносных горизонтов ЕММВ, состава их минеральных вод и метаболических возможностей их микробных сообществ выявил корреляционные связи между бальнеологическими параметрами (концентрацией СО2, ортоборной кислоты, брома и йода) минеральных вод типов Ессентуки №17 и №4 и присутствием архей в микробных сообществах этого участка ЕММВ. Кроме того, были выявлены статистически значимые корреляционные связи между рядом гидрохимических и физико-химических параметров вод трёх водоносных горизонтов ЕММВ и составом населяющих их микробных сообществ. В результате продолженных на втором этапе проекта работ с чистыми культурами микроорганизмов, выделенных из водоносных горизонтов ЕММВ, завершено таксономическое описание двух ранее некультивируемых филогенетических групп – представителей группы OPB41 и нового семейства в порядке Ignavibacteriales. Штамм Es71-Z0120T (группа OPB41) отнесён к новому роду и виду Parvivirga hydrogeniphila gen. nov., sp. nov. в новом семействе Anaerosomaceae fam. nov., нового порядка Anaerosomales ord. nov. Штамм 09-MeT, представляющий отдельную линию в семействе Melioribacteraceae класса Ignavibacteria, отнесён к новому роду и виду, Stygiobacter electus gen. nov., sp. nov. В результате метагеномного анализа были выявлены основные метаболические группы прокариот в каждом из исследованных микробных сообществ ЕММВ и доказана существенная роль автотрофов с полным набором генов пути Вуда-Льюнгдаля в функционировании этих микробных сообществ. Показано, что в верхнемеловом горизонте по мере падения пласта возрастает доля метаногенных автотрофов, железоредукторов и гомоацетогенных микроорганизмов, использующих водород в качестве донора электронов. Выявлено, что основную часть микробного сообщества наиболее глубокого, верхнеюрского горизонта, характеризующегося высоким газовом фактором и газовой фазой, состоящей практически полностью из CO2, составляют литоавтотрофные гомоацетогены. Проведенные работы по модификации метода селективных сред для получения накопительных культур микроорганизмов ранее некультивируемых филогенетических групп с использованием различных неполярных органических соединений в качестве факторов роста позволили получить ряд перспективных накопительных культур, работа с которыми будет продолжена на третьем этапе проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
На заключительном этапе проекта были проанализированы метагеномы микробных сообществ минеральных вод верхнемелового горизонта Нагутского месторождения. Анализ выявил, что только 10% метагеномных последовательностей принадлежало археям – метаногенным термофилам рода “Candidatus Methanosuratus” и органотрофным гипертермофилам вида Thermococcus sibiricus, штамм которого был выделен в чистую культуру из воды скважины 47. Среди бактериальных генотипов более половины обладали ключевыми генами пути Вуда-Льюнгдаля автотрофной фиксации СО2 и, могут быть способны к автотрофному росту. Существенную долю метагеномных прочтений составляли генотипы сульфатредукторов, многие из которых принадлежали глубоким филогенетическим линиям фирмикут. Большинство генотипов сульфатредукторов содержало также детерминанты других процессов анаэробного дыхания, в первую очередь, железоредукции. Эта ситуация контрастирует с нашими данными по микробным сообществам ЕММВ, в которых микроорганизмы циклов серы и железа были узко специализированы и представлены разнообразными генотипами, составляющими существенную долю метагеномов. Ещё одним отличием микробных сообществ НММВ и ЕММВ стало обнаружение в нагутских метагеномах генов обратных гираз, характерных только для гипертермофилов. Общая представленность генотипов гипертермофилов составила в нагутских метагеномах 10%, тогда как в ессентукских этот геномный маркер экстремофилии обнаружен не был, что соотносится с большими глубинами и предполагаемыми большими температурами водоносных горизонтов НММВ по сравнению с ЕММВ. В ходе культуральных исследований на 3-м году проекта была получена чистая культура структурообразующего микроорганизма-продуцента микробного сообщества верхнеюрского водоносного горизонта ЕММВ из воды скважины 75-бис. Процент сходства нового гомоацетогенного штамма 75b-Ac с последовательностью 16S рРНК Aceticella autotrophica 3443-3Acᵀ, выделенного ранее из горячего источника Камчатки, составил 99,62 %. Кроме того, методом предельных разведений из вод скважин 46 и 49-Э того же горизонта ЕММВ на анаэробной среде с Н2 и ферригидритом удалось выделить чистые культуры железовосстанавливающих бактерий новой глубокой филогенетической группы. Обе культуры относятся к одному виду, являются термофилами и нейтрофилами, используют в качестве акцептора электронов ферригидрит, восстанавливая его в сидерит с Н2 или формиатом в качестве доноров электронов, способны к литоавтотрофному росту. Полногеномный анализ показал, что выделенная бактерия представляет новый класс внутри Actinomycetota. В культурах, полученных в прошлом году из вод скважин 47 НММВ и 46 ЕММВ с H2, алевролитом, S2O3 и SO42- при рН 6,9 и 45оС, на текущем этапе проекта удалось накопить новых представителей описанного нами порядка железоредукторов Anaerosomatales. В чистую культуру был выделен один из этих организмов, из нагутской скважины, который оказался неспособным к железоредукции. Неожиданной стала идентификация ранее выделенных нами анаэробных железоокисляющих бактерий из скважин 9 и 46 ЕММВ как представителей родов Bradyrhizobium и Ciceribacter, соответственно. Обе рода являются типичными компонентами почвенной микрофлоры, ассоциированной с ризосферой. Наши изоляты относятся к видам B. lupini и C. ferooxidans, однако в отличие от типовых штаммов являются факультативными литотрофными анаэробами, окисляющим Fe(II) аэробно или анаэробно. Кроме того, для нового штамма C. ferooxidans было выявлено существенное стимулирующее влияние примесей магнитных оксидов железа на скорость роста и урожай клеток. В верхнемеловом горизонте ЕММВ и НММВ по результатам профилирования по гену 16S рРНК в составе сообществ было обнаружено, соответственно, 30% и 10% филотипов архей филума Hadarchaeota. В поисках карбоксидотрофных и анаэробных углеводородокисляющих микроорганизмов, как возможных представителей этой группы в верхнемеловом горизонте, были получены устойчивые накопительные культуры, потребляющие СО или растущие на смеси различных углеводородов. Накопительные культуры из проб воды скважин 46 ЕММВ и 47 НММВ были представлены морфологически однородными одиночными мелкими кокками и полностью потребляли 10% СО в газовой фазе за 10 дней инкубирования при 70°С и 55°С, соответственно. В культуре 47Н, единственным продуктом потребления СО оказался формиат, что является уникальным для карбоксидотрофов и указывает на наличие у них необычной комбинации ферментов. Для некультивируемых Hadarchaeota по результатам геномного анализа была предсказана способность к окислению СО (Baker et al., 2016), это, вместе с результатами 16S-профилирования микробного сообщества, позволяет предположить накопление этой группы организмов в нашей культуре 47Н. Проведенный нами комплексный анализ тамбуканских грязей однозначно указал на наличие генетической связи их микробных сообществ с сообществами минеральных вод верхнемелового горизонта ЕММВ и НММВ. Действительно, помимо естественной подпитки Тамбуканских озёр грунтовыми водами, в течение более 45 лет эти водоёмы искусственно пополняются пресными термальными водами нижнемелового водоносного горизонта, что может обеспечивать привнос микроорганизмов, характерных для ЕММВ. С этим соотносится и близость филогенетического состава микробных сообществ лечебных грязей и погруженных областей верхнемеловых горизонтов ЕММВ и НММВ, обнаруженная при анализе бета-разнообразия всей совокупности проанализированных нами экосистем. В то же время, культуральные эксперименты показали, что разнообразная микрофлора цикла серы озера Большой Тамбукан достаточно своеобразна и не имеет прямой связи с микроорганизмами этой группы из водоносных горизонтов ЕММВ и НММВ. Вероятно, это обусловлено химическим составом воды озера, обеспечивающим формирование стабильного и активного аборигенного микробного сообщества. Результаты корреляционного анализа по геохимическим данным и биоразнообразию микробных сообществ показали, что сообщества погруженной части верхнемелового горизонта ЕММВ (скв. 49-Э и 71) и НММВ (скв. 47) достаточно близки по своему составу и могут рассматриваться как родственные. При этом, отдельные компактные группы составили микробные сообщества вод из трёх скважин нижнемелового горизонта НММВ, связанных общим процессом генезиса, и сообщества низкоминерализованных тёплых и оксигенированных вод ЕММВ – зоны питания (скв. 70) и нижнемелового горизонта (скв. 9), характеризующихся наиболее активным водообменом с земной поверхностью. Кроме того, микробное сообщество верхнеюрского горизонта ЕММВ (скв. 75-бис), представляющего собой уникальную экосистему, в которой ведущую роль играет процесс гидрогенотрофного ацетогенеза, не нашло пересечений ни с одной из изученных экониш. Таким образом, существующая гипотеза гидрогеологического единства месторождений ЕММВ и НММВ нашла частичное подтверждение в нашей работе. Обобщение всех полученных геологических, гидрогеохимических и микробиологических данных по окончании работ по проекту выявило, что исследованные месторождения подземных минеральных вод, Ессентукское и Нагутское, представляют собой систему нескольких пространственно разделенных подземных экосистем со своими физико-химическими и гидрогеологическими особенностями, которые определяют филогенетическое и метаболическое разнообразие населяющих их микроорганизмов. Для каждой из этих подземных экосистем складывается уникальное микробное сообщество, геохимическая активность которого довершает формирование состава минеральных вод конкретного горизонта, в первую очередь, влияя на газовый и макрокомпонентный состав вод и степень их восстановленности через процессы восстановления минералов железа и соединений серы, а также образования метана.