Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Исследованы профили экспрессии генов и микроРНК при КПГ, на основе которых впервые определены молекулярные субтипы (кластеры) опухолей. При неуправляемой иерархической кластеризации на основе дифференциальной экспрессии (ДЭ) генов выявлено 5 кластеров КПГ. Для каждого кластера идентифицированы особенности изменения биологических процессов. Кластер 1 характеризовался повышением экспрессии генов иммунной системы, путей адгезии и миграции клеток и понижением экспрессии нейрональных генов, в противоположность первому кластеру выявлен кластер 2. Кластер 3 был обогащен нейрональными генами с повышенной экспрессией и генами с пониженной экспрессией, участвующими в формировании подвижности клеток и васкуляризации. Кластер 4 не характеризовался значимыми изменениями, кластер 5 ассоциирован с понижением экспрессии генов, связанных с локализацией белков и трансляцией. По микроРНК экспрессии, КПГ разделились на 6 кластеров, характеризующимися следующими особенностями: микроРНК кластер 1 – повышение регуляции сигнального пути Hippo и метаболизма аминокислот, микроРНК кластер 2 - повышение экспрессии онко-ассоциированной микроРНК miR-7-5p, микроРНК кластер 3 - дерегуляция путей деградации РНК, апоптоза и транскрипции, микроРНК кластер 4 - понижение экспрессии микроРНК miR-375-3p, вовлеченной в регуляцию апоптоза, микроРНК кластер 5 - понижение экспрессии микроРНК miR-324-3p, имеющей функции опухолевого супрессора, микроРНК кластер 6 - понижение экспрессии четырех онко-ассоциированных микроРНК – miR-369-3p, miR-744-5p, miR-574-3p и miR-1301-3p. Кластеры по мРНК и микроРНК не коррелировали друг с другом. Также кластеры не имели высоких корреляций с мутациями в генах предрасположенности к параганглиомам/феохромоцитомам, идентифицированных в исследуемой выборке. Согласно результатам управляемой кластеризации, проведенной для ДЭ генов и микроРНК между группой опухолей с мутацией в SDHx и без мутаций в этих генах, четкого разделения образцов на кластеры в зависимости от наличия мутаций не выявлено. Идентифицирована группа генов, которые характеризуются наиболее значимыми изменениями экспрессии, коррелирующими с SDHx мутациями: 26 генов со специфически повышенной экспрессией и 53 гена с пониженной экспрессией. Также проведен анализ обогащения путей по KEGG, на основе которого определено 8 наиболее значимых биологических путей, ассоциированных с мутациями в генах SDHx при КПГ, включая сигнальные пути TGF-бета и p53, иммунный ответ и адгезию, которые могут быть связаны с более агрессивным фенотипом SDHx-мутантных опухолей. Анализ дифференциальной экспрессии микроРНК между этими двумя группами опухолей и их мРНК-мишеней выявил 15 микроРНК, вовлеченных в регуляцию 20 биологических путей. Большинство путей ассоциированы с канцерогенезом (адгезия, сигнальные пути TGF-бета, FoxO и Hippo) и вероятно также играют важную роль при развитии КПГ. С использованием полносвязной нейронной сети, создана модель на основе экспрессии пяти генов (GFPT2, GABRG2, KCNA6, PCDH9 и CACNG3), предсказывающая наличие SDHx мутаций при КПГ (чувствительность - до 0,97, специфичность – до 0,9, точность – 0,92 и AUC – до 0,92). В настоящее время, стабильных и охарактеризованных клеточных линий параганглиом головы и шеи не существует из-за их редкости и сложности культивирования. В рамках проекта получено шесть первичных клеточных культур и три иммортализованных культуры КПГ, подобраны и оптимизированы условия для их культивирования. Также исследованы молекулярно-генетические изменения, связанные с редким случаем метастатической КПГ. Идентифицированы драйверные события, лежащие в основе развития и прогрессии заболевания – герминальный патогенный вариант сайта сплайсинга c.287-2A>G в гене SDHB и соматическая мутация промотора g.586G>A в гене TERT. Полученные данные подтверждают потенциальную прогностическую роль мутаций в генах SDHB и TERT при параганглиомах и важны для понимания механизмов прогрессии этих опухолей.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Впервые проведен интегративный анализ профилей экспрессии микроРНК-мРНК при каротидных параганглиомах (КПГ). Более 100 пар микроРНК и их мишеней-мРНК характеризовались коэффициентами корреляции Спирмена от 0,4 до 0,6. В состав 35 пар входила микроРНК miR-16-5p. Самые высокие коэффициенты корреляции наблюдались для пар miR-16-5p-CLTC (rs=-0,6), miR-150-5p-TMED4 (rs=-0,6) и miR-654-3p-MYO18A (rs=-0,5), которые включали микроРНК и гены, вовлеченные в онкогенез. На основе анализа компонентов антикорреляций выявлены достоверные изменения в путях «Химический карциногенез – активные формы кислорода» (KEGG) и «Транскрипционная регуляция белком TP53» (R-HSA-3700989) и «Окислительное фосфорилирование» (hsa00190, KEGG), которые могут быть связаны с нарушением функции митохондрий, что характерно для параганглиом. Также выявлены потенциальные регуляторные взаимодействия между микроРНК-мРНК, ассоциированные с мутациями в генах SDHx. Значимая антикорреляция микроРНК miR-16-5p и гена MT-CO2 показана при мутациях в любом из генов SDHx, что может быть связано с состоянием псевдогипоксии. Проведено исследования профилей экспрессии генов и микроРНК, ассоциированных с мутациями в генах SDHx при феохромоцитомах (ФЕО) с использованием данных TCGA (проект PCPG). Идентифицировано более 400 генов, характеризующихся значимым изменением экспрессии. Показано, что в отличие от каротидных параганглиом, феохромоцитомы характеризуются значительным набором генов, коррелирующих с мутациями в SDHx и демонстрируют четкое разделение профилей экспрессии. На основе анализа обогащений набора генов выявлено десять путей (KEGG), которые значимо изменяются в связи с мутациями в генах SDHx при ФЕО, включая онко-ассоциированные сигнальные пути Wnt, Hippo и Notch. Кроме того, идентифицировано три микроРНК с повышенной экспрессией (miR-143-3p, -210-3p и -183-5p) и семь микроРНК с пониженной экспрессией (miR-132-3p, -153-5p, -137-3p, -218-5p, -29b-3p, -29c-3p и -29b-2-5p), демонстрирующих значимую корреляцию с SDHx мутациями. МикроРНК miR-132-3p является потенциальным супрессором опухолевого роста и также характеризуется понижением экспрессии в SDHx-мутантных каротидных параганглиомах. Также выявлено 17 биологических путей (KEGG), в которые вовлечены дифференциально экспрессирующиеся микроРНК. Общие с каротидными параганглиомами оказались пути рецепторного взаимодействия с внеклеточным матриксом, сигнальный путь Hippo, адгезия и клеточный цикл. Нарушение регуляции в путях биосинтеза жирных кислот, процессинге белка в эндоплазматической ретикулуме, сигнальных путях p53 и PI3K-Akt выявлены специфически при SDHx-мутантных ФЕО. Для образцов КПГ с мутациями в генах SDHx, являющимися потенциальными генами-супрессорами опухолевого роста, проведено исследование механизмов инактивации гена, включая анализ вариаций числа копий (CNV) хромосом, анализ микроделеций и потери гетерозиготности (LOH). Анализ CNV, выполненный с использованием метода BAF, показал частую потерю короткого плеча хромосомы 1 и потерю целой хромосомы в большинстве опухолей с мутацией в гене SDHB (89%), а также частую потерю хромосомы 11 в опухолях с мутацией в гене SDHD (64%). В образцах с мутацией в гене SDHC также наблюдалась частая вероятная потеря хромосомы 1 (60%). На основе анализа 14 микросателлитных маркеров, проведена оценка потери гетерозиготности в области генов SDHx, что является наиболее частым соматическим нарушением, приводящим к инактивации генов-супрессоров опухолевого роста. Потеря гетерозиготности наблюдалась в большинстве опухолей с мутациями в генах SDHx, что согласуется с данными BAF анализа и подтверждает утрату аллели дикого типа. Анализ микроделеций выявил частую потерю участка 11p15 в опухолях с мутацией в гене SDHD. Иммортализированная клеточная культура КПГ (PGL13) охарактеризована на основе экспрессионных маркеров единичных клеток и профиля мутаций. Выполнено транскриптомное профилирования единичных клеток параганглиом с использованием технологии 10x Genomics. В ходе биоинформатического анализа оптимально определено три кластера, на которые распределялись клетки (t-SNE). Для аннотации клеток использовали две наиболее подходящие базы данных - PollenGliaData (нервная ткань, радиальная глия) и базу данных пакета scCATCH (353 клеточных типа, 184 ткани). Аннотация индивидуальных клеток по базе данных PollenGliaData, содержащей данные секвенирования единичных клеток радиальной глии, показала, что большая часть клеток PGL13 (91%) имеет корреляции с экспрессионными маркерами радиальной глии (все три кластера). Согласно базе данных scCATCH, основная часть клеток в культуре PGL13 определяется как раковые стволовые клетки (55%) и мезенхимальные стволовые клетки (35%). Таким образом, клетки PGL13 имеют профили экспрессии наиболее схожие с клетками нервной ткани и экспрессируют маркеры стволовых клеток. Полученные результаты согласуются с эволюционным происхождением параганглиом от мультипотентной мезенхимальной стволовой клетки. Также для клеток PGL3 выполнен анализ динамических молекулярных изменений - фаз клеточного цикла и траекторий. Показано, что большая часть клеток находилась в G1-фазе (53%), что указывает на ее удлинение и может быть ассоциировано с потерей недифференцированного фенотипа клеток и индукцией дифференцировки. Анализ траекторий показал, что дифференцировка стволовых клеток (или клеток предшественников) в понимании псевдовремени начинается со второго кластера и через третий кластер переходит в первый, что согласуется с клеточной аннотацией. Исследование мутационного профиля культуры клеток PGL13 проведено на основе полноэкзомного секвенирования на платформе Illumina. В результате идентифицировано более 11 тысяч вариантов, включающие мутации миссенс, нонсенс и сдвига рамки считывания; 242 варианта были классифицированные как потенциально патогенные согласно разработанному скору патогенности, учитывающему популяционную частоту, клиническую значимость, консервативность позиции и предсказательную силу in silico алгоритмов. Согласно критериям ACMG-AMP, выявлен один патогенный вариант в гене IGSF3; вероятно патогенные варианты идентифицированы в генах DHH, EXOSC8, SERPINA1, TYR и NQO1. В клеточной культуре PGL13 не выявлено мутаций в известных генах предрасположенности к параганглиомам/феохромоцитомам. Установлен статус мутаций (герминальные/соматические), а также выполнено профилирование соматических мутаций для части образцов выборки. Герминальные и соматические варианты в известных генах восприимчивости к параганглиомам/феохромоцитомам и генах-кандидатах (SDHx, SDHAF3, TP53, PC, TERT и др.) выявлены в 65% случаев, в то время как соматические мутации в новых генах идентифицированы только у 23% пациентов с КПГ. Гены SDHD и SLC25A14 характеризовались значительным числом соматических мутаций при КПГ. Нарушения в этих генах ассоциированы с митохондриальной дисфункцией, которая способствует развитию параганглиом. Также идентифицированы три мутационные сигнатуры, ассоциированные с КПГ: SBS1, SBS5 и SBS29. Более половины идентифицированных соматических мутаций связано с сигнатурой SBS5, которая является возраст-ассоциированной однако характеризуется неизвестной этиологией.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Проведено исследование влияния идентифицированных мутаций в драйверных генах SDHx на стабильность SDH комплекса и экспрессию субъединиц сукцинатдегидрогеназы с использованием метода иммуногистохимии в репрезентативной выборке каротидных параганглиом (КПГ). Мутации в генах SDHx выявлены в 49% каротидных параганглиом: SDHA (1%), SDHB (13%), SDHC (6%), SDHD (30%). Согласно классификации ACMG/AMP 2015, в генах SDHx идентифицировано 22 патогенные мутации, одна вероятно патогенная мутация в гене SDHD, встречающаяся с высокой частотой среди российских пациентов (p.H102R), и 16 вариантов с неопределенной значимостью. Отрицательное или слабое диффузное окрашивание субъединицы SDHB наблюдалось в 77% КПГ с патогенными мутациями в генах SDHx, что свидетельствует об их негативном влиянии на стабильность комплекса сукцинатдегидрогеназы, при этом одни и те же патогенные варианты у разных пациентов оказывают одинаковый эффект. Частая вероятно патогенная миссенс мутация p.H102R в гене SDHD ассоциирована с изменением экспрессии субъединиц SDHB или SDHC, что также указывает на структурные нарушения в сукцинатдегидрогеназе. Для 70% вариантов с неопределенной значимостью выявлено нарушение паттерна окрашивания SDHB субъединицы, свидетельствующее об их потенциальном патогенном действии. С использованием метода газовой хроматографии с масс-спектрометрией, проведен анализ отношения сукцината к фумарату в исследуемых образцах КПГ. Определено, что при мутациях в генах SDHx происходит увеличение содержания сукцината примерно в 5 раз по сравнению с не мутантными опухолями. На основе этих данных подтвержден потенциальный патогенный эффект еще трех вариантов с неопределенной значимостью, а также мутации SDHD:p.H102R. Полученные данные позволяют провести реклассификацию патогенности ряда SDHx вариантов и повысить их статус до патогенных или вероятно патогенных. Оба исследуемых подхода (ИГХ SDHB и отношение сукцинат/фумарат) имеют близкие параметры клинической информативности. Исследована потеря гетерозиготности в импринтируемом локусе 11p15.5 в опухолях с мутациями в генах SDHx с использованием микросателлитных повторов. В SDHD-ассоциированных опухолях потеря гетерозиготности локуса 11p15.5 обнаружена в 86% случаев, при этом в половине опухолей (как с соматическими, так и с герминальными мутациями) наблюдалась потеря целой хромосомы 11. В опухолях с мутациями в других генах SDHx - SDHA, SDHB и SDHC, также наблюдалась потеря гетерозиготности локуса 11p15.5. Таким образом, частая потеря участка 11p15.5 свидетельствуют о его важной роли в развитие SDHx-мутантных КПГ, при этом потеря локуса может происходить в результате делеции, потери короткого плеча хромосомы 11 или целой хромосомы. Получено 33 первичные клеточные культуры КПГ, оптимизированы условия их культивирования. Иммортализованные культуры (PGL13 и PGL21) охарактеризованы фенотипически с использованием иммуноокрашивания специфическими антителами к разным типам клеток. Культура PGL21 характеризовалась интенсивной экспрессией маркеров стволовых нейрональных и мезенхимальных клеток – NGFR и DLK1, мультипотентных нейрональных стволовых клеток - SOX2. В то же время все клетки экспрессировали белок синаптических везикул SYP, глиальный фибриллярный белок GFAP, а также характеризовались дифференциальной экспрессией TH – маркера катехоламинэргических нейронов и эндокринных клеток. Экспрессия маркеров перицитов (PDGFRβ) и эндотелиальных клеток (CD31) практически отсутствовала. Одновременная экспрессия SYP, GFAP и SOX2 свидетельствует о том, что клетки относятся к нейрональной линии, которые также могут коэкспрессировать маркер мезенхимальных стволовых клеток (DLK1), что согласуется с полученными нами данными. При обработке клеток PGL21 дексаметазоном, наблюдалось повышение экспрессии TH, что подтверждает их нейроэндокринное происхождение. Клетки культуры PGL13 характеризовались экспрессией как зрелых маркеров нейроэндокринных клеток (SYP и GFAP), так и маркеров эмбриональных, нейрональных и мезенхималных стволовых клеток (SOX2, NGFR и DLK1) и нейрональных прогенеторных клеток (NESTIN). В отличии от культуры PGL21, в PGL13 наблюдалась экспрессия маркера эндотелиальных клеток CD31 и слабая цитоплазматическая экспрессия маркера перицитов PDGFRβ. Кроме того, клетки PGL13 формировали области 3D роста. Полученные результаты подтверждают высокий уровень мультипотентности опухолевых клеток КПГ в культуре и вариабельность экспрессии различных фенотипических маркеров. Исследован механизм развития редкой параганглиомы с герминальной мутацией p.S249R в гене FH. С использованием микросателлитных маркеров показано, что в опухоли произошла соматическая потеря второй нормальной копии аллеля гена FH, что подтверждает его функционирование в качестве гена-супрессора опухолевого роста. Также в опухоли выявлено снижение активности фумарат гидратазы, что свидетельствует о патогенным эффекте варианта FH:p.S249R на функцию белка.