КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер 21-14-00382

НазваниеСтруктура и метаболизм люциферина биолюминесцентных энхитреид Henlea sp.

РуководительДубинный Максим Анатольевич, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2021 г. - 2023 г.

Конкурс№55 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словаБиолюминесценция, химия биолюминесценции, светящиеся черви, биолюминесцентные олигохеты, биолюминесцентные энхитреиды, Henlea, люциферин, люцифераза, биолюминесцентная система

Код ГРНТИ34.15.00

СтатусУспешно завершен

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
Биолюминесценция (БЛ) - автономное свечение живых организмов за счет протекающих в клетке биохимических реакций. Во всех известных на сегодняшний день биолюминесцентных системах люцифераза (фермент) катализирует процесс окисления люциферина (низкомолекулярный субстрат) молекулярным кислородом. При этом хромофор (окисленный люциферин либо другая молекула) переходит в возбужденное состояние, а возвращение его в основное состояние сопровождается испусканием видимого света. В природе известно более 40 независимо возникших в процессе эволюции БЛ систем с различными люциферинами, люциферазами, механизмами окисления и испускания света. На сегодняшний день всего для десяти БЛ систем известны структуры люциферинов. Из них три были установлены нашей группой в течение последних 6 лет: люциферин сибирских почвенных червей Fridericia heliota (Petushkov et al. 2014), люциферин высших грибов (Purtov et al. 2015) и люциферин морской полихеты Odontosyllis (Kotlobay et al. 2019). Гены, кодирующие ферменты люцифераз, установлены для шести БЛ систем, из них две люциферазы были клонированы в течение последних двух лет с участием нашей группы (Schultz et al. 2018; Mitani et al. 2018; Kotlobay et al. 2018). Лишь для восьми БЛ систем проведен полный химический синтез люциферина, а люциферины динофлагеллят и Бермудских многощетинковых червей Odontosyllis пока не синтезированы Только четыре БЛ системы в настоящее время широко используются в различных аналитических и биомедицинских приложениях (Kaskova et al. 2016), но это те системы, для которых люциферин был синтезирован и люцифераза была клонирована до конца 20 века. Все гены биосинтеза люциферина установлены для двух БЛ систем: бактериальной и высших грибов, и единственная БЛ система высших грибов позволяет клонировать автономную биолюминесценцию в эукариотические организмы. Люцифераза высших грибов была клонирована нашей группой (Kotlobay et al. 2018) вместе с полным набором генов биосинтеза люциферина, что позволило создать автономно светящиеся растения (Mitiouchkina et al. 2020). Расширение списка биолюминесцентных инструментов новой уникальной БЛ системой энхитреид Henlea sp. является основной целью данного проекта. Биолюминесцентная система Henlea sp. не дает кросс-реакций с компонентами других известных биолюминесцентных систем, что говорит о ее новизне. Изучение таких систем всегда полно неожиданностей и требует нестандартных подходов. Люминесценция Henlea sp. локализована как в целомических клетках выделяемой червями слизи, так и в люминесцентных образованиях на кутикуле. Спектр люминесценции Henlea sp. имеет максимум в области 464 нм. В настоящий момент усилиями нашей группы установлено, что биолюминесцентная реакция Henlea sp. протекает с участием низкомолекулярного люциферина, люциферазы массой приблизительно 80 кДа, кислорода и ионов кальция. Вероятным участником реакции является низкомолекулярный кофактор (активатор биолюминесценции), который предположительно играет роль хромофора, ответственного за излучение кванта света (Petushkov and Rodionova 2018). Нами только что определена химическая структура неактивного аналога люциферина Henlea sp., выделенного из тех же организмов. Это α-C-маннозилтриптофан (ManTrp): необычный С-гликозид, в котором остаток маннозы соединен с С2 углеродом индольного кольца триптофана углерод-углеродной химической связью (Dubinnyi et al. 2020). ManTrp - хорошо известный метаболит человека, млекопитающих, асцидий и губок. На основе имеющихся данных мы предполагаем, что люциферин Henlea sp. является С2-производным триптофана, в котором вместо остатка маннозы находится другой углеводный фрагмент, что еще раз подтверждает уникальность структуры люциферина Henlea sp. В процессе работы над проектом мы планируем: 1. Методами ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии установить химические структуры люциферина и кофактора(ов) биолюминесцентной реакции Henlea sp.; 2. Методом встречного синтеза разрешить структурные неоднозначности, неизбежные при анализе данных ЯМР и МС, в структурах люциферина и кофактора(ов) биолюминесцентной реакции Henlea sp. Однозначно подтвердить структуру люциферина Henlea sp.; 3. Продемонстрировать биолюминесценцию in vitro с участием синтетического люциферина и кофакторов. Провести ферментативное окисление синтетического люциферина, выделить и установить структуру оксилюциферина Henlea sp. Исследовать механизм биолюминесценции Henlea sp.; 4. Секвенировать транскриптом Henlea sp., выделить и очистить люциферазу Henlea sp., установить аминокислотную последовательность люциферазы, клонировать ген люциферазы.

Ожидаемые результаты
Биолюминесцентная система Henlea sp. была впервые описана в научной литературе в 2002 году (Petushkov et al. 2002; Rodionova et al. 2002; Petushkov and Rodionova 2005, 2018; Rodionova and Petushkov 2019; Dubinnyi et al. 2020) и с тех пор ее изучение было исключительным приоритетом нашей группы. Это связано со специфическим ареалом обитания биолюминесцентных энхитреид, точные границы которого пока не определены. Два близких вида, названные именами наших исследователей, обитают в Сибири: Henlea petushkovi - в Иркутской области, а Henlea rodionovae - в Красноярском крае (Rota et al. 2018). Исследование уникальной БЛ системы Henlea sp. идет поэтапно, по мере сбора биомассы. В настоящем проекте мы имеем хороший задел в этой теме и планируем довести изучение БЛ Henlea sp. до логического завершения, а именно: 1. Мы установим химическую структуру низкомолекулярного кофактора (активатора БЛ), который многократно увеличивает интенсивность БЛ in vitro (Petushkov and Rodionova 2018) и предположительно является хромофором, ответственным за испускание кванта света. В ходе выполнения проекта РФФИ 19-04-00348-а нами предложена вероятная брутто-формула активатора - C16H17N3O7, точная структурная формула будет установлена на основании данных ЯМР и подтверждена встречным синтезом. 2. Мы установим химическую структуру люциферина Henlea sp. и подтвердим её встречным синтезом c демонстрацией БЛ in vitro в реакции с природной люциферазой, кислородом, ионами кальция и кофактором (активатором БЛ). Предварительные данные свидетельствуют, что люциферин Henlea - C2-производное аминокислоты триптофана (Dubinnyi et al. 2020), ни один из известных люциферинов не является C2-производным триптофана. В 2013 году был обнаружен фермент маннозилтрансфераза DPY19, который отвечает за биосинтез одного из C2-производных триптофана (α-C-маннозилтриптофана) (Buettner et al. 2013; Niwa et al. 2018) в нематодах C.elegans и у высших млекопитающих, включая человека. По этой причине мы считаем данную БЛ систему перспективной для создания еще одной (второй после высших грибов) автономной биолюминесцентной системы эукариот и для разработки аналитических инструментов на основе биолюминесценции предназначенных для визуализации клеточных процессов в высших млекопитающих. 3. Мы проведем ферментативное окисление синтетического люциферина Henlea sp., выделим продукт окисления, установим его структуру методом ЯМР и МС. Неоднозначности экспериментальных данных разрешим подтвердив структуру оксилюциферина встречным синтезом. На основании химической структуры люциферина и оксилюциферина мы предложим детальный молекулярный механизм ферментативного окисления люциферина. 4. Мы проведем синтез, секвенирование и сборку транскриптома как минимум одного червя из рода Henlea. Параллельно мы проведем последовательную очистку люциферазы Henlea путем сочетания хроматографических методов и электрофореза, далее методом LC-HRMS определим фрагменты аминокислотной последовательности, достаточные для их идентификации в транскриптоме. После чего будет определена первичная нуклеотидная последовательность люциферазы и/или вариантов кандидатных генов. 5. Мы предложим пути биосинтеза люциферина и низкомолекулярного кофактора (активатора БЛ), проведем поиск интермедиатов биосинтеза люциферина и кофактора БЛ в экстракте Henlea sp. методами масс-спектрометрии и ЯМР спектроскопии. Мы проверим активность возможных биосинтетических прекурсоров люциферина и кофактора БЛ путем добавления в экстракт Henlea sp. соответствующих компонент. Результаты работы будут опубликованы в ведущих научных журналах, таких как журналы Nature Publishing Group, Journal of American Chemical Society, Angewandte Chemie, Photochemical and Photobiological Sciences, Biochemistry, PNAS и др. Пионерский характер проекта и его новизна обеспечивают полные возможности патентной защиты всех практически значимых результатов, связанных с использованием новой биолюминесцентной системы (новый люциферин, люцифераза, кофактор БЛ и способы их применения) для разработки разнообразных систем биоимиджинга.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---