Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Для сопоставления с ранее изученными эффектами ингибирования продуцента сукцинил-КоА, 2-оксоглутаратдегидрогеназы (ОГДГ), в 2021 году изучили влияние ингибирования продуцентов ацетил- и глутарил-КоА, дегидрогеназ пирувата (ПДГ) и 2-оксоадипата (ОАДГ), соответственно, на метаболические индикаторы мозга, поведение и ЭКГ экспериментальных животных. С этой целью были синтезированы этерифицированные и заряженные формы фосфоновых аналогов пирувата и 2-оксопимелата, являющихся специфическими ингибиторами ПДГ и ОАДГ, соответственно. В качестве метаболических индикаторов ингибирования продуцентов ацил-КоА в коре мозга определяли активности самих продуцентов, функционально связанных с продуцентами и ацилируемых ферментов центрального метаболизма, аминокислотный профиль, экспрессию сиртуинов 3 и 5, различные типы общего ацилирования и ацилирования наиболее представленных белковых полос. Сравнение дозо-зависимостей действия ингибиторов на исследованные параметры показало двухфазный ответ метаболизма коры мозга и физиологических параметров животных на рост ингибирования. Эта особенность более выражена для физиологического действия по сравнению с метаболическими индикаторами и для ОАДГ и ОГДГ по сравнению с ПДГ. Бифазность происходящих при усилении ингибирования ПДГ и ОАДГ в мозге процессов подтверждена и мультипараметрическим анализом PLS-DA: для обоих ингибиторов наблюдали более выраженное отделение от контрольной группы при обработке животных низкими, а не высокими, дозами. При этом показана значительная устойчивость метаболизма к ингибированию продуцента ацетильных остатков ПДГ, тогда как ингибирование продуцентов заряженных ацил-КоА (ОАДГ и ОГДГ) сопряженно влияет практически на все исследованные ферменты. Данная особенность хорошо объясняется существованием механизма регуляции ПДГ (де)фосфорилированием, отсутствующим у ОАДГ и ОГДГ, поскольку система обратимой модификации ПДГ фосфорилированием в значительной степени подстраивает функцию ПДГ под метаболические потребности в зависимости от внешних факторов, к которым можно отнести и введение ингибиторов. С другой стороны, мы обнаружили существенные изменения уровней активности центральных митохондриальных дегидрогеназ ПДГ и ОГДГ при специфическом ингибировании ОАДГ. Одновременно при ингибировании ОАДГ мы показали изменение ацетилирования и сукцинилирования белков, сопровождающееся комплементарными изменениями экспрессии сиртуинов 3 и 5. Такие изменения могут свидетельствовать об участии пост-трансляционного ацилирования во взаимной регуляции комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот. Это предположение соответствует и результатам мультипараметрического анализа, показавшего определяющую роль ОАДГ активности в разделении контрольной и обработанной высокой дозой ингибитора ПДГ животных. При этом уровень общего ацетилирования в коре больших полушарий является параметром, определяющим разделение контрольной и обработанной низкой дозой ингибитора ПДГ групп животных. Высокий вклад в разделение данных групп вносят и уровни γ-аминобутирата и валина. Совместный вклад уровней ацетилирования и аминокислот в наиболее выраженные отклонения параметров при ингибировании ПДГ показывает роль ацетилирования белков мозга в метаболизме аминокислот, что хорошо согласуется с нашим предыдущим результатом о роли ацетилирования в регуляции функции ключевого фермента метаболизма аминокислот - глутаматдегидрогеназы. Охарактеризованное в 2021 г. влияние функционального состояния ОАДГ на активности ПДГ и ОГДГ, сопряженное с изменениями системы ацилирования мозга, может объяснять известную роль ОАДГ в таких общих показателях метаболизма как диабет, ожирение и дыхательная функция митохондрий, не понятную с точки зрения очень малого и тканеспецифичного субстратного потока через ОАДГ (в норме концентрация 2-оксоадипата на несколько порядков ниже концентраций пирувата и 2-оксоглутарата). Связь функции ОАДГ с системой клеточного ацилирования подтверждается результатами мультипараметрического анализа, который идентифицировал показатели, определяющие различие групп животных, обработанных ингибитором ОАДГ. При низкой дозе ингибитора таким параметром является уровень сиртуина 3, а также уровни аминокислот β-аминоизобутирата и триптофана. При высокой дозе - активности глутаминсинтазы и ОГДГ, уровни β-аминоизобутирата и β-аланина в совокупности с уровнем тревожности, определяемым по числу актов груминга. Исследование изменений в паттернах ацилирования белков при ингибировании отдельных продуцентов ацил-КоА с помощью иммуноблоттинга показало отсутствие существенной конкуренции между реакциями ацилирования разных типов in vivo. Характеристика и сравнительный анализ изменений в ацилирование белков, определяемых методом иммуноблоттинга и с помощью масс-спектрометрии, позволили оценить маркерную роль ацилирования в модели нейропатологии. В животной модели индуцируемых ПТЗ эпилептических приступов были обнаружены достоверные изменения ацилирования белков мозга при судорогах. В ходе масс-спектрометрического анализа выявлены отдельные белки, ацилирование которых может быть потенциальным маркером типа приступа (одиночный или хронические). В целом, сравнение результатов иммуноблоттинга и масс-спектрометрии не выявило корреляций между изменениями ацилирования белков определенной молекулярной массы, определяемых двумя методами. Например, с помощью иммуноблоттинга для полосы, содержащей набор белков с молекулярной массой 50 кДа, наблюдали рост ацетилирования после судорог, в то время как отдельный белок данной массы показывал падение ацетилирования специфического остатка лизина, определяемое по данным масс-спектрометрии. Можно заключить, что суммарный эффект на ацетилирование белков определенной массы по иммуноблоттингу не исключает противоположные изменения ацетилирования отдельных белков данной массы, которые могут быть определены с помощью масс-спектрометрии. В ходе масс-спектрометрического исследования белков коры мозга в животной модели эпилепсии были также идентифицированы белки, пептиды которых подвергаются разным типам ацилирования по одному и тому же остатку. Данные белки представляют интерес с точки зрения более точного изучения вопроса о потенциальном регуляторном значении конкуренции разных типов ацилирования. Предварительные результаты масс-спектрометрической оценки уровней ацилирования не исключает такой конкуренции в отдельных случаях, однако высокие межиндивидуальные различия в ацилировании белковых остатков не позволили получить достоверных отличий в исследованных выборках. Найденные пептиды предоставляют возможности для дальнейшего изучение вопроса о существовании и регуляторном значении конкурирующих реакций ацилирования по специфическим сайтам, однако полученные результаты показывают, что такая конкуренция не является универсальной для всех белков и сайтов ацилирования.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Моделирование метаболических нарушений при введении животным антидиабетика метформина совместно с антипаразитарным препаратом ампролиумом показало значимое изменение ряда исследуемых физиологических и биохимических параметров, подтверждающее известное из опытов in vitro ингибирование этими препаратами внутриклеточного транспорта тиамина. Критический вклад в возникающзие различия вносят: ацетилирование белков мозга, экспрессия 2-оксоадипатдегидрогеназы (ОАДГ), активность 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса (ОГДК) и содержание ацетил-р53. При создании дисфункции дегидрогеназ 2-оксокислот за счет введения тиаминового антагониста окситиамина наибольший вклад в различия вносят: экспрессия и активность ОАДГ, содержание тиаминдифосфата и акты груминга. Значение ОАДГ, по-видимому, связано с зависящим от нее глутарилированием, которое может регулировать и функцию пируватдегидрогеназного компекса (ПДК) (Карлина и др., 2022 http://rusbiochem.org/sbornik_tezisov.html; Boyko et al., 2022 https://doi.org/10.3389/fmed.2022.896263). Таким образом, в соответствии с разными механизмами вызываемых нарушений тиаминового метаболизма и общностью вызываемой ими дисфункции ТДФ-зависимых дегидрогеназ, действие метформина/ ампролиума и окситиамина имеет как специфические, так и общие параметры, определяющие отклонение от нормы. Для улучшения фармакологических способов регуляции глутарилирования сравнили влияние разных эфиров и неэтерифицированного ингибитора ОАДГ. Показана большая эффективность ингибирования при росте гидрофобности заместителя. С другой стороны, эффективность мембранопроницаемого и заряженного ингибитора не отличалась (Bunik et al., 2022 https://doi.org/10.3389/fchem.2022.892284). Очевидно, разница в их внутриклеточной проницаемости компенсируется необходимостью перевода этерифицированного предшественника в заряженную форму. Изучение влияния серии новосинтезированных аналогов пирувата показало, что наиболее сильным ингибитором in vivo является ацетилфосфинат, действие которого затрагивает ацетилирование и сукцинилирование низкомолекулярных белков мозга, включающих гистоны (Алешин и др., 2023, Artiukhov, Aleshin et al. 2022 https://doi.org/10.3390/ijms232113186). Изменение ацетилирования этой фракции белков соответствует эпигенетическим изменениям, которые возникают у взрослых особей, испытавших внутриутробный метаболический стресс, моделируемый ингибированием ОГДК (Graf et al., 2022 https://doi.org/10.3390/ijms23052579; Graf et al 2021 https://doi.org/10.3389/fmed.2021.751639). Показан бифазный ответ ацилирования белков мозга с ростом степени ингибирования дегидрогеназ 2-оксокислот. В то время как при повышении дозы ингибитора многие биохимические параметры мозга возвращаются к контрольному уровню после первичной пертурбации, ряд ключевых параметров системы ацилирования изменяется по сравнению с контролем, что сопряжено с физиологическими изменениями (Artiukhov, Graf et al., 2022 https://doi.org/10.3390/ph15020182; Алешин и др., 2023). Влияние специфичных ингибиторов ОАДГ (адипоилфосфонат, АФ) и ОГДГ (сукцинилфосфонат, СФ), на ацетилирование, сукцинилирование и глутарилирование белков было исследовано с использованием клеточных линий U251-MG, А549 и MCF7, различающихся по уровню экспрессии кодируемой геном DHTKD1 ОАДГ. Одновременно анализировали влияние такого ингибирования на экспрессию ОАДГ и деацилазы отрицательно заряженных ацилов SIRT5. Суммарное ацетилирование всех белков при ингибировании значимо не менялось, однако наблюдали достоверные изменения ацетилирования отдельных белковых полос. Обнаружены изменения сукцинилирования и – в клетках А549 - глутарилирования белковых полос в области молекулярных масс гистонов. Это позволяет предположить транскрипционную активацию компенсаторного ответа на ингибирование ОГДК и ОАДК. Изменения экспрессии деацилазы SIRT5 обнаружены лишь между клетками U251-MG, обработанными СФ и АФ. Охарактеризованы изменения уровня ацилирования белков мозга в результате одиночных и хронических судорог (Zavilejsky et al., 2022 https://doi.org/10.3390/ijms232012302; Завилейский и др., 2022 http://rusbiochem.org/sbornik_tezisov.html). Достоверно определены 43 модификации ацилированием в 29 белках коры мозга крыс, общие для исследуемых в моделях одиночного приступа и хронической эпилепсии групп животных. Уровень большинства модификаций не коррелировал с уровнем NAD+ или экспрессией SIRT3, но коррелировал положительно с экспрессией SIRT2 и активностью ОАДК, и отрицательно – с экспрессией SIRT5. По сравнению с контрольной группой, ацилирование 14 сайтов в 11 белках значительно отличается после индукции судорог. При этом 6 из этих 11 белков относились к метаболическим путям выработки энергии включая гликолиз. Мозг животных после одиночного и хронических приступов не демонстрировал значимых отличий в ацилировании белков, активности ПДК, экспрессии SIRT2 или уровне NAD+. Напротив, экспрессия SIRT3, SIRT5 и активность ОГДК понижались после хронических судорог по сравнению с одиночным приступом. Таким образом, мы обнаружили вовлеченность ОГДК и SIRT5 в метаболические изменения, вызываемые хроническими судорогами. Конкуренция между ацетилированием и глутарилированием показана как на уровне одного остатка лизина в конкретном белке (CN37), так и по отрицательным корреляциям между данными модификациями разных сайтов/белков. Однако конкуренция не является обязательной. Полученные результаты свидетельствуют о контроле ацилирования белков не только «ацилирующим потенциалом», но и внутриклеточной локализацией белков и их реактивностью к ацил-СоА, а также подтвеждают ключевую роль ОАДК в глутарилировании белков мозга (Zavilejsky et al., 2022 https://doi.org/10.3390/ijms232012302; Завилейский и др., 2022 http://rusbiochem.org/sbornik_tezisov.html). Белок р53 и его ацетилированную форму с использованием специфических к данным белкам антител определяли в (1) гомогенатах мозга контрольных животных и животных после введения окситиамина или ингибиторов транспорта тиамина; (2) при моделировании хронической эпилепсии введением пентилентетразола; (3) при краткосрочном введении животным ингибиторов ОГДК или ОАДК и (4) инкубации клеток с этими ингибиторами. Обнаружили высокую иммунореактивность к антителам на р53 и ацетил-К379-р53 у белковых полос около 15 кДа, слабо реагировавших и с антителами на фосфо-S392-р53. Анализ распределения модификаций в последовательности р53 (Zavilejsky & Bunik, 2022 https://doi.org/10.3390/biom12020327) показывает, что наблюдаемая нами масса около 15 кДа соответствует наиболее ацетилированному и малоструктурированному С-концевому участку р53 длиной около 100 аминокислот. Количественная оценка суммарной иммунореактивности к ацетил-К379-р53, р53 и их отношение показали рост уровня ацетилирования экспрессируемого р53 при обработке животных метформином/ампролиумом и отсутствие такого роста после введения окситиамина, вызывающего пропорциональное увеличение как ацетил-К379-р53, так и немодифицированной формы. В модели хронических эпилептических приступов содержание в мозге ацетил-К379-р53 и уровень ацетилирования экспрессируемого р53 уменьшался без значимого изменения экспрессии р53. При введении животным ингибиторов ОГДК и ОАДК уровень р53 после эфира СФ был достоверно выше, чем после эфира АФ, тогда как содержание ацетил-К379-р53, а также отношение ацетил-К379-р53/р53 достоверно не менялись. В культурах клеток с разной экспрессией ОАДГ и разным функциональным состоянием р53 отличались и ответы р53 и его ацетилирования на ингибирование ОГДК и ОАДК. Таким образом, в ходе проведенных в 2022 г. работ охарактеризован вклад дегидрогеназ 2-оксокислот мозга в разные типы ацилирования белков включая ацетилирование р53 и обнаружены связи функции этих ферментных комплексов с экспрессией деацилаз.