Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Изучение плацентарных аналогов и оогенеза (см. Приложение 1, 2 Дополнительные материалы) Сравнительные анатомические и ультраструктурные исследования были выполнены на трех видах циклостомных мшанок из класса Stenolaemata: Tubulipora sp. (Tubuliporidae), Disporella hispida и Patinella verrucaria (Lichenoporidae). Использование гистологических срезов позволило детально описать развитие и строение плацентарных аналогов у перечисленных выше видов, а именно – в первую очередь, изменение формы и размеров питающей ткани (начинающей осуществлять транспортную и синтетическую функции) на разных этапах развития. Питающая ткань в гонозооидах – специализированных полиморфах, выполняющих роль инкубационных камер, у исследованных видов циклостомат имеет комплексное происхождение и сложную структуру. Она формируется из клеток овария и мембранной сумки, окружающих фрагментирующийся первичный эмбрион и развивающиеся вторичные эмбрионы. Данная ткань состоит из ценоцитов (многоядерных клеток, образовавшихся в результате многочисленных ядерных делений и роста исходной одноядерной клетки) и одиночных клеток неизвестного происхождения. В результате роста питающая ткань занимает все пространство внутри гонозооида, находясь в состоянии постоянной реорганизации, о чем свидетельствуют многочисленные автофагосомы. Источником его роста и обновления, по-видимому, являются обнаруженные нами крупные одиночные клетки с большими ядрами и электронно-плотной цитоплазмой. В целом функционирующая питающая ткань имеет вид трехмерной сети, преимущественно состоящей из ценоцитов, различающихся по своим ультраструктурным характеристикам (электронная плотность цитоплазмы, содержание органелл), а также одиночных клеток. У лихенопорид питающая ткань содержала бактерий. Судя по общей морфологии и цитологическим характеристикам, основные функции плацентарных аналогов циклостомат заключаются в обеспечении постоянного двунаправленного транспорта веществ между развивающимися эмбрионами и псевдоцелем за счет трансцитоза и интенсивного синтеза питательных веществ. Субмембранные пузырьки, указывающие на наличие эндоцитоза, обнаружены в периферических клетках ранних эмбрионов. Для всех трех исследованных видов циклостомных мшанок впервые было установлено образование эмбрионов третьего порядка. От первичного зародыша отделяются вторичные зародыши, за счет которых, в свою очередь, формируются третичные, развивающиеся в личинок. В каждом функционирующем гонозооиде присутствовало несколько сайтов образования ранних третичных зародышей. У Tubulipora sp. делящийся вторичный зародыш имел вид крупной (размером более двух ранних личинок) клеточной массы неправильной формы без полостей и слоев. Ранние вторичные и третичные зародыши представляли собой компактные морулы округлой или овальной формы без полостей или отчетливых клеточных слоев. Дальнейшее развитие третичных (и, возможно, некоторых вторичных) зародышей включает деламинацию, ведущую к образованию внешнего слоя бластомеров и внутренней клеточной массы. В ходе трансформации аутозооида в гонозооид все мышечные элементы, включая кольцевые мышечные волокна мембранной сумки, принимающей участие в формировании плацентарного аналога, дегенерируют. Фуникулярная система отсутствует. Трехмерная сеть клеток, обнаруженная в псевдоцеле, сохраняется и может участвовать в проведении веществ от интерзооидальных пор к плаценте. Детали анатомии женской гонады и ультраструктуры оогенеза были исследованы у двух видов хейлостомных мшанок (Arctonula arctica и Callopora craticula) со схожими репродуктивными паттернами. Были описаны форма и характер распределения фолликулярных клеток разных типов в разных участках овариальной стенки, а также положение и содержание органелл в клетках овария и ооцитов. Особое внимание было уделено изменениям этих характеристик в ходе вителлогенеза. Исследования микроанатомии и ультраструктуры наружного (паллиального) эпителия аборальной полусферы (эписферы) личинок шести видов (Electra pilosa, Tendra zostericola, Juxtacribrilina annulata, Flustrellidra hispida, Alcyonidium hirsutum и Patinella verrucaria) показали что (1) различия в строении этой части эпителия коррелируют с особенностями биологии личинок, и, у вынашивающих форм, с особенностями строения выводковых структур; (2) число различных типов клеток паллиального эпителия варьирует у личинок разных филогенетических линий мшанок. Было показано, что в разных линиях вынашивающих мшанок независимо происходило частичное или полное погружение паллиального эпителия, сопровождающееся увеличением площади ресничного локомоторного кольца (короны). Мы предположили, что у определенных типов личинок мшанок погружение паллиального эпителия и сопутствующее развитие широкой локомоторной короны, обеспечивает (1) сохранение размеров личинки по отношению к размерам зиготы и/или объему выводковой камеры на протяжении постэмбрионального развития, (2) быстрый выход крупных лецитотрофных личинок через небольшое отверстие инкубационной камеры и (3) эффективное плавание и ползание личинок по субстрату в поисках подходящего места для метаморфоза за счет гипертрофированного ресничного эпителия. Мы также предполагаем, что у вынашивающих форм развитие широкой короны способствовало более эффективному поступлению питательных веществ из жидкости инкубационной полости, поскольку паллиальный эпителий покрыт кутикулой и, вероятно, менее пригоден для этой функции. Выдвигаемые нами гипотезы о независимых изменениях строения покровов личинок согласуются с идеями о многократном независимом возникновении вынашивания и эндотрофных личинок в типе Bryozoa. Исследования бактериальных симбионтов мшанок (см. Приложение 1, 2 Дополнительные материалы) В 2021 г. с целью изучения симбиотических систем мшанок и бактерий методами световой и трансмиссионной электронной микроскопии было собрано и зафиксировано для 13 видов мшанок из классов Gymnolaemata и Stenolaemata. В четырех видах гимнолемных мшанок (Eucratea loricata, Tricellaria gracilis, Tricellaria arctica, Terminoflustra membranaceotruncata) симбионты обнаружены не были. В аутозооидах остальных видов (Patinella verrucaria, Bicellariella ciliata, Bugulopsis peachii, Dendrobeania fruticosa, Aquiloniella scabra, Bugula neretina, Paralicornia sinuosa, Aspiscellaria frondis и Licornia peltata) симбиотические бактерии были найдены в фуникулярных телах (специализированных структурах в целоме аутозооида), которые можно рассматривать, как расширения участков фуникулярной системы. Фуникулярные тела демонстрируют динамику развития от структур небольшого размера с нормально функционирующими бактериями в дистально располагающихся зооидах до крупных тел в отдельных проксимальных зооидах, в которых происходит деградация бактерий и клеток стенки фуникулярного тела. В конце периода размножения (сентябрь, октябрь) практически все зооиды колоний исследованных видов мшанок содержат фуникулярные тела с деградирующими бактериями. Разрушение бактерий в зооидах D. fruticosa, A. scabra, B. neretina и P. sinuosa сопровождалось появлением вирусоподобных частиц, предположительно бактериофагов. На основании детального изучения зооидов A. scabra и их симбионтов предложен новый вариант инфицирования мшанок бактериями. В циклостомной мшанке Patinella verrucaria бактериальные симбионты найдены в клетках плаценты и в целомоцитах. Молекулярные исследования симбиотических бактерий P. verrucaria показали наличие трех возможных видов симбионтов, для которых характерна психрофильность. Молекулярно-генетические и биоинформатические исследования (см. Приложение 1, 2 Дополнительные материалы) Для улучшения сборки генома пресноводной мшанки Cristatella mucedo было проведено дополнительное секвенирование геномной ДНК на платформах Illumina и Oxford Nanopore. Использование полученных данных позволило реассемблировать геном C. mucedo с существенно лучшими метриками сборки. N50 = 16Мб, размер наиболее длинного контига равен 42Мб. Завершен анализ митохондриального генома Cristatella mucedo. C. mucedo характеризуется более консервативным порядком генов на митохондриальной ДНК, чем морские мшанки, и имеет структурную гомологию с Phoronida и другими Lophotrochozoa. Результаты работы подтверждают раннее отделение клады Phylactolaemata от остальных Bryozoa. По результатам работы опубликована статья в журнале Mitochondrion. Проведен анализ дифференциальной экспрессии генов в различных зонах колонии Cristatella mucedo. Полученные данные позволяют предполагать вовлеченность различных “генов развития” в регуляцию формирования новых модулей в зоне почкования. Неравномерный рост колонии не связан с формированием градиента дифференциально-экспрессирующихся генов. С целью анализа временного паттерна экспрессии генов в течение бластогенетического цикла полипидов морских и пресноводных мшанок были проведены две дополнительные серии выделений РНК из различных типов зооидов Crisiella producta, а также три серии выделений РНК из полипидов Cristatella mucedo, находящихся на различных стадиях бластогенетического цикла. После проверки качества выделенной РНК была проведена очистка от рибосомальной РНК, синтезированы библиотеки кДНК и проведено секвенирвание транскриптомов на платформе Illumina NovaSeq 6000. В настоящий момент ведется обработка полученных данных.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В 2022 г. было продолжено сравнительное исследование микроанатомии и ультраструктуры плацентарных аналогов Bryozoa, направленное на поиск доказательств неоднократного конвергентного возникновения плацентотрофии и выявление закономерностей формирования и функционирования плацент, в частности ультраструктурных механизмов, обеспечивающих двунаправленный обмен веществ между плацентой и эмбрионом. Для решения этих задач при помощи световой и трансмиссионной электронной микроскопии были изучены строение и функционирование плацент у трех видов ктеностомных мшанок из семейств Flustrellidrae, Vesiculariidae и Alcyonidiidae. Была описана общая анатомия выводковых камер и плацентарных аналогов, и выявлены различия в строении инкубационных камер и плацент, указывающие на независимое возникновение плацентотрофии. Для всех видов была детально описана ультраструктура клеток эмбриофора и поверхностных клеток эмбрионов на разных этапах вынашивания и выявлены ультраструктурные отличия и сходства в их строении и функционировании. Полученные ультраструктурные данные о динамике изменений, происходящих в плацентарных клетках в ходе инкубации, указывают на идущие в них активные процессы синтеза и транспорта питательных веществ. Были выполнены микроанатомические исследования элементов фуникулярной и мышечной систем у нескольких видов хейлостомат из семейств Bugulidae, Calloporidae, Flustridae и Candidae. Дополнительно в сравнительных целях были исследованы особенности микроанатомии и ультраструктуры овариев и герминальных клеток у трех видов гимнолемат. Также было выполнен обобщающий анализ результатов проекта, посвященных плацентарным аналогам Bryozoa. Была реконструирована интегральная картина эволюции матротрофных структур в пределах типа – выявлены основные направления морфологической эволюции, источники их возникновения и основные параметры функционирования. Было выдвинуто предположение, что общее число плацентарных таксонов среди мшанок значительно больше, чем считается. Кроме того, обнаружена корреляция между степенью гипертрофии клеток плаценты и типом оогенеза: хорошо развитые плацентарные аналоги характерны для видов с олиголецитальным оогенезом. С целью проверки гипотезы о влиянии вынашивания и плацентарного питания на строение личинок мы исследовали микроанатомию и ультраструктуру кишечника и его частей, а также покровы личинок и эмбрионов трех вынашивающих видов ктеностомных мшанок (Flustrellidra hispida, Alcyonidium hirsutum, Amathia imbricata), двух видов хейлостомных мшанок - вынашивающей Tendra zostericola и, для сравнительных целей – невынашивающей Electra pilosa, а также плацентотрофной циклостомной мшанки Patinella verrucaria. Были выявлены отличия в строении пищеварительной системы и покровов у развивающихся во внешней среде личинок E. pilosa и у личинок вынашивающих видов. Эти различия коррелируют с особенностями биологии личинок, и – у вынашивающих форм – с особенностями строения выводковых структур. Мы предположили, что у личинок вынашивающих видов с раковиной или плотной кутикулой над клетками паллиального эпителия (F. hispida, A.hirsutum) накопление питательных веществ происходит, по-видимому, на ранних стадиях развития зародышей в модифицированным щупальцевом влагалище, выполняющем функцию плацентарного аналога - либо за счет пино- и эндоцитоза через клетки наружного покрова с большим количеством микровиллей, либо на ранних стадиях развития зародышей путем поглощения веществ через стомодеум; у личинок вынашивающих мшанок A. imbricata и P. verrucaria в усвоении питательных веществ участвуют клетки широкой короны, покрывающие практически все тело личинки и несущие развитую сеть микровиллей. Выдвигаемые нами гипотезы о независимых изменениях строения покровов и кишечника личинок согласуются с идеями о многократном независимом возникновении вынашивания и эндотрофных личинок в типе Bryozoa. С помощью световой и электронной микроскопии выполнены исследования бактериальных симбионтов и организации несущих симбионтов тканей и органов у представителей семейств Bugulidae, Candidae, Eucrateidae, Flustrellidriidae. Выявлен характер взаимодействия бактерий с симбионт-специфическими клетками хозяев, приводящий к появлению симбиотических органов. Осуществлена работа по таксономии симбионтов с сочетанным использованием молекулярных методов работы с ДНК симбионтов и флуоресцентной in situ гибридизации у видов из классов Gymnolaemata и Stenolaemata. Исследована динамика структурных особенностей вирусоподобных частиц в бактериальных симбионтах. С помощью молекулярных методов начата работа по выявлению бактериофагов в видах мшанок, где были выявлены бактериальные симбионты, содержащие цитологические признаки вирусов. У большинства исследованных видов мшанок обнаружены симбиотические органы, обозначаемые как фуникулярные тела (ФТ). Форма тел у разных видов варьирует от овальной до сильно вытянутой. В центральной части ФТ находятся крупные скопления бактериальных клеток одного типа, характерные для конкретного вида мшанок. Стенка ФТ представлена двумя слоями клеток, кубоидальными внутренними с хорошо развитым шероховатым эндоплазматическим ретикулюмом, и уплощенными внешними, в цитоплазме которых белоксинтезирующий аппарат развит слабо. Внутренние клетки образуют многочисленные микровилли, заходящие в пространтсва между бактериями, внешние – контактируют с клетками фуникулярных тяжей. У исследованных в ходе проекта видов мшанок различные морфотипы бактерий были обнаружены в ФТ, щупальцах, клетках кишечника и целотелия, а также в пределах плацентарного аналога. Дополнительно проведенное исследование этого года выявило активные формы бактерий в целомоцитах. Они были идентичны бактериям, найденным ранее в клетках целотелия. Мы предполагаем, что в молодых зооидах целомоциты делятся, образуя клеточный чехол ФТ с бактериями в центре. Эта находка дает ответ на вопрос, как симбиотические бактерии могут распространяться в пределах колонии от ее проксимальных частей в апикальные, где осуществляется формирование новых зооидов. На наш взгляд, это возможно благодаря целомоцитам, способным к самостоятельному движению в полости зооида. Бактерии, находящиеся в вакуолях клеток хозяина, имеют вид функционирующих клеток, не имеющих каких-либо признаков лизиса. Была осуществлена сборка транскриптомов циклостомной мшанки Crisiella producta и филактолемной мшанки Cristatella mucedo. Сборка транскриптома C. producta на данный момент является первой для представителей подотряда Articulina. Нам удалось добиться относительно высоких показателей качества и полноты сборки референсного транскриптома C. producta (complete BUSCOs=95.9%, скорректированный на длиннейшую изоформу N50=1246 н.). Кроме того, была проведена предварительная оценка дифференциальной экспрессии генов для репродуктивных зооидов (гонозооидов) на разных стадиях развития. Анализ дифференциальной экспрессии генов у Cristatella mucedo выявил значительные изменения транскриптомного профиля в ходе индивидуального “онтогенеза” полипида. Полученные нами данные указывают на то, что как процесс развития почки полипида, так и дегенерация старого полипида сопряжены со значительными и масштабными изменениями в экспрессии генов, тогда как функционирующие полипиды разных возрастов представляют из себя фазу относительного “морфогенетического покоя”, во время которой изменения в экспрессии генов сравнительно невелики, либо вовсе не наблюдаются. Значительные изменения в экспрессии генов, выявленные нами в сравнении транскриптомных профилей зрелых функционирующих полипидов и “бурых тел” (дегенерирующих полипидов) предварительно подтверждают наше предположение о том, что не только развитие почек, но и дегенерация зрелых полипидов является сложным морфогенетическим процессом, находящимся под контролем со стороны транскрипционных факторов и других регуляторных механизмов.