КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 18-14-00354
НазваниеФункциональные свойства нового фермента человека – праймазы-полимеразы PrimPol
РуководительМакарова Алена Владимировна, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт", г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2021 г. - 2022 г. |
Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (28).
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология
Ключевые словаPrimPol, синтез ДНК, праймаза, повреждения ДНК, устойчивость к химиотерапии
Код ГРНТИ34.15.00
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Изучение ферментов синтеза ДНК, – ДНК полимераз (ДНКП), относится к числу наиболее актуальных направлений современной молекулярной биологии и является фундаментально значимым для понимания процессов, лежащих в основе поддержания стабильности генома, механизмов канцерогенеза и развития заболеваний, вызванных мутациями генетического материала. Настоящий проект обладает высокой научной новизной и направлен на исследование фермента репликации млекопитающих, открытого в 2013 году, – праймазы-полимеразы PrimPol человека. PrimPol – специализированной ДНКП, которая обладает одновременно ДНК-праймазной и ДНК-полимеразной активностями. Открытие PrimPol по праву можно считать одним из важнейших событий последних лет в области исследования репликации.
Долгое время считалось, что ни одна эукариотическая ДНКП не способна начать синтез ДНК de novo без затравки. Комплекс ДНКП альфа-праймаза (Pol alpha-праймаза) был единственным известным ферментом, который способен инициировать репликацию в ходе синтеза кроткого фрагмента РНК, комплементарного матричной цепи (РНК-праймера). PrimPol человека – это второй открытый фермент репликации с праймазной активностью. Однако PrimPol отличается от Pol alpha-праймазы способностью к инициации синтеза ДНК с использованием дНТФ. Эта особенность фермента может быть большим преимуществом, поскольку исключает необходимость удаления РНК-праймера из вновь синтезированной цепи ДНК. PrimPol является также специализированной ДНКП, которая осуществляет синтез на ДНК с повреждениями (синтез через повреждение), но обладает низкой точностью копирования ДНК. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что PrimPol играет ключевую роль в поддержании стабильности генома млекопитающих. Подавление экспрессии PrimPol в культуре клеток человека приводит к замедлению репликации, накоплению разрывов ДНК и хромосомной нестабильности. Предполагается, что PrimPol может осуществлять ре-инициацию репликации после остановки синтеза ДНК в участках, содержащих неканонические структуры (G-квадруплексы и шпильки) и повреждения, которые блокируют работу высокоточных ДНКП.
Исследования роли PrimPol в поддержании стабильности генома млекопитающих только начинаются. Не ясны механизмы переключения/регуляции ДНК-полимеразной и ДНК-праймазной активностей PrimPol. Не изучены механизмы регуляции PrimPol в клетке. Недостаточно охарактеризована биохимическая активность PrimPol. Не расшифрована полноразмерная структура PrimPol и не известен механизм праймазной активности PrimPol.
Целью данного проекта является анализ механизмов ДНК-полимеразной и праймазной активностей PrimPol человека. В ходе выполнения проекта будут решены следующие задачи:
1). Синтез ДНК олигонуклеотдов с 5’-трифосфатом и анализ роли 5’-трифосфата в образовании комплекса между PrimPol и ДНК,
2) Проведение скрининговых экспериментов для получения кристаллов и расшифровки структуры PrimPol.
3) Анализ функционального взаимодействия PrimPol с FEN1, REV1, транслезионными ДНК-полимеразами, и репликативными факторами RPA, PolDIP2, PCNA, 9-1-1, а также PARP1.
Планируемые исследования являются продолжением исследований механизма праймазной активности и механизмов регуляции активности PrimPol, начатых нами в ходе реализации проекта 2018 года. Полученные результаты будут обладать высокой новизной. Для достижения поставленных задач в работе будут применяться современные методы молекулярной биологии, биохимии и кристаллографии. Для исследования биохимической активности PrimPol будут использованы методы репликации in vitro и классические методы ферменативной кинетики. Полученные результаты позволят предположить механизмы регуляции работы и механизмы регуляции активности PrimPol.
Ожидаемые результаты
Изучение механизмов работы специализированных ДНКП человека представляет большой научный интерес и позволит в будущем разработать новые способы и подходы для предупреждения, диагностики и терапии ряда заболеваний, связанных с ошибками и нарушениями воспроизведения генетической информации.
В ходе реализации проекта будут проводиться исследования функциональной роли и биохимической активности PrimPol человека – новой специализированной ДНКП человека, обладающей праймазной активностью и способностью к синтезу на ДНК-матрицах, содержащих повреждения и неканонические структуры. PrimPol человека впервые выделена и описана в 2013 году и считается основным ферментом, осуществляющим ре-инициацию репликации в участках ДНК, содержащих повреждения и неканонические структуры, блокирующие работу высокоточных репликативных ДНКП как в ядре, так и митохондриях. Мутации гена PrimPol обнаружены у пациентов с инвазивными опухолями груди и офтальмологическими и неврологическими заболеваниями. Уникальная способность PrimPol инициировать синтез ДНК de novo после остановки репликации в участках, содержащих практически любые повреждения, предполагает, что PrimPol может участвовать в развитии резистентности опухолей к химиотерапевтическим препаратам-ингибиторам репликации.
В результате выполнения проекта будут получены принципиально новые данные о механизмах репликации с участием PrimPol человека. Впервые в мире будет исследована роль 5’-трифосфата в образовании стабильного комплекса PrimPol с ДНК и предприняты попытки расшифровки первой полноразмерной структуры PrimPol c ZnFn доменом, взаимодействующим с 5’-трифосфатом. Важным результатом проекта анализ функционального взаимодействия PrimPol с новыми репликативными регуляторными белками и ферментами репликации и репарации. Будут проведены эксперименты по АДФ-рибозилированию PrimPol ДНК-связывающими белками семейства PARP в присутствии регуляторных белков RPA и PolDIP2.
Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, внесут вклад в понимание фундаментальных процессов репликации и роли PrimPol в поддержании стабильности генома человека. Полученные фундаментальные знания будут использованы в работах ученых и научно-исследовательских коллективов (в России и в мире) для проведения последующих исследований механизмов репликации и мутагенеза с участием специализированных ДНКП. Результаты проекта будут обладать также прикладным значением и могут найти применение в исследованиях для поиска способов предупреждения и лекарственных средств борьбы с онкологическими и офтальмологическими заболеваниями.
Результаты исследований настоящего проекта будут опубликованы в восьми научных публикациях в российских и международных высокорейтинговых журналах.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Настоящий проект посвящен исследованию ДНК-праймазы с ДНК-полимеразной активностью PrimPol, впервые описанной в 2013 году. PrimPol – самая последняя открытая и наименее изученная ДНК-полимераза человека. По свойствам PrimPol сильно отличается от других ДНК-полимераз и праймазы человека. PrimPol играет ключевую роль в поддержании стабильности генома млекопитающих Свойства PrimPol недостаточно охарактеризованы, не известен механизм праймазной активности, не ясны механизмы регуляции ДНК-полимеразной и ДНК-праймазной активностей PrimPol. Целью данного проекта является анализ механизмов ДНК-полимеразной и праймазной активностей PrimPol человека и является продолжением проекта 2018-2020 гг.
В ходе реализации проекта 2018-2020 г. было установлено, что консервативные аргинины ZnFn С-концевого домена необходимы для праймазной активности и сделано предположение об участии ZnFn в связывании 5’-трифосфата ATP. Получение ДНК-субстрата с праймером, содержащим 5’-трифосфат, могло бы стать ключом к успеху в расшифровке структуры PrimPol. В 2021 г. был синтезирован ДНК-субстрат с 5’-фосфатом, который будет использован в кристаллографических и биохимических исследованиях на следующем этапе проекта.
Продолжено исследование механизмов праймазной активности с помощью биохимических подходов. Показано, что укороченный вариант PrimPol, содержащий только первые 363 аминокислотных остатков, способен связываться с ДНК, тогда как С-концевой домен не образует комплекса с ДНК. Однако, комбинация N-концевого и С-концевого доменов усиливает связывание с ДНК, что согласуется с работой отдельных доменов PrimPol по trans-механизму праймазной активности. Полноразмерный вариант PrimPol не образует комплекс с ДНК без добавления нуклеотидных субстратов, стабилизирующих комплекс, что может объясняться негативным влиянием С-концевого домена на связывание ДНК в cis-. Изучено влияние сиквенс-контекста сайта инициации синтеза ДНК на праймазную активность полноразмерного и укороченного вариантов PrimPol. Показана важная роль криптического G сиквенс-контекста 3’-GTCC в праймазной активности полноразмерной PrimPol. Установлено, что укороченная форма PrimPol обладает повышенной процессивностью, что согласуется с большей эффективностью связывания ДНК по сравнению с полноразмерным белком. Показана способность укороченного варианта PrimPol к нематричному синтезу ДНК (предположительно, терминальная трансферазная активность). Показано, что при реализации праймазной активности PrimPol делает паузы после включения 20 и 30 нуклеотидных субстратов.
Были проведены исследования по взаимодействию PrimPol с регуляторными белками и ферментами REV1, PCNA и FEN1. Показано ингибирующее действие PCNA на стимуляцию ДНК-полимеразной активности FEN1, сделано предположение о возможном перекрывании сайтов связывания PrimPol и PCNA в FEN1, которое требует экспериментальной проверки.
Результаты работ по проекту обладают большой научной значимостью и расширяют наши представления о функциях, механизмах работы и регуляции активности PrimPol. Все результаты 2021 года получены впервые.
Публикации
1. Болдинова Е.О., Манукян А.А., Макарова А.В. The DNA ligands Arg47 and Arg76 are crucial for catalysis by human PrimPol DNA Repair, - (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.dnarep.2021.103048
2. Болдинова Е.О., Юдкина А.Ю., Шилкин Е.С., Гагаринская Д.И., Барановский А.Г., Тагиров Т., Жарков Д.О., Макарова А.В. Translesion activity of PrimPol on DNA with cisplatin and DNA–protein cross-links Scientific Reports, Scientific Reports, 11:17588 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1038/s41598-021-96692-y
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Настоящий проект является продолжением исследований механизма праймазной активности и механизмов регуляции активности PrimPol, начатых нами при поддержке РНФ в 2018-2020 гг. ДНК-полимераза и ДНК-праймаза PrimPol играет ключевую роль в поддержании стабильности генома млекопитающих, но свойства этого фермента, впервые описанного в 2013 г, недостаточно охарактеризованы. Не известен механизм праймазной активности, не ясны механизмы регуляции ДНК-полимеразной и ДНК-праймазной активностей PrimPol. Целью данного проекта является анализ механизмов ДНК-полимеразной и праймазной активностей PrimPol человека.
В 2022 г. были получены новые данные о механизме праймазной и транслезионной активностей PrimPol. Была показана ключевая роль 5`-трифосфата и консервативных остатков ZnFn Arg417 и Arg414 в стабилизации комплекса PrimPol c ДНК. Показано, что при синтезе ДНК de novo PrimPol делает паузы каждые 10 нуклеотидов. Изучена роль С-концевого RPA-cвязывающего мотива (RBM) PrimPol во взаимодействии с ДНК. Показано, что делеция отрицательно заряженного RBM резко повышает аффинность PrimPol к ДНК-субстрату, содержащему 5`-трифосфат. Предложена гипотеза регуляции PrimPol регуляторным белком RPA, согласно которой взаимодействие с положительно заряженным RPA нейтрализует избыточный отрицательный заряд PrimPol, повышая аффинность к ДНК. Идентифицированы ключевые остатки активного центра PrimPol, необходимые для эффективного транслезионного синтеза напротив повреждения N2-ethyl-dG.
Показана стимулирующая роль репликативных регуляторных белков PolDIP2 и RPA в транслезионном синтезе напротив N2-dG аддуктов, а также кооперация PrimPol с ДНК-полимеразой экстендером при синтезе напротив повреждения in vitro. Показано, что PrimPol не является мишенью белков PARP1, PARP1 и PARP3, что согласуется с последними литературными данными, показавшими, что для активации репрайминга PrimPol необходимо ингибирование PARP1.
Результаты работ по проекту обладают большой научной значимостью и расширяют наши представления о функциях, механизмах работы и регуляции активности PrimPol. По результатам проекта осенью 2022 г. состоялась защита кандидатской диссертации Болдиновой Е.О. и представление к защите докторской диссертации руководителя проекта Макаровой А.В. Исследования основных исполнителей проекта Болдиновой Е.О. и Шилкина Е.С. были удостоены Медали РАН для молодых ученых и Медали для молодых ученых им. Курчатова за 2021 г.
Публикации
1. Болдинова Е.О., Ходке П.П., Судхакар С., Мишра В.К., Манукян А.А., Миропольская Н., Прадипкумар П.И., Макарова А.В. Makarova A.V. Translesion synthesis across N2-deoxyguanosine adducts by human PrimPol ACS Chem. Biol., 17, 11, 3238–3250 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1021/acschembio.2c00717
2. Макарова А.В., Калюжная Я.Г., Бондаренко К.А. ДНК-аптамеры к праймазе и ДНК-полимеразе PrimPol человека. -, 2 770 691 (год публикации - )
Возможность практического использования результатов
не указано