КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 18-14-00152

НазваниеМолекулярно-генетические механизмы кальцификации сердца и сосудов

РуководительМалашичева Анна Борисовна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук, г Санкт-Петербург

Период выполнения при поддержке РНФ 2021 г. - 2022 г. 

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (28).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-205 - Клеточная биология, цитология, гистология

Ключевые словакальцификация, сердце, сосуды, остеогенная дифференцировка, сигналинг, Notch, Wnt

Код ГРНТИ34.19.00

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Проект направлен на выяснение фундаментальных механизмов активации остеогенной дифференцировки, приводящих к кальцификации тканей сердца и сосудов. Образование костной ткани и патологическая кальцификация сердечно-сосудистой системы имеют сходные признаки – в особенности на продвинутых стадиях. Пусковые механизмы, которые приводят к патологической кальцификации сердца и сосудов, остаются во многом неисследованными, а ранние маркеры остеогенеза неизвестными. По данным ВОЗ, заболевания сердечно-сосудистой системы стали причиной 31% смертей по всему миру в 2016 году. Кальцификация тканей сердца и сосудов, в первую очередь аортального клапана, – это одна из наиболее распространенных форм хронических сердечно-сосудистых заболеваний. Его ранние стадии, утолщение аортального клапана, наблюдаются примерно у четверти людей старше 65 лет. Однако у 2% стареющей популяции эта болезнь прогрессирует до кальцификации аортального клапана или аортального стеноза. Из-за увеличения среднего возраста популяции, предполагается, что это заболевание будет становится все более распространенным. Ранние стадии аортального стеноза повышают риски острых сердечно-сосудистых заболеваний, а также ухудшают течение коронавирусной инфекции. При развитии аортального стеноза происходит нарушение проницаемости аортального клапана. Единственный существующий метод лечения этого заболевания – это хирургическая замена клапана. Так, по всему миру ежегодно проводится 300-400 тысяч таких операций. Однако, из-за увеличения риска заболевания с возрастом, примерно половина пациентов, требующих замены клапана, имеют противопоказания для хирургического вмешательства. На стадии клинических испытаний все еще нет кандидатов для терапии аортального стеноза. Одна из причин этого заключается в том, что фундаментальные представления о механизмах эктопической кальцификации все еще активно развиваются. Известно, что в эктопическую кальцификацию вовлечены сигнальные каскады, участвующие в нормальных процессах развития сердечно-сосудистой системы и костной ткани. В первую очередь, это сигнальные каскады WNT, BMP, Notch и транскрипционный фактор Runx2, считающийся мастер-геном остеогенной дифференцировки. Цель проекта заключается в выяснении механизмов остеогенной дифференцировки в клетках мезенхимного происхождения в норме и при патологической кальцификации тканей сердца. В качестве экспериментальных моделей используются интерстициальные и эндотелиальные клетки аортального клапана человека, мезенхимные стволовые клетки различных тканей человека, остеобласты. Основным результатом, полученным в ходе выполнения проекта за прошедшие три года, является доказательство ведущей роли взаимодействия эндотелиальных клеток с интерстициальными клетками в индукции патологической остеогенной дифференцировки. Полученные данные указывают на то, что при аортальном стенозе происходит нарушение регуляции сигнального пути Notch в эндотелии, которое вносит вклад в нарушение гомеостаза аортального клапана и, в конечном итоге, приводит к остеогенной дифференцировке интерстициальных клеток клапана, кальцификации и аортальному стенозу. Тем не менее, механизмы, за счет которых нарушения сигнального пути Notch в эндотелии приводят к остеогенной дифференцировке интерстициальных клеток клапана, все еще не ясны. Ранее мы продемонстрировали, что сигнальный путь Notch оказывает дозозависимый эффект на остеогенную дифференцировку мезенхимных стволовых клеток и экспрессию в них Runx2: высокие дозы активации сигнального пути Notch подавляют, а низкие индуцируют остеогенную дифференцировку. Более того, известно, что эффект активации сигнального пути Notch зависит от контекста, в котором находится клетка. По-видимому, не только непосредственная сила сигнала, но и состояние клетки-реципиента могут влиять на эффект Notch на остеогенную дифференцировку и развитие аортального стеноза. Особенно большое значение это может иметь в контексте продемонстрированных различий на клиническом уровне в протекании заболевания у мужчин и женщин. Большинство существующих молекулярно-биологических исследований аортального стеноза проведены на клиническом материале от мужчин и не известно насколько правомерно экстраполировать эти данные на женщин. Проект 2021 будет сфокусирован на изучении молекулярных механизмов, потенциально опосредующих дозозависимые эффекты Notch, его взаимодействия с другими сигнальными каскадами и различий в остеогенной дифференцировке между разными типами клеток в различных состояниях. Запланировано исследование того, как активность сигнального пути Notch влияет на активность транскрипционного фактора Runx2 в разработанной нами модели дозозависимой активации сигнального пути Notch при помощи генно-инженерных конструкций. В частности, будут проведены эксперименты по оверекспрессии и подавлению сигнального пути Notch и фактора Runx2 в различных комбинациях с изучением активации мишеней Runx2 и Notch. Параллельно с этим будет проведено мультиомиксное сравнение остеогенной дифференцировки интерстициальных клеток аортального клапана от здоровых доноров и пациентов с аортальным стенозом, а также остеогенной дифференцировки остеобластов. В настоящее время полагают, что интерстициальные клетки способны к остеогенной дифференцировке также, как и остеобласты, но прямых доказательств того, что это действительно так, не получено. Мы проведём прямое сравнение остеогенной дифференцировки интерстициальных клеток аортального клапана и остеогенной дифференцировки остеобластов. Эти данные позволят выявить потенциальные особенности молекулярных механизмов остеогенной дифференцировки интерстициальных клеток аортального клапана. На основе этих данных станет возможным выявление потенциальных мишеней для терапии аортального стеноза и контроля прогрессирующей кальцификации сердечно-сосудистой системы. Наконец, будет проведено мультиомиксное сравнение эндотелиальных и интерстициальных клеток клапана, полученных от пациентов с аортальным стенозом мужского и женского пола. Эти данные позволят понять, можно ли экстраполировать накопленные к настоящему моменту данные, поученные в основном на клетках мужчин, на клетки, полученные у женщин, и позволят адекватнее спланировать дизайн будущих доклинических и клинических испытаний.  

Ожидаемые результаты
1) На основе транскриптомных и протеомных данных будут обнаружены различия в молекулярных механизмах остеогенной дифференцировки интерстициальных клеток клапана (ИКК) от здоровых доноров и пациентов с кальцификацией аортального клапана. Несмотря на то, что эктопическая кальцификация активно изучается по всему миру, в литературе нет данных комплексного описания особенностей молекулярных механизмов остеогенной дифференцировки ИКК у пациентов с аортальным стенозом. Обнаружение таких особенностей позволит выявить мишени для терапии поздних стадий аортального стеноза, сопровождающихся прогрессирующей кальцификацией аортального клапана. 2) На основе мультиомиксных данных будут описаны различия в молекулярных механизмах остеогенной дифференцировки ИКК и остеобластов. В литературе мало данных прямого сравнения молекулярных механизмов остеогенной дифференцировки у различных типов МСК-подобных клеток. В частности, не известно, насколько сходным образом происходит остеогенная дифференцировка ИКК и остеобластов. Обнаружение таких особенностей позволит глубже понять фундаментальные основы молекулярных механизмов остеогенной дифференцировки и найти потенциальные мишени для терапии аортального стеноза. 3) Будут изучены фундаментальные механизмы взаимодействия сигнального пути Notch и транскрипционного фактора Runx2. В то время как Runx2 – это мастер-ген остеогенной дифференцировки, центральную роль сигнального пути Notch в этих процессах удалось продемонстрировать сравнительно недавно. Поэтому механизмы их взаимодействия еще не были изучены подробно. Известно, что Runx2 не относится к мешеням Notch-сигналинга, но активация этого сигнального пути может приводить к повышению экспрессии Runx2. Данные о механизмах Notch-зависимой экспрессии Runx2 важны для понимания как нормальной, так и эктопической кальцификации.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Проект направлен на выяснение фундаментальных механизмов активации остеогенной дифференцировки, приводящих к кальцификации тканей сердца и сосудов. Образование костной ткани и патологическая кальцификация сердечно-сосудистой системы имеют сходные признаки – в особенности на продвинутых стадиях. Пусковые механизмы, которые приводят к патологической кальцификации сердца и сосудов, остаются во многом неисследованными, а ранние маркеры остеогенеза неизвестными. Известно, что в эктопическую кальцификацию вовлечены сигнальные каскады, участвующие в нормальных процессах развития сердечно-сосудистой системы и костной ткани. В первую очередь, это сигнальные каскады WNT, BMP, Notch и транскрипционный фактор Runx2, считающийся мастер-геном остеогенной дифференцировки. Цель проекта заключается в выяснении механизмов остеогенной дифференцировки в клетках мезенхимного происхождения в норме и при патологической кальцификации тканей сердца. В качестве экспериментальных моделей в проекте используются интерстициальные и эндотелиальные клетки аортального клапана человека, мезенхимные стволовые клетки различных тканей человека, остеобласты. Полученные ранее данные указывают на то, что при патологической кальцификации аортального клапана происходит нарушение регуляции сигнального пути Notch в эндотелии, которое вносит вклад в нарушение гомеостаза аортального клапана и, в конечном итоге, приводит к остеогенной дифференцировке интерстициальных клеток клапана, кальцификации и аортальному стенозу. Тем не менее, механизмы, за счет которых нарушения сигнального пути Notch в эндотелии приводят к остеогенной дифференцировке интерстициальных клеток клапана, все еще не ясны. Для изучения взаимодействия сигнального пути Notch и мастер-гена регулятора остеогенной дифференцировки RUNX2 сконструированы и проверены три лентивирусных вектора, несущих полноразмерный RUNX2 человека, укороченный RUNX2 человека и RUNX2 человека со стоп-кодоном. Для экспериментального подавления уровня экспрессии RUNX2 сконструирован вектор, несущий шпилечную РНК, подавляющую экспрессию RUNX2. Конструкция, несущая шпилечную РНК, проверена на клетках HeLa. Проведён сравнительный протеомный анализ интерстициальных клеток аортального клапана человека, претерпевающих остеогенную дифференцировку при развитии кальцинирующего аортального стеноза, и остеобластоподобных клеток, претерпевающих остеогенную дифференцировку в норме. Показано, что процессы патологической и нормальной оссификации происходят посредством различных молекулярных механизмов. При помощи протеомных методов выявлены различия в молекулярных механизмах остеогенной дифференцировки интерстициальных клеток аортального клапана и остеобластов. Для изучения изменений гистонового кода интерстициальных клеток аортального клапана при остеогенной дифференцировке и изучения роли изменений гистонового кода в развитии кальцинирующего аортального стеноза отработан метод экстракции гистонов и проведен протеомный анализ экстракта гистонов остеобластов при индукции остеогенной дифференцировки. Проведены эксперименты по анализу взаимодействия сигнального пути Notch с белками Runx2. Физиологическое состояние клеток после внесение Runx2, активированного домена Notch1 или обоих оценено при помощи протеомного анализа. RUNX2 обнаружен во всех образцах, как при внесении полноразмерного RUNX2, так и при внесении активированного домена Notch1 и обеими плазмидами. RUNX2 и активированный домен Notch1 активировали уникальные мишени; внесение обеих конструкций приводило к иным эффектам и репертуар белков, изменяющих свою экспрессию, значительно отличался от эффекта обоих транскрипционных факторов по отдельности. Это, как и наблюдаемое «ограничение» повышения экспрессии RUNX2 свидетельствует о значительном взаимодействии этих транскрипционных факторов, выяснение которого требует дополнительных экспериментов. Для изучения потенциальных путей различных сигнальных путей, в первую очередь Notch, активировать RUNX2, проведен анализ сетей белок-белковых взаимодействий in silico по базе данных String (https://string-db.org/cgi/network?taskId=bIhf9gDOrvFO&sessionId=bY62vkNY5A1G).

 

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Проект направлен на выяснение фундаментальных механизмов активации остеогенной дифференцировки, приводящих к кальцификации тканей сердца и сосудов. Образование костной ткани и патологическая кальцификация сердечно-сосудистой системы имеют сходные признаки – в особенности на продвинутых стадиях. Пусковые механизмы, которые приводят к патологической кальцификации сердца и сосудов, остаются во многом неисследованными, а ранние маркеры остеогенеза неизвестными. Известно, что в эктопическую кальцификацию вовлечены сигнальные каскады, участвующие в нормальных процессах развития сердечно-сосудистой системы и костной ткани. В первую очередь, это сигнальные каскады WNT, BMP, Notch и транскрипционный фактор Runx2, считающийся мастер-геном остеогенной дифференцировки. Цель проекта заключается в выяснении механизмов остеогенной дифференцировки в клетках мезенхимного происхождения в норме и при патологической кальцификации тканей сердца. В качестве экспериментальных моделей в проекте использованы интерстициальные и эндотелиальные клетки аортального клапана человека, остеобласты. Полученные ранее данные указывают на то, что при патологической кальцификации аортального клапана происходит нарушение регуляции сигнального пути Notch в эндотелии, которое вносит вклад в нарушение гомеостаза аортального клапана и, в конечном итоге, приводит к остеогенной дифференцировке интерстициальных клеток клапана, кальцификации и аортальному стенозу. Тем не менее, механизмы, за счет которых нарушения сигнального пути Notch приводят к остеогенной дифференцировке интерстициальных клеток клапана, все еще не ясны. Задачами отчетного периода являлось, во-первых, выяснение молекулярных различий остеогенной дифференцировки интерстициальных клеток аортального клапана пациентов с кальцификацией аортального клапана и остеобластов кости человека, и, во-вторых, исследование взаимного влияния сигнального пути Notch и мастер-гена остеогенной дифференцировки друг на друга в ходе остеогенной дифференцировки, а также в различных клеточных контекстах. Проведено сравнение молекулярных механизмов остеогенной дифференцировки интерстициальных клеток аортального клапана пациентов с аортальным стенозом и остеобластов человека при помощи комбинации методов протеомики и транскрпиптомики. Показано, что остеобласты и интерстициальные клетки аортального клапана сохраняют свою тканевую специфичность до и после остеогенной дифференцировки. Впервые в мире получены данные о том, что интерстициальные клетки аортального клапана пациентов с патологической кальцификацией отличаются по протеомному и трансриптомному профилям от остеобластов до и после остеогенной дифференцировки. Таким образом сравнение патологической кальцификации аортального клапана с образованием кости, принятое в литературе, является не совсем корректным и требует пересмотра. Проведено исследование влияния различных форм RUNX2 на активацию экспрессии генов сигнального пути Notch; проведена оценка влияния активации и инактивации компонентов сигнального пути Notch на экспрессию гена RUNX2 и активацию его промотора в различных клеточных системах. Получены данные о том, что ген RUNX2 по-разному регулирует сигнальный путь Notch в различном контексте. Эксперименты выполнены с использованием клеток HeLa, HEK293, первичных остеобластов и гингивальных клеток человека.Показано, что активация сигнального пути Notch приводит к снижению уровня экспрессии RUNX2 в остеобластах и гингивальных клетках. При этом активация сигнального пути Notch усиливает минерализацию клеток. Полученные данные в совокупности позволяют сделать вывод о том, что сигнальный путь Notch усиливает остеогенную дифференцировку, подавляя экспрессию RUNX2. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что поддержание определенного количества RUNX2 является физиологически значимым, и его уровень тщательно регулируется за счет различных механизмов, одним из которых является Notch-зависимая регуляция. Проведенные эксперименты способствуют углублённому пониманию механизмов остеогенной дифференцировки в норме и при патологической кальцификации. Понимание того, какая доза RUNX2 необходима на стадии минерализации и за счет каких механизмов обеспечивается определенное количество RUNX2 на каждой стадии остеогенной дифференцировки может являться ключом к поиску путей управления процессами остеогенной дифференцировки с целью её подавления при патологической кальцификации.

 

Публикации

1. A.Е. Костюнин, Т.В. Глушкова, А.А. Лобов, Е.А. Овчаренко,Б.Р. Зайнуллина, Л.А. Богданов, Д.К. Шишкова, В.Е. Маркова, М.А. Асанов, Р.А. Мухамедьяров, Е.А. Великанова, Т.Н. Акентьева, М.А. Резвова, А.Н. Стасев, А.В. Евтушенко, Л.С. Барбараш, А.Г.Кутихин Proteolytic degradation is a major contributor to bioprosthetic heart valve failure Journal of the American Heart Association, - (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1161/JAHA.122.028215

2. А.А. Лобов, Д.А. Переплетчикова, Е.А. Репкин, А.Б. Малашичева Activation of Notch signaling in endothelium cause upregulation of N-terminal acetylated histone 1 Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний, № 4 (2022) (год публикации - 2022)

3. Богданова М., Забирник А., Малашичева А.Б., Семенова Д.С., Квиттинг Ж.П., Клажусто М.Л. , Перез М.Д., Костарева А.А., Стенслоккен К.О., Салливан Г.Ж., Рутковский А., Гааге Я.. Models and Techniques to Study Aortic Valve Calcification in Vitro, ex Vivo and in Vivo. An Overview. Frontiers in Pharmacology, 2022; 13: 835825. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3389/fphar.2022.835825

4. Боярская Н.В., Качанова О.С., Шишкова А.А., Успенский В.Е., Филиппов А.А., Толпыгин Д.С., Лобов А.А., Малашичева А.Б. Влияние титановых синтетических материалов на остеогенную дифференцировку интерстициальных клеток аортального клапана человека Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний, №1 (год публикации - 2023)

5. И.А. Хворова, Д.А. Костина, Б.Р. Зайнуллина, Е.А. Фефилова, Е.С. Громова, Р.М. Тихилов, С.А. Божкова, А.П. Середа, В.В. Карелкин, А. Б. Малашичева и А.А. Лобов Osteogenic Differentiation In Vitro of Human Osteoblasts Is Associated with Only Slight Shift in Their Proteomics Profile Cell and Tissue Biology, № 6 Том 16, стр. 540–546 540–546. © Pleiades Publishing, Ltd., 2022. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1134/S1990519X22060025

6. Катерина Данко, Лаврентий Данилов, Анна Малашичева, Арсений Лобов Comparative analysis of methods for batch correction in proteomics – two proteomics batch case Biological Communications, - (год публикации - 2023)

7. Семёнова Д.С., Забирник А., Лобов А.А., Боярская Н.В., Качанова О.С., Успенский В.Е., Зайнуллина Б., Денисов Е., Геращенко Т., Квиттинг Ж.Е., Калутсо М. Л., Зиеде Б., Костарева А.А., Стенслоккен К.О., Вааге Я., Малашичева А. Multi-omics of in vitro aortic valve calcification Frontiers in Cardiovascular Medicine, 3;9:1043165. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3389/fcvm.2022.1043165

Возможность практического использования результатов
не указано