Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Спектр экспрессии мРНК иммунорегуляторных цитокинов в эритроидных клетках костного мозга (ЭК КМ), фетальной печени (ЭК ФП), определяемый при помощи иммунологической панели NanoString Immunology V2, показал четкое разделение образцов ЭК КМ и ЭК ФП по их значениям нормализованной экспрессии генов. Для ЭК КМ наиболее характерной является экспрессия генов IL-8 и MIF, а для ЭК ФП – IL-2, IL-5, IL-12В, IL-15, IL-23А, TGF-b, TNF-a и CXCL10. Показано наличие ранее не обнаруживаемых в эритроидных клетках транскриптов: TLR1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 и 9, а также NOD2. Были проанализированы и сигнальные пути, регулирующие синтез цитокинов и хемокинов: JAK-STAT, Ras-Raf-Mek-Erk и Nf-kB, в которых наблюдалась up-регуляция большинства генов рецепторов данных путей и down-регуляция большинства их внутриклеточных компонентов. Тепловые карты нормализованных значений экспрессии генов эритроидных ядросодержащих клеток на различных стадиях дифференцировки, полученных при блокировке меланокортиновых рецепторов, показали значительную разницу в экспрессии генов эритроидных клеток костного мозга и культивированных эритроидных клеток. Таким образом, ЭК фетальной печени и ЭК костного мозга взрослых людей представляют собой две различные популяции эритроидных клеток, которые различаются качественно и количественно по экспрессии ряда иммунорегуляторных медиаторов, ростовых факторов и хемокинов. Продукция соответствующих главных экспрессирующихся цитокинов ЭК ФП и ЭК КМ была исследована с помощью панели Bio-Plex Pro™ Human Cytokine Screening, 48-Plex (BioRad). Результаты BioPlex-анализа секретируемых цитокинов частично подтверждают данные о ключевых экпрессируемых ЭК ФП и ЭК КМ цитокинах. Так, для ЭК КМ это совпадающий с данными экспрессии мРНК IL-8 и MIF, а также идущий в разрез с данными по экспрессии мРНК G-CSF и TNF-a; для ЭК ФП - совпадающие с данными экспрессии мРНК IL-5 и IL-15. Другие же цитокины не показали значимой разницы в продукции белка в отличие от таковой на уровне мРНК. При исследовании образцов ЭK, полученных из CD 34+ клеток костного мозга при различных воздействиях, меняющих функциональную направленность эритроидных клеток, показана экспрессия уникального медиатора SCGF-betta. Эритроидные клетки продуцируют широкий спектр цитокинов, поэтому кондиционная среда от этих клеток может оказывать опосредованный иммунорегуляторный эффект на различные типы клеток и реализацию их функций. Кондиционная среда фетальных ЭК приводит к повышению цитотоксической противоопухолевой активности и подавлению пролиферативной активности мононуклерных клеток костного мозга. Продуцируемые медиаторы естественных эритробластов не оказывают ингибирующего воздействия, а поддерживают реакцию представления, распознавания и ответа на аллоантиген. Кондиционная среда индуцированных in vitro эритробластов в зависимости от стадии дифференцировки может подавлять реакцию на аллоантиген. Кондиционная среда всех типов исследуемых эритробластов оказывает достоверное стимулирующее влияние на экспрессию CCR 7 на CD8 Т-лимфоцитах, а на экспрессию CCR 7 на CD4 Т-лимфоцитах только кондиционная среда от индуцированных эритробластов. Кондиционная среда ранних индуцированных эритробластов оказывает максимальное достоверное влияние на индукцию активированных T-клеток CD4+CD25+ и CD4+CD25+CD127 T-регуляторных клеток периферической крови. Таким образом, медиаторы эритроидных клеток участвуют в миграции и реализации эффекторных функций Т-клеток, при этом эритробласты разных стадий развития отличаются между собой по оказываемым эффектам. У естественных фетальных эритробластов наблюдаются пороговые уровни G-CSF, GRO-alpha, IL-1RA, IL-8, MCP-1, MIF, SCF, SCGF-betta, а ЭБ, полученные in vitro и обработанные гидроксимочевиной для переключения типа синтеза гемоглобина продуцируют максимальные количества этих цитокинов. При сравнении продукции цитокинов, ЭБ, полученными in vitro после блокировки меланокортиновых рецепторов и естественными ЭК костного мозга, показаны, что максимальная продукция IL-8 и SCGF-betta характерна для эритробластов, обработанных антителами против MCR5, причем данная группа достоверно отличается от блокировки других рецепторов.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Для выяснения роли эритроидных клеток плаценты при беременности мы моделировали аллогенную (♂F1 CBA×C57Bl6) и сингенную (♀CBA×♂ CBA) беременность. Содержание ЭЯК в плаценте не зависит от срока и иммунологической нагрузки при беременности, однако на поздних сроках аллогенной беременности возникает повышение содержания ЭЯК ранних и средних форм дифференцировки, а содержание ортохроматофильных ЭЯК не изменяется в зависимости от стадии и происхождения родительских особей. Для рассмотрения роли эритроидных ядросодержащих клеток (ЭЯК) в регуляции гемопоэза были смоделированы гемопоэз-активирующие состояния: химически индуцированная гемолитическая анемия, острая кровопотеря, гипоксия. Содержание ЭЯК в костном мозге не меняется при гемопоэз-активирующих состояниях, но изменяется содержание более зрелых форм ЭЯК, а при гемолитической анемии достоверно возрастает доля проэритробластов по сравнению с нормой. Для гемолитической анемии и гипоксии в селезенке характерно повышение содержания всех форм ЭЯК, а для острой кровопотери достоверно повышается содержание полихроматических и ортохроматических ЭЯК. Одновременно наблюдается резкое увеличение содержания ЭЯК селезенки при гемопоэз-активирующих состояниях. При сравнении зрелых и фетальных органов кроветворения показаны достоверные различия для содержания проэритробластов в неонатальной селезенке и зрелом костном мозге. Содержание ортохроматофильных эритробластов в фетальной печени и неонатальной селезенке достоверно превышало содержание этих клеток в селезенке взрослой мыши Содержание ортохроматофильных эритробластов в неонатальной селезенке достоверно отличалось от содержания этих же форм ЭЯК в селезенке и костном мозге взрослых мышей. В неонатальных органах кроветворения преобладают ортохроматофильные ЭЯК, что говорит о готовности эритроидного ростка к растущим потребностям организма в кровоснабжении и кислороде во время внутриутробного и постнатального развития. ЭЯК аллогенной плаценты среднего срока беременности доминируют по синтезу цитокинов над ЭЯК всех других плацент, как позднего срока аллогенной, так и среднего и позднего срока сингенной беременности. При сингенной беременности наблюдается снижение IFNg при переходе от среднего срока к позднему. Цитокиновый профиль ЭЯК фетальной печени может говорить о формировании различных гемопоэтических и тканеспецифических ниш с помощью привлечения различных клеточных элементов. В костном мозге взрослой мыши преобладают многочисленные цитокины широкого спектра действия, что говорит о роли ЭЯК в поддержании практически всех как гемопоэтических, так и иммунорегуляторных функций клеток костного мозга. ЭЯК костного мозга взрослых мышей секретируют достоверно более высокий уровень цитокинов IL-1b, IL-2, IL-4, IL-9, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-13, IL-17a, TNFa и ростового фактора GM-CSF в сравнении с селезёнкой взрослых мышей. При гематопоэз-стимулирующих воздействиях не происходит достоверного изменения секреции цитокинов и факторов роста вне зависимости от органа происхождения ЭЯК. Иммуннотранскриптом ЭЯК мыши был оценен при помощи исследования тотальной РНК CD71+ ЭЯК (3-5 биологических повторов) на платформе NanoString Sprint при помощи панели зондов nCounter Mouse Immunology Panel (561 целевых генов, 15 генов домашнего хозяйства). Для дифференциально экспрессируемых генов был проведен анализ функционального обогащения набора генов (Gene Set Enrichment Analysis) при помощи программного пакета GSEApy для Python 3. Дифференциально экспрессируемые гены были обнаружены при сравнении: 1) ЭЯК селезенки с ЭЯК костного мозга, 2) ЭЯК костного мозга при острой кровопотере с нормой, 3) ЭЯК селезенки при острой кровопотере с нормой, 4) ЭЯК селезенки при острой гипоксии с нормой, 5) ЭЯК костного мозга при острой кровопотере с ЭЯК костного мозга при гемолитической анемии, 6) ЭЯК селезенки при острой кровопотере с ЭЯК селезенки при гемолитической анемии. При всех исследованных гемопоэз-стимулирующих воздействиях был показаны практически идентичные дифференциально экспрессированные гены – up-регулированы гены врожденного иммунитета Camp и S100a8, S100a9 (субъединицы белка Кальпротектина с антибактериальной, противогрибковой и противовирусной ролью) и down-регулированы гены сигнальных путей цитокинов. При исследовании влияния гематопоэз-стимулирующих воздействий показано, что статистически значимое изменение экспрессии генов происходит непосредственно в ЭЯК, полученных из конкретного органа, а изменение продукции цитокинов проявляется при сравнении ЭЯК разных органов при одном и том же воздействии. Для реализации компенсаторных механизмов при исследованных гематопоэз-стимулирующих воздействиях экспрессия генов и секреция цитокинов направлены на активацию механизмов врожденного иммунитета, которые заключаются в усилении экспрессии генов с антибактериальной, противогрибковой и противовирусной ролью, снижении активации цитокинов для предотвращения локального воспаления, накопления питательных веществ и привлечение клеточных элементов в очаг гемопоэза для восстановления гомеостатических функций. При изучении иммунорегуляторной активности эритроидных клеток в различных функциональных тестах in vitro показано, что кондиционная среда оказывает действие на мононуклеарные клетки того же органа, что и происхождение ЭЯК. Так кондиционная среда ЭЯК после гематопоэз-стимулирующих воздействий способствует пролиферации и активации CD 3+ Т-клеток костного мозга, особенно субпопуляции CD 4+ Т-клеток костного мозга. Кондиционная среда ЭЯК костного мозга после гематопоэз-стимулирующих воздействий оказывает цитотоксический эффект на клетки опухолевой линии меланомы. Кондиционная среда ЭЯК как костного мозга, так и селезенки после гематопоэз-стимулирующих воздействий усиливает цитотоксический потенциал мононуклеарных клеток соответствующего органа. Цитокины и ростовые факторы ЭЯК способствуют стимуляции фагоцитарной активности индуцированных макрофагов костного мозга. Таким образом, по результатам 2 года выполнения проекта можно заключить, что ЭЯК являются пластичной клеточной популяцией, которая адаптируется к активации гемопоэза, стадии онтогенеза и иммунологической нагрузки путем изменения субпопуляционного состава, экспрессии генов для компенсации негативных воздействий и продукции цитокинов для поддержания клеточного состава органа гемопоэза.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В 2023 году в рамках проекта проводился анализ транскриптома, а также исследование фенотипических, функциональных свойств эритроидных клеток костного мозга пациентов с гемобластозами. Фенотипический анализ показал, что CD 45, как маркер ранних и супрессорных эритроидных клеток присутствует меньше, чем на 10% эритроидных клеток. Определение стадий терминальной дифференцировки показало достоверные различия между больными лейкозом и здоровыми донорами по содержанию базофильных эритроидных клеток (преобладают у больных лейкозом) и полихроматофильных эритроидных клеток (преобладают у условно здоровых доноров) Экспрессия CD49d и CD36 снижается по мере дифференцировки эритроидных клеток. Содержание клеток, экспрессирующих фермент аргиназу, маркеры CD184 (CXCR4) и галектина 3 повышено в популяции эритроидных клеток больных лейкозами с преимущественной локализацией в популяции ортохроматофильных эритробластов. Для анализа транскриптома эритроидных клеток костного мозга мы использовали костный мозг трех пациентов с лимфобластным лейкозом (ОЛЛ/ALL - acute lymphoblastic leukemia) и костный мозг 4 условно-здоровых доноров. Мононуклеарные клетки костного мозга были помечены антителами для мультиплексирования биологических образцов SampleTag и 28 антителами AbSeq против поверхностных белков CD1a, CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD30, CD33, CD34, CD36, CD38, CD40, CD44, CD45RA, CD45RO, CD49d, CD56, CD64, CD71, CD79b, CD86, CD95, CD117, CD235, CCR7, HLA-DR. Получение финальных библиотек иммунного транскриптома (379 генов) проводилось на платформе BD Rhapsody Express. Полученные библиотеки были пулированы и секвенированы на приборе NovaSeq 6000 на ячейке S1 c 50 парными прочтениями. Биоинформатический анализ полученных данных подтвердил клинический диагноз острого лейкоза, позволил идентифицировать происхождение лейкоза, экспрессию поверхностных маркеров и повышенную экспрессию генов, уникальную для каждого лейкоза. Для генов и поверхностных белков, определяющих стадии дифференцировки эритроидных клеток (гены ALAS2, CD36, CD44, ITGA4; белки CD36, CD44, CD45RA, CD49d, CD71, CD235) различий между здоровыми донорами и больными ОЛЛ не выявлено. Анализ мультиома эритроидных клеток показал экспрессию большого количества генов иммунного транскриптома и поверхностных белков. Экспрессируемые в эритроидных клетках гены были обогащены в терминах KEGG “Hematopoietic cell lineage” (гены GYPA (CD235), TFRC (CD71), ITGA4, HLA-DMA, IL1B, KIT, HLA-DRA, CD38, CD37, CD36, CD24, CD34, CD44, HLA-DPA1) и Gene Ontology Biological Process “Response To Molecule Of Bacterial Origin” (гены CXCL8, IL23R, IL1B, LGALS9, CD24, S100A9, SNCA). Обнаруженная молекулярная сигнатура “Response To Molecule Of Bacterial Origin” указывает на участие эритроидных клеток в антимикробном иммунитете. Были обнаружены гены цитокинов и хемокинов: IL1B, IL18, CXCL5, CXCL8, VEGFA, а также гены иммуносупрессорных белков: ARG1, LGALS3, LGALS9. Также была обнаружена ко-экспрессия генов иммуногобулинов в небольшом количестве эритроидных клеток: IGHM-membrane (тяжелая цепь, мембраносвязанная) с IGKC (легкая цепь) или IGLC3 (легкая цепь), которые потенциально могут сформировать полноценные мембрано-связанные антитела класса М. Это позволяет предположить возможность частичной (без экспрессии CD19 и других поверхностных маркеров B-клеток) трансдифференцировки малой части эритроидных клеток в клетки, подобные B-лимфоцитам. В эритроидных клетках наблюдалась зависимая от стадии развития экспрессия генов и поверхностных белков. Для поверхностных белков была нормализована экспрессия и проанализирована динамика поверхностного протеома. Так, экспрессия CD36 и CD49d (альфа-4-интегрин) была высокой на стадии полихроматофильных эритробластов, а затем она резко падала при переходе к стадии ортохроматофильных эритробластов, экспрессия CD44 была высокой на стадии базофильных эритробластов, а затем постепенно падала при переходе к последующим стадиям дифференцировки, экспрессия CD34, CD38, CD71 и HLA-DR была высокой на стадии проэритробластов, а затем постепенно падала при переходе к последующим стадиям дифференцировки, экспрессия CD95 (FAS рецептор) и CD235 (Гликофорин А) была низкой на стадии проэритробластов, а затем постепенно повышалась при переходе к последующим стадиям дифференцировки. Эритроидные клетки на одних и тех же стадиях дифференцировки в норме и при ОЛЛ имели дифференциально экспрессируемые гены. Так, при ОЛЛ в полихроматофильных эритробластах наблюдалось повышение экспрессии гена S100A10, в базофильных эритробластах наблюдалось повышение экспрессии гена LGALS3 (Галектин 3), в проэритробластах наблюдалось повышение экспрессии генов RGS1, FOSB и CXCR4. При исследовании межклеточного взаимодействия в костном мозге в норме и при ОЛЛ показано, что исходящими сигналами от проэритробластов в костном мозге здоровых доноров являлись сигналы в путях Галектина 9, SELPLG, ITGB2, которые исчезали с созреванием эритроидных клеток и заменялись сигналом от Галектина 3 на стадии ортохроматофильных эритробластов. В костном мозге же больных ОЛЛ в проэритробластах также присутствовали исходящие сигналы SELL и CD4. Проэритробласты костного мозга здоровых доноров получали входящие сигналы от THBS - Тромбоспондина 1, белка, который обеспечивает межклеточные взаимодействия. Входящие сигналы для эритроидных клеток при ОЛЛ отличались от таковых в норме наличием входящих сигналов SELL. Исследование продукции цитокинов эритроидными клетками при ОЛЛ показало достоверное снижение продукции хемокинов IL-8 (CXCL8) и RANTES (CCL5) по сравнению с нормой. С помощью секреции различных цитокинов эритроидные клетки могут оказывать влияние на другие клеточные популяции. Кондиционная среда эритроидных клеток костного мозга от условно здорового донора стимулирует пролиферативную активность МНК по сравнению с культивированием в обычной ростовой среде, а кондиционная среда эритробластов из костного мозга больных лейкозом подавляет пролиферативную активность по сравнению кондиционной средой эритробластов костного мозга от условно здорового донора. Кондиционные среды эритроидных клеток оказывают влияние на содержание IgM-позитивных незрелых и зрелых B-клеток, а также на экспрессию ими активационного маркера HLA-DR. В популяции моноцитов и их предшественников кондиционные среды эритроидных клеток оказывают основное влияние на CD13+ позитивные предшественники неклассических и промежуточных моноцитов. Медиаторы эритроидных клеток стимулируют апоптотические изменения в опухолевых клетках, но не всегда способствуют их быстрой гибели. Цитотоксические МНК в присутствии кондиционной среды эритроидных клеток здоровых доноров также оказывают цитотоксический эффект на опухолевые клетки. Кондиционные среды от эритробластов взрослого костного мозга оказывают активирующее воздействие на рост гранулоцитарно-макрофагальных (GM-CFU) колоний в сравнении с контролем и эритроидных колоний при добавлении кондиционной среды от эритробластов.