Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Проведено генотипирование сформированной для целей проекта выборки на платформе чипа Infinium Global Screening Array (Illumina). Полученные сырые данные были процессированы для дальнейшего анализа. Полученные данные были использованы для вычисления показателей полигенного риска шизофрении на основе недавно (лето 2021 года) ставших доступными результатов работы третьего этапа международного Консорциума психиатрической геномики (Psychiatric Genomics Consortium, PGS 3). Как и ожидалось, разделение образцов на больных и здоровых стало гораздо лучше на новых данных, разница со старыми данными особенно заметна для релаксированных пороговых значений p-уровней, что отражает высокую полигенность шизофрении. Были определены также показатели полигенного риска на панели результатов полногеномного анализа ассоциаций (GWAS) для когнитивных (например, длительность обучения, интеллект и так далее) и психологических признаков (нейротизм, саморегуляция, субъективное благополучие и так далее), а также психических заболеваний (аутизм, биполярное расстройство, клиническая депрессия и так далее). Эти данные позволили нам сформировать выборку больных людей, которые имеют низкий и высокий полигенный риск шизофрении для дальнейшей работы. Нами была поставлена задача определить на уровне генной экспрессии особенности клеточных культур, которые получаются из биопсий обонятельного эпителия. Всего были проанализированы 11 биоптатов здоровых людей, для которых получены препараты нейросфер (NS), выращенных в соответствии с ранее опубликованными протоколами (Evgrafov et al. 2011, Feron et al. 2013). Из каждой культуры NS также получены монослойные клеточные культуры (neurospheres-derived cells, NDC). Из клеток выделена РНК и получены библиотеки для транскриптомного анализа (NEBNext Ultra II Directional RNALibrary Prep, NEB). Секвенирование выполнено для получения 10–20 миллионов прочтений (2 × 150 п.н.) на библиотеку. Подсчет числа прочтений, выровненных на гены, осуществлен с помощью инструмента “salmon”. Анализ дифференциально экспрессируемых генов между 11 парами NS и NDC выполнен с использованием пакета R “DESeq2”. Транскриптомное типирование клеток выполнено с использованием t-SNE с находящимися в свободном доступе данными, полученными из архива SRA (NCBI). Мы использовали объединенные нормализованные данные транскриптов на миллион (TPM), отфильтрованные по идентификаторам Ensembl, у которых TPM был больше пяти не меньше чем в 90% всех данных. Для многомерной редукции использовали log-трансформированные значения TPM. Многомерная редукция была осуществлена с помощью пакетов R: 1) “Rtsne” для t-SNE с настройками по умолчанию (реализация Barnes-Hut с начальным PCA с 50 основными компонентами и параметром perplexity = 15) и 2) “umap” для UMAP с настройками по умолчанию («наивный» метод). Те же данные были использованы для вычислений ранговой корреляции Спирмена с известными транскриптомами. Оба типа анализа привели к одинаковым выводам: полученная картина генной экспрессии соответствует в большей степени нейроэпителиальным и стромальным гладкомышечным клеткам. Тот же вывод был сделан и на основе иммунофлюоресцентного окрашивания, когда мы наблюдали окрашивание клеток NS и NDC не только глиальным маркером, GFAP, и нейрональным, бета-тубулин III (bTubIII), но и васкулярными маркерами альфа-актин (SMA) и трансгелин (TAGLN). Дополнительно, мы сравнили наши данные с находящимися в свободном доступе транскриптомами нейрональных прогениторов, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека и обработанных различными химическими веществами (Kuusisto et al. 2019). Выяснилось, что картина генной экспрессии клеток NDC, но не NS, соответствует только одному набору данных, а именно нейрональным прогениторам, обработанным веществом манебом (фунгицид, ранее применявшийся в сельском хозяйстве). Хотя механизм действия манеба на нейрональные клетки не до конца исследован, манеб вместе с другим веществом паракватом используется для создания средовой модели (MNPQ) болезни Паркинсона. С помощью анализа на разделение наследуемости (LD-score regression) можно оценить, каким генетическим предрасположенностям соответствует данный набор геномных регионов. Мы осуществили такой анализ на самых сильно дифференциально-экспрессирующихся генах при трансформации NS в NDC, на почти 200 различных генетических данных. Оказалось, что наибольшую долю наследуемости эти гены занимают в наследуемости болезни Альцгеймера. Таким образом, дальнейшее изучение клеток NDC может быть полезно для исследования патогенеза нейродегенеративных заболеваний. Также мы провели системный анализ полученных транскриптомных данных, а именно анализ тех систем генов, которые задействованы в переходе от NS к NDC. Анализ обогащения наборов генов (GSEA) был выполнен с помощью пакетов R “msigdbr” и “clusterProfiler” с параметрами по умолчанию в списке генов, упорядоченных по логарифму p-уровня * знак кратного изменения экспрессии (FC), где значения p-уровней и FC были взяты из результатов Deseq2. Удалось определить, что основными онтологиями, для которых характерно обогащение в NS по сравнению с NDC, являются онтологии нейронального и васкулярного развития, причем вовлеченные гены часто включены в оба типа онтологий. Наоборот, экспрессия NDC обогащена «метаболическими» онтологиями, в том числе дыхания и белкового синтеза, что отражает их более высокий метаболический статус по сравнению с клетками нейросфер. На основе этой информации был оптимизирован протокол получения NDC, направленный на получение клеток с большей долей нейрональных маркеров. Дифференциальный анализ экспрессии и последующий системный анализ показал обогащение некоторыми “нейрональными” и “васкулярными” онтологиями, и обеднение “метаболическими” онтологиями в клетках NDC, выращенных по модифицированным протоколам, что делает их более похожими на NS. Поскольку полученные результаты указывают на то, что сами нейросферы являются более выигрышной клеточной моделью, чем NDC, мы сосредоточили свое внимание на получении этого материала. Мы рассматриваем эту модель как возможность совместного анализа генетических и функциональных данных, который до настоящего времени все еще не является распространенным. Этой теме посвящен обзор литературы, в котором мы описываем наше видение возможного применения генетических результатов в экспериментальной биологии (Kondratyev et al., Bench Research Informed by GWAS Results. Cells 10 (11). https://doi.org/10.3390/cells10113184). В рамках изучения редких мутаций, связанных с шизофренией, начато исследование материала, полученного от пациента, несущего de novo мутацию в гене, кодирующем переносчик ГАМК SLC6A1 и его родителей, в частности созданы ИПСК из фибробластов.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Продолжена работа по проведению полногеномного генотипирования образцов ДНК больных с диагнозом шизофрения и здоровых людей, в том числе вновь собранных образцов назальных биопсий. После пополнения выборки с учетом имеющихся генотипированных образцов в базе данных лаборатории для анализа стало доступно 1387 образцов, включая 806, полученных от больных с шизофренией и 581 контрольной группы (психически здоровые люди). Для этой выборки было проведено вычисление различных показателей полигенного риска, в частности для шизофрении (ППРш) на основе данных последнего полногеномного анализа ассоциаций (GWAS), полученным “Консорциумом психиатрических генетиков”, проект PGC3. Была изучена связь между полигенным риском шизофрении и клиническими проявлениями заболевания с использованием метода сопоставления крайних групп (метод экстремумов). Для этого провели сравнение больных расстройствами шизофренического спектра (F2) из верхнего и нижнего децилей распределения ППРш. В каждую группу вошло 80 человек. Анализировали следующие показатели: половой и диагностический состав, возраст начала заболевания, наличие семейной отягощенности заболеваниями ЦНС, наличие родовых осложнений, выраженность симптоматики по шкале PANSS и суицидальность (наличие в анамнезе суицидальных мыслей и попыток). Также проведена оценка модулирующей роли ППРш в эпигенетических и транскриптомных исследованиях. Влияние ППРш проверено при исследовании метилирования ДНК (мДНК) в локусах риска шизофрении, в которых можно ожидать существенного влияния средовых факторов на мДНК. Для определения того, насколько полигенный риск позволяет определить индивидуумов с редкими высокопенетратными мутациями на собранной лабораторной выборке было проведено экзомное секвенирование для образцов ДНК людей-носителей экстремальных значений полигенного риска. В выборку для экзомного секвенирования вошли 32 пациента с шизофренией с экстремально низкими и экстремально высокими значениями ППРш. Продолжены исследования клеточной модели биопсий обонятельного эпителия, собраны дополнительные образцы биопсий здоровых людей и больных шизофренией, из которых были получены новые препараты нейросфер, сконструированы новые транскриптомные библиотеки и получены новые транскриптомные данные. Изучен клеточный состав нейросфер с помощью секвенирования единичных клеток (scRNA-seq). Проведены анализ на дифференциальную экспрессию генов (Deseq2) в нейросферах, а оценка того, насколько сильно результаты зависят от включения в анализ генетических данных, таких как полигенный риск для шизофрении. Продолжена работа с культурами индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), полученных от пациентов с ранее верифицированными в процессе секвенирования мутациями. Для оценки функциональной роли изучаемых мутаций проведено исследование по созданию генетических конструкций для индуцибельной экспрессии генетических редакторов на основе нуклеазы Cas9 в составе лентивирусного вектора. В результате получены показатели полигенного риска для 40 признаков, в том числе шизофрении, биполярного расстройства, большой клинической депрессии, аутизма, СДВГ, образования, роста. Сравнение групп больных расстройствами шизофренического спектра (F2) из верхнего и нижнего децилей распределения ППРш выявило значимые различия по полу, наличию наследственной отягощенности по психоневрологическим заболеваниям, выраженности ряда значимых для течения и прогноза заболевания симптомов. Этот результат находится в соответствии с имеющимися в литературе данными о том, что ППР отражают не только риск развития шизофрении, но и оказывают модифицирующий эффект на ее клинические характеристики. Используемый нами метод экстремумов оказался эффективным, поскольку позволил выявить фенотипы с более высокой генетической предрасположенностью к шизофрении, которая была выше у женщин, а также у пациентов с семейной историей психических заболеваний различного генеза, что может указывать на генотип-средовую корреляцию и должно быть учтено при комплексной оценке факторов риска. Обнаружено, что у пациентов с высоким полигенным риском по шизофрении более выражена симптоматика при учтете длительности болезни, при этом важно отметить, что самый большой размер эффекта получен для наиболее специфичных для шизофрении симптомов – галлюцинации и нарушение внимания. Полученные данные свидетельствуют в пользу выдвинутого нами при формулировании цели и задач проекта предположения о том, что в группе с низкими ППРш шизофрения чаще возникает в результате редких или новых мутаций. Введение в модели для оценки связи мДНК с клиническими проявлениями шизофрении ППРш существенно влияет на результат анализа, что необходимо учитывать при поиске эпигенетических маркеров при исследовании этого заболевания. Изучение клеточного состава нейросфер позволило идентифицировать семь кластеров клеток с различными особенностями профилей генной экспрессии. Используя публичные данные, мы аннотировали эти клетки, как клетки радиальной глии и стромальные клетки головного мозга (васкулярные лептоменингиальные клетки). Данные scRNA-seq также позволили аналитически оценить клеточный состав нейросфер в полученных транскриптомах (деконволюция с DWLS и CIBERSORTx). Показано, что от включения в модель генетических данных сильно зависит результат, как и по конкретным генам, так по обогащению на генные онтологии. Этот результат, возможно, позволит определить кандидатов на генетически-независимые клеточные процессы, которые оказывают влияние на этиологию шизофрении. Полученные ранее ИПСК из фибробластов пациента, несущего de novo мутацию в гене SLC6A1, кодирующем переносчик ГАМК, и его родителей полностью охарактеризованы: показали способность к дифференцированию в три различных зародышевых листка.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Проведено моделирование клинических проявлений и выраженности нейропсихологических нарушений с помощью ППР шизофрении (ППРш) и аффективных расстройств, а также ППР признаков, связанных с нейропсихологическим функционированием. Показаны небольшие, но значимые эффекты ППРш на возраст начала заболевания и возраст первой госпитализации, а также выраженность негативной симптоматики, оцененной с помощью PANSS. При исследовании связи полигенного груза шизофрении и аффективных расстройств с изменением диагнозов в процессе лечения между рубриками F3 и F2 найдена негативная корреляция изменения диагноза только с ППРш. В отчетном периоде был значительно расширен список фенотипов, включенных в анализ влияния ППРш на гетерогенность заболеваний спектра шизофрении методом экстремумов. Проведен анализ медицинских записей больных для более дифференцированного сравнения групп по (1) социально-демографическим характеристикам: наследственной отягощенности по эндогенным психозам и более широкому кругу нейропсихиатрических состояний; полу; количеству детей в семье; порядку рождения; уровню образования; семейному положению; занятости; (2) средовым факторам риска шизофрении: сезону рождения; месту рождения (фактор урбаниcтичности); родовым осложнениям с выделением таких факторов как гипоксия/асфиксия и низкий вес при рождении; наличию неблагоприятного детского опыта; наличию предшествующих манифестации психического расстройства тяжелых соматических или инфекционных заболеваний, операций и черепно-мозговых травм; преморбидному опыту употребления психоактивных веществ; (3) преморбидным характеристикам: наличию неврологических симптомов и состояний; когнитивному развитию; социальному поведению - сложностям общения в детстве и асоциальным проявлениям в подростковом возрасте; (4) клиническим характеристикам: диагнозам; возрасту начала (детская шизофрения, ранняя (с началом в подростковом возрасте) и с началом в юношеском и взрослом возрасте); наличию когда-либо в ходе болезни 7 основных симптомов, необходимых для постановки диагноза шизофрении по МКБ-11, с выделением среди психомоторных нарушений гиперкинетических, гипокинетических и аномальных; злоупотреблению алкоголем и другими ПАВ; и суицидальности. Помимо перечисленных устойчивых параметров, группы сравнили по выраженности на момент обследования 6 доменов PANSS. При сравнении групп с наиболее высокими и самыми низкими ППРш выявлены значимые различия между группами по полу, наследственной отягощенности эндогенными психозами и другими нейропсихиатрическими состояниями, преморбидным неврологическим, когнитивным признакам и общительности, наличию в течение жизни и выраженности на момент обследования позитивной симптоматики. Результаты в совокупности позволяют охарактеризовать группы с ВР и НР шизофрении, выделив мишени, которые могут определять ход болезни и качество жизни пациентов, и, следовательно, корректировать терапевтические подходы. Для группы ВР полученные данные подтверждают ряд существовавших ранее результатов и гипотез (Taylor et al. 2022). Так, высокий ППРш в семьях ожидаемо ведет к накоплению родственников с эндогенными психическими расстройствами. Высокая представленность в ВР женщин согласуется с идеей о более высоком пороге у них проявления наследственной предрасположенности к шизофрении. Также для ВР характерно повышение позитивных и негативных симптомов, но на первое место в различиях между группами выступают симптомы первого ранга – бред и, на уровне тенденции, галлюцинации. Другими важными характеристиками ВР, по-видимому, отражающими механизмы действия ППРш, является посредственная успеваемость (но не грубое ее снижение) в школе, преморбидные трудности общения в детстве в виде застенчивости и небольшого числа друзей, а после начала заболевания - психомоторные симптомы «аномального домена», включающего в том числе манерность и позирование. Относительно выборки НР, результаты указывают на ее неоднородность с точки зрения генетических механизмов. С одной стороны, в ней обнаруживается повышение числа лиц с менее тяжелыми формами заболевания (вялотекущей шизофренией), а с другой наблюдается накопление лиц с преморбидной неврологической симптоматикой и когнитивным дефектом, что в полной мере согласуется с представлениями о вкладе редких мутаций и CNV в развитие шизофрении у пациентов с более низкими ППР шизофрении. Помимо перечисленных признаков к факторам риска, указывающим на вклад неполигенной наследуемости и необходимость экзомного анализа, можно отнести мужской пол и наличие аутистических черт в виде серьезных коммуникативных нарушений, что сходно с рекомендациями для общей популяции. На примере конкретного пациента со сложной клинической картиной заболевания, затрудняющей постановку диагноза и соответствующего этому диагнозу ведение пациента, показано, что его генетические особенности (повышенные ППРш и ППР БП) в определенной мере объясняют наличие у него симптомов шизофрении и аффективного расстройства, а присутствие ассоциированной с шизофренией редкой мутации в гене SLC6A1 могло повлиять на процессы синаптического возбуждения и торможения, инициируемые ГАМК. Для дальнейшего исследования функциональной роли мутации получены соответствующие линии нейрональных стволовых клеток из ИПСК пациента и его родителей. Проведен поиск новых мутаций у пациентов с низким полигенным риском шизофрении. Для экзомного секвенирования отобраны образцы, принадлежавшие пациентам с наименьшими значениями ППРш из общего выборки (n = 879). Перспективные мутации, связанные с шизофренией, обнаружены в генах BSN, SHANK3, DMXL2, PTK2 и ANKRD12. Особый интерес представляет мутация в гене синаптического белка “presynaptic cytomatrix bassoon” (BSN). Этот ген находится в одном из индексных регионов GWAS шизофрении (Trubetskoy et al. 2022), располагается в зоне, обогащенной CNV в исследованиях подобных мутаций (Marshall et al. 2018), и имеет высокий рейтинг, особенно для PTV, согласно результатам самого крупного на сегодняшний день исследования редких мутаций, ассоциированных с шизофренией (SCHEMA, Singh et al. 2022). Продолжен анализ данных, полученных из обонятельных нейросфер. С помощью смешанной референс-направляемой сборки данных коротких (Illumina) и полученных в этом году длинных (Oxford Nanopore) прочтений получена кастомизированная аннотация транскриптомов нейросфер обонятельного эпителия. Осуществлено повторное картирование и количественная оценка данных scRNA-seq и RNA-seq с использованием новой аннотации и обновленной методики обработки первичных транскриптомных данных. Изменения включали применение инструментов STAR и Salmon для мэппинга прочтений, что позволило более точно исследовать и анализировать генетические данные, в том числе сделать новый анализ на различия использования транскриптов в рамках отдельных генов (DTU). Это позволило глубже понять связанные с шизофренией молекулярные процессы, происходящие в обонятельных нейросферах. Для детального изучения клеточной структуры нейросфер проведены работы по их типированию, включая иммуноокрашивание с использованием различных маркеров. Полученные данные оказались полезными для понимания клеточного состава и функций нейросфер. Наблюдалось сильное окрашивание для маркеров нестина, a-SMA и трансгелина, что свидетельствовало о присутствии разнообразных типов клеток и подтверждало сложность клеточной организации в нейросферах. В рамках анализа единичных клеток был проведен анализ scmap, сопоставляя данные нейросфер с широким спектром публично доступных данных. Кроме того, был проведен дополнительный анализ псевдовремени с использованием пакета "monocle3", что позволило выявить генные модули и траектории развития клеток в нейросферах. Особый интерес представлял модуль, связанный с нейрональными процессами и экспрессией генов в корневых клетках и клетках с высоким псевдовременем. Это позволило определить сходство клеток нейросфер с различными типами клеток мозга и других органов, уточняя их клеточную принадлежность и функции.