Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Первый год выполнения проекта был посвящен формированию экспериментальной группы добровольцев для участия в физиологическом исследовании с силовой тренировкой, выполнению программы физиологического исследования и получению образцов биологического материала для дальнейших этапов исследования. В соответствии с планом работ, из числа потенциальных участников было отобрано 10 кандидатов, максимально удовлетворяющим критериям включения в исследование. В их число вошли молодые мужчины, в возрасте от 19 до 28 лет, не имеющие противопоказаний к выполнению упражнений с физическими отягощениями, с отсутствием регулярных занятий с силовыми упражнениями и отсутствием медицинских противопоказаний ко взятию биопсий из четырехглавой мышцы бедра. Окончательное решение о допуске в исследование в качестве добровольца-испытуемого принималось после медицинского обследования и подписания каждым участником комплекта документов, регламентирующих медицинские и правовые аспекты добровольного участия в эксперименте. На следующем этапе по индивидуальному графику каждый испытуемый в течение 3 месяцев непрерывно принимал участие в физиологическом исследовании с силовой тренировкой. Тренировки осуществлялись 3 дня в неделю на тренажере для жима платформы ногами в положении сидя под контролем специалиста. Каждое тренировочное занятие состояло из разминки с небольшой нагрузкой и 3-5 рабочих подходов с нагрузкой 50-75% от максимальной силы, установленной для каждого испытуемого индивидуально. До и после выполнения всего тренировочного цикла с использованием метода магнитно-резонансной томографии (МРТ) были определены объемы четырехглавых мышц бедра обеих конечностей. В ходе проведения физиологического эксперимента у каждого участника брались образцы биопсий из латеральной головки четырехглавой мышцы бедра. Всего от каждого испытуемого было взято 6 образцов биопсий. Две биопсии были взяты в базальном состоянии до и через 12 недель тренировочной программы. Четыре биопсии - после завершения всего тренировочного цикла после проведений однократного тестового тренировочного занятия (ТТЗ), которые включали биопсии работавшей и не работавшей (контрольной) ноги с интервалом через 6 часов и 24 часа после однократной физической нагрузки. Биопсийный материал был заморожен в жидком азоте и оставлен на хранение для проведения на последующих этапах молекулярно-генетических и протеомных исследований. На части биопсийных образцов, соответствующих базальному состоянию до и через 12 недель выполнения тренировочной программы с использованием иммуногистохимического анализа были определены гистоморфометрические показатели образцов мышечных волокон (соотношение волокон I и II типа, площадь поперечного сечения волокон). В рамках генетической части исследования для всех 10 участников исследования было проведено генотипирование с использованием ДНК-чипа Illumina Omni Express Exome 8 v1.6 Kit. Объединенные генетические и гистоморфометрические данные новых участников и полученные нами ранее аналогичные данные по другим экспериментальным группам были использованы для проведения ассоциативных генетических исследований по характеристике наследственных факторов, влияющих на формирование исследуемого мышечного фенотипа. В частности, было проведено исследование, посвященное анализу ассоциаций между генетическими предикторами уровня тестостерона и морфофункциональными особенностями скелетных мышц. По результатам исследования установлены генетические маркеры, ассоциированные одновременно с повышенным уровнем тестостерона, увеличенными показателями гипертрофии мышечных волокон II типа, увеличенными показателями силы хвата кисти и нежировой массы тела. Проведена подготовительная работа по выбору и оптимизации протоколов сравнительного транскриптомного исследования, запланированного на следующем этапе работы по проекту. По результатам работ по отчетному этапу подготовлена научная публикация, индексируемая в базе данных «Скопус» (Scopus). Результаты работы были представлены на двух научных конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Второй год выполнения проекта был посвящен проведению иммуногистохимического и транскриптомного анализа образцов мышечной ткани, а также проведению генетических исследований по маркерам, ассоциированным с показателями композиции мышечных волокон. Иммуногистохимический анализ биопсий мышечной ткани был выполнен на образцах, взятых до и после 12 недель силовых тренировок мышц-разгибателей обеих ног. Оценивали композицию мышечных волокон (соотношение волокон I и II типа), площадь их поперечного сечения (ППС) и изменения этих показателей после тренировочного периода. Как и ожидалось, после тренировки был обнаружен существенный прирост ППС мышечных волокон II типа (быстрые), тогда как для волокон типа I (медленные) прирост был значительно меньше; мышечная композиция не изменилась. Эти данные согласуются с физиологическими данными, полученными нами на предыдущем этапе работы, а именно со значительным приростом максимальной произвольной силы (МПС) и объема четырехглавой мышцы бедра после тренировочного периода, и свидетельствуют о том, что предложенная нами тренировочная программа была эффективна для стимуляции роста мышечной ткани. Для всех биопсических образцов m.vastus lateralis было проведено транскрипционное профилирование (РНК секвенирование). Изменение транскриптомного профиля белок-кодирующих генов оценивали: 1) в базальном состоянии (утром натощак) до и через 12 недель тренировочной программы; 2) через 8 ч и 24 ч после однократной тренировочной нагрузки для работавшей и не работавшей мышцы контрлатеральной ноги. Важно отметить, что такой подход позволил нам впервые оценить изменения генной экспрессии, вызванные сократительной активностью при однократной силовой тренировке, а не связанные с действием системных факторов (питание, циркадные ритмы и т.д.). Помимо этого, с помощью метод позиционных весовых матриц, нами впервые был проведен поиск транскрипционных факторов, ассоциированных с изменением генной экспрессии в ответ на регулярные силовые тренировки и однократную тренировочную нагрузку. Было показано, что гены, изменившие экспрессию в ответ на регулярные упражнения и однократное тренировочное занятие значительно отличаются. Такая же особенность была отмечена и при анализе ассоциированных с ними транскрипционных факторов. Этот факт говорит о выраженной специфичности транскриптомного ответа в каждом из исследуемых условий: после периода регулярных силовых тренировок, и через 8 ч и 24 ч после однократной тренировки. По-видимому, это связано с активацией специфических сигнальных путей, регулирующих различные наборы транскрипционных факторов и их генов-мишеней в каждом из изучаемых нами условий. Изучение роли этих факторов в адаптации скелетной мышцы к высокоинтенсивным упражнениям, стимулирующим рост мышечной массы, представляется перспективной задачей. Помимо этого, было проведено пилотное исследование по изучению взаимосвязи между экспрессией микроРНК (РНК секвенирование) в m. vastus lateralis и мышечной композицией. Для этого в анализ были включены пробы из мышц, максимально отличающихся по показателям соотношения быстрых и медленных типов мышечных волокон). Удалось показать взаимосвязь между уровнем экспрессии ряда проанализированных микроРНК и преобладающим типом мышечного волокна в изучаемых образцах. Работы по этому направлению будут завершены на следующем этапе. Были проведены ассоциативные генетически исследования с использованием данных, полученных в ходе выполнения 1-го и 2-го этапа проекта и аналогичных по характеристикам данных наших предыдущих работ (РНФ № 17-15-01436). Так, выполнено полногеномное ассоциативное исследование (GWAS), входе которого был охарактеризован новый генетический маркер в гене CDKN1A, варианты полиморфизма которого ассоциированы с преобладающим типом мышечного волокна, а экспрессия самого гена положительно коррелирует с высоким содержанием мышечных волокон II типа и силовыми характеристиками профессиональных спортсменов. В другом исследовании, были охарактеризованы кандидатные генетические маркеры (n=15), ассоциированные со скоростными характеристиками ходьбы, в числе которых для полиморфизма гена IGSF3 rs699785, была подтверждена ассоциация с преобладанием волокон II типа m. vastus lateralis в группе добровольцев, ведущих активный образ жизни. Проведена подготовительная работа по выбору и оптимизации протоколов подготовки образцов мышечной ткани для панорамного масс-спектрометрического протеомного анализа, запланированного на следующий этапе работы по проекту. По результатам работ по второму этапу подготовлены 2 научные публикации, индексируемые в базах «Web of Science» и «Скопус» (Scopus) и 1, индексируемая в РИНЦ. Результаты работы так же были представлены в виде докладов на четырех научных конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
На отчетном этапе проекта были осуществлены работы по протеомному анализу белков в препаратах, полученных из биоптатов мышечной ткани, завершены работы по транскриптомному профилированию, выполнен комплексный биоинформатический анализ полученных результатов, завершены генетические исследования по маркерам, ассоциированным с показателями композиции мышечных волокон. Количественный панорамный протеомный анализа белков с изобарической меткой был выполнен на биопсийных образцах m.vastus lateralis в базальном состоянии до и через 12 недель тренировочной программы для всех участников исследования. Суммарно в образцах мышечной ткани удалось достоверно идентифицировать 1174 белка, что является ожидаемым и достаточным количеством для оценки изменений протеома в ответ на длительную силовую нагрузку. Результаты исследования показали, что 12-недельная тренировка изменила содержание относительно небольшой доли (9,1%), преимущественно цитоплазматических белков. Мы полагаем, что выявленные изменения экспрессии ряда белков могут быть тесно связаны с адаптацией скелетной мышцы к регулярным силовым тренировкам, а именно к действию механического и метаболического стресса на мышечное волокно. Была проведена оценка изменения транскриптома после 12-недельной тренировки и осуществлен анализ специфического ответа генов на однократную сократительную активность мышцы. Гены, изменившие экспрессию после 12-недельной тренировки, были ассоциированы с внеклеточными белками, включая белки внеклеточного матрикса, что согласуется с данными других исследований по эффектам силовых тренировок. При оценке генного ответа на однократную нагрузку для исключения влияния системных факторов, не связанных с сократительной активностью, учитывались транскриптомные изменения и в контрлатеральной (неработающей) мышце. Таким образом, при сопоставлении нагружаемой и не нагружаемой мышцы были установлены наборы генов, специфических только для сократительной активности. Сопоставление изменения протеома после 12-недельной тренировки с изменениями экспрессии соответствующих мРНК после всего тренировочного периода, а также через 8 ч и 24 ч после однократной нагрузки показало, что лишь для незначительной доли идентифицированных белков изменения их содержания коррелирует с изменением экспрессии соответствующих им мРНК. Такой результат может объясняться большей ролью регулировки содержания белков, изменяемых силовой тренировкой на посттранскрипционном уровне (синтез/деградация белка), а также ограничениями метода, позволяющего анализировать только часть протеома, состоящую преимущественно из высокопредставленных белков. Завершены работы по анализу в мышечной ткани фракции малых некодирующих РНК с использованием оптимизированного протокола секвенирования на платформе MiSeq и NextSeq (Illumina). В среднем, в образцах определялось от 345 до 395 вариантов микроРНК, 5 из которых (miR-206, miR-501-3p, miR-185-5p, miR-499a-5p и miR-208-5p) показали специфичность своей экспрессии к преобладающему типу мышечного волокна. Экспрессия вариантов miR-208b-3p и miR-499a-5p положительно коррелирует с экспрессией их генов-носителей MYH7 и MYH7B и отрицательно с их генами-мишенями (CDKN1A и FOXO4). Негативная корреляция экспрессии пары miR-208b-3p – CDKN1A подтверждает найденные и опубликованные нами ранее данные о том, что повышенная экспрессия гена CDKN1 ассоциирована с преобладанием мышечных волокон быстрого типа, что косвенно подтверждается достоверными ассоциациями и с силовыми характеристиками у испытуемых добровольцев и силовой специализацией у профессиональных спортсменов в дополнительных группах сравнения. Таким образом, по результатам этой части работы получены новые данные о роли малых некодирующих РНК и микроРНК, в частности, в формировании композиционного состава скелетных мышц и регуляции гипертрофических изменений в ответ на силовую нагрузку. В рамках запланированных исследований с использованием ранее полученных данных генотипирования и транскриптомного профилирования было завершено исследование, позволившее охарактеризовать влияние гена MDM4 на показатели гипертрофии мышечных волокон и силовые характеристики у профессиональных спортсменов. В частности, показана ассоциация инсерционно/делеционный полиморфизма rs35493922 и повышенной экспрессии гена MDM4 с большей долей мышечных волокон быстрого типа и степенью их гипертрофии в m. vastus lateralis в группе добровольцев. Выявлена ассоциацию варианта и экспрессии гена с силовыми характеристиками в группах профессиональных спортсменов, показана взаимосвязь D варианта полиморфизма с большей долей безжировой массы тела. По результатам работ по отчетному этапу подготовлены 3 научные публикации, индексируемые в базах «Web of Science» и/или «Скопус» (Scopus). Результаты также были представлены в виде устных докладов на двух научных конференциях.