Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Было экспериментально продемонстрировано, что рост внутриклеточной концентрации кальция (в среднем по популяции тромбоцитов) однозначно определяется произведением времени вспышки на концентрацию caged ADP. Данный параметр пропорционален количеству АДФ, выделившемуся в результате воздействия вспышки. Зависимость отклика от концентрации АДФ имеет характер роста с насыщением. Было показано, что использование адреналина при малой концентрации АДФ приводит к кратному росту отклика тромбоцитов, а при большой концентрации АДФ не приводит к изменениям. Совместно с коллегами из ИЦиГ СО РАН было произведено несколько попыток получить культуру лейкоцитов, экспрессирующую флуоресцентный индикатор кальция. Для этого мы приобрели плазмиду pGP-CMV-GCaMP6s (Addgene plasmid # 40753 ; http://n2t.net/addgene:40753 ; RRID:Addgene_40753). Однако данная работа пока не увенчалась успехом из-за плохой выживаемости культуры – предположительно из-за токсичности данного индикатора для клеток. Проводились контрольные эксперименты с клетками Jurkat (Т-лимфоциты) и Raji (B-лимфоциты) для оценки их реакции на арахидоновую кислоту. Однако на данный момент не удалось получить надёжных данных, в частности, не удалось зарегистрировать положительный контроль (тест на кросс-сшивку антителами к CD3 для клеток Jurkat). Ранее в проекте были синтезированы потенциальные доноры оксида азота на основе нитро-нитритной перегруппировки мезо-(нитрофенил)-BODIPY. Были изучены фотофизические свойства данных соединений с использованием спектрофотометрии, времяразрешённой флуориметрии, ЯМР и ВЭЖХ, а также квантово-химических расчётов. Можно с уверенностью сказать, что данные вещества не способны к выделению NO в детектируемых количествах. Однако был получен большой набор данных для ряда данных соединений, и по результатам этой работы подготовлен текст статьи «Optical studies of BODIPYs with sterically-hindered nitrophenyls in meso-position». Поскольку синтезированный ряд диметилнитробензольных производных BODIPY не показал эффективной фотогенерации оксида азота, мы переключили свое внимание на доноры на основе группы N-NO. Такой подход широко представлен в литературе. были получены фотодоноры оксида азота, работающие в зеленой области спектра. Для получения фотодонора, работающего в красной области, мы использовали подход, описанный в работе https://doi.org/10.1021/jacs.8b05514 . Мы получили нитро-производное, но, в отличие от работы https://doi.org/10.1021/jacs.8b05514 , ввели его не в перекрестную конденсацию, а в результате гомоконденсации с ацетатом аммония, дальнейшей конденсации с трифторидом бора и нитрозирования получили целевому продукту на основе Aza-BODIPY. Его интересной особенностью является является то, что под действием света он может генерировать 2 молекулы NO. В спиртовом растворе под действием света с длиной волны 660 нм было зарегистрировано эффективное выделение NO. Также мы обнаружили обратную реакцию, что позволяет использовать данное вещество не просто как фотодонор NO, а как буферную систему, способную захватывать NO и высвобождать в нужный момент под контролем света. Ранее в проекте мы получили фотолабильные группы на основе мезо-(4-гидроксиметилфенил)-BODIPY и показали, что они подходят для фотогенерации карбоновых кислот. В отчётном году был получен ещё один вариант фотолабильной группы. Сопоставляя скорость фотолиза в растворе дейтерометанола полученных соединений со скоростью фотолиза аналогичного мезо-гидроксиметил-BODIPY, известного из литературы, мы оценили квантовые выходы высвобождения уксусной и фторбензойной кислот, и они превышают таковой для литературного аналога в 1.6 – 15 раз. Производные фторбензойной кислоты показывают большую эффективность по сравнению с уксусной кислотой, что может указывать на механизм распада типа Е1 в возбужденном состоянии, так как п-фторбензоат является лучшей уходящей группой, чем ацетат. Однако, необходимо отметить, что все исследованные ФЗГ при фотолизе генерируют фторид-анион или HF, что может существенно ограничить их использование в биологических исследованиях.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Было исследовано влияние строения остова BODIPY на эффективность фотоиндуцированной генерации NO в соединениях типа мезо-(СН2-NNO-R)-BODIPY. Продемонстрирована возможность независимо влиять на квантовый выход NO и синглетного кислорода, приведены практические рекомендации по дизайну фотодоноров NO на основе BODIPY с заданными свойствами. По этим материалам опубликована статья (препринт) «A Novel Scaffold for Nitric Oxide Photo-Releasers based on Meso-Aminomethyl-BODIPY». Статья находится на рассмотрении в Journal of Photochemistry and Photobiology A. Разработан метод создания и поддержания на заданном уровне концентрации NO в водной среде. Для этого использовался раствор фотодонора NO в органическом растворителе (ДМСО), отделённый от водной среды газопроницаемой мембраной. Показано, что использование электрохимического датчика ISO-NOP, источника лазерного излучения и PID-алгоритма обратной связи позволяет решить поставленную задачу. По этим данным опубликована статья (препринт) «Photocontrolled Release of Nitric Oxide for Precise Management of NO Concentration in a Solution». Статья находится на рассмотрении в Biomaterials Advances. Также были разработаны подходы к синтезу донора NO на основе производного Aza-BODIPY с улучшенной растворимостью, содержащего NEt2 группы. Был оптимизирован протокол экспериментов с культурами лейкоцитов для исследования их реакции на арахидоновую кислоту. Проведены эксперименты с использованием фотолабильных аналогов арахидоновой кислоты, показана активация клеток в ответ на вспышку УФ излучения. Опубликована статья «Novel UV-Releaser of Arachidonic Acid Based on Nitrophenyl-type Photoremovable Protecting Group». В отчётном году было проведено исследование активации тромбоцитов в ответ на оптический стимул для 20 пациентов с сахарным диабетом I типа. Также был разработан новый метод для запуска активации локализованным стимулом с помощью сфокусированного луча лазера, получены новые экспериментальные данные о взаимном влиянии тромбоцитов в процессе активации. Также было продемонстрировано ингибирование активации тромбоцитов с помощью доноров оксида азота, разработанными в проекте. Полученные в ходе выполнения проекта в 2022 году результаты, помимо упомянутых выше статей, были опубликованы в статье «Photophysical properties of BODIPYs with sterically-hindered nitrophenyls in meso-position» в журнале Journal of Luminescence, доложены в виде устного сообщения на VI Международной конференции «Современные синтетические методологии для создания лекарственных препаратов и функциональных материалов» (MOSM 2022), секция «Фотоактивные материалы, красители и хемосенсоры: синтез, свойства и применение», Екатеринбург, 7–11 ноября 2022 года, а также в виде трёх стендовых докладов на конференции «Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology (BGRS/SB-2022)», Новосибирск, 2022 г.