Аннотация результатов, полученных в 2021 году
I. ИЗОФОРМ-СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ Na,K-АТФазы И КЛАУДИНОВ: РОЛЬ ЛИПИДНОГО ОКРУЖЕНИЯ. Данная часть проекта основана на современных представлениях о том, что функциональная гетерогенность белков обусловлена не только их молекулярным разнообразием, но также специфической мембранной локализацией, особенностями регуляции и взаимодействием с белковым и липидным окружением. Полученные нами ранее результаты позволяют предположить специфичность субмембранной локализации альфа2-изоформы Na,K-АТФазы и клаудина-1, а также их взаимодействий с молекулярным, в том числе, липидным окружением. Для проверки этого предположения в опытах 2021 г. в качестве инструмента дестабилизации липид-упорядоченной фазы плазматической мембраны мы применяли традиционный подход с использованием метил-бета-циклодекстрина (MbCD), который позволяет частично удалять мембранный холестерин. Исследование роли мембранного холестерина в локализации и функционировании альфа2-изоформы Na,K-АТФазы в скелетной мышце в условиях хронических нарушений двигательной активности было продолжено нами на модели бокового амиотрофического склероза (линия трансгенных мышей FUS1-513 с эктопной нейроспецифической экспрессией укороченного гена FUS человека). Контролем служили мыши дикого типа CD1. Было выявлено снижение плотности распределения альфа2-изоформы Na,K-АТФазы в мембране диафрагмальной мышцы мышей FUS, аналогичное обнаруженному нами ранее у мышей Bla/J и mdx – моделей дисферлинопатии и миодистрофии Дюшенна, соответственно. Таким образом, у всех трех моделей (FUS, Bla/J и mdx), принципиально отличающихся по молекулярным механизмам нарушений двигательной активности, наблюдается сходное нарушение мембранной локализации альфа2-изоформы Na,K-АТФазы в диафрагмальной мышце. Было установлено также, что влияние частичного удаления мембранного холестерина с помощью MbCD на распределение альфа2-изоформы намного сильнее выражено у мышей FUS. Известно, что один из механизмов деструкции липидных рафтов при мышечной дисфункции может быть связан с накоплением в мембране церамида. Опыты с применением флуоресцентного аналога церамида (BodipyFL C5-ceramide) позволили выявить нарушение механизма везикулярного транспорта церамида у мышей FUS. Применение MbCD в культуре клеток гладких мышц A7r5 подтвердило, что функциональное взаимодействие альфа2-изоформы Na,K-АТФазы с молекулярным окружением, важные для реализации внутриклеточного Ca2+ сигналинга, существенно зависит от мембранного холестерина и реализуется в специализированных микродоменах плазматической мембраны. Данные подтверждают также специфичность регуляторной функции альфа2-изоформы в этих клетках наряду со скелетной мышцей. Проведено предварительное исследование эффектов MbCD в отношении барьерных свойств эпителиальных тканей крысы. В условиях внутривенного введения MbCD in vivo изменений барьерных свойств ткани тощей и толстой кишки не обнаружено. Однако выявлена способность MbCD модулировать экспрессию клаудинов-1 и -5 в эндотелии кровеносных сосудов головного мозга. При остром (in vitro) применении MbCD зарегистрировано увеличение тока «короткого замыкания» в ткани тощей кишки, которое может быть связано с изменением активности Na,K-АТФазы и косвенно указывает на роль липидного окружения в модуляции функционального взаимодействия Na,K-АТФазы и клаудинов. II. ИЗОФОРМ-СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ Na,K-АТФазы И КЛАУДИНОВ В УСЛОВИЯХ МОДЕЛИРОВАНИЯ ГРАВИТАЦИОННОЙ РАЗГРУЗКИ. В данной части работы было продолжено исследование последствий превентивного введения крысам уабаина (1 мкг/кг), включая условия однократного его введения. Антиортостатическое вывешивание проводили в течение 6 ч после однократного или хронического введения уабаина. В опытах на камбаловидной мышце крысы показана неспособность однократного введения уабаина предотвращать вызываемую вывешиванием деполяризацию мембраны. Установлено, что только хронически циркулирующий уабаин способен модулировать электрогенную активность Na,K-АТФазы и электрогенез мышцы, что может быть основой протективных свойств уабаина в условиях моделирования гравитационной разгрузки. Напротив, в тканях тощей и толстой кишки, а также лобных долей головного мозга, уже при однократном введении уабаина проявлялась его способность модулировать экспрессию клаудинов-1, -2, -5 и окклюдина и предотвращать вызываемые вывешиванием нарушения в тканях кишки. III. ИЗОФОРМ-СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ Na,K-АТФазы И КЛАУДИНОВ В УСЛОВИЯХ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭНДОТОКСЕМИИ. Отработана модель LPS (липополисахарид)-индуцированного нарушения целостности эпителиального барьера в культуре клеток линии IPEC-J2. Установлено, что уабаин (10 нМ), специфический лиганд Na,K-АТФазы, способен предотвращать вызванное LPS нарушение барьерных свойств монослоя клеток за счет увеличения уровня «уплотняющих» клаудинов-1 и -3 без изменения уровня клаудина-5. Полученные данные свидетельствуют о функциональной значимости взаимодействия Na,K-АТФазы и клаудинов в условиях моделирования эндотоксемии in vitro, что подтверждает полученные нами ранее данные в условиях in vivo. IV. ИЗОФОРМ-СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ Na,K-АТФазы И КЛАУДИНОВ В УСЛОВИЯХ МОДЕЛИРОВАНИЯ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ. Анализ дозо-чувствительности эпителия тощей кишки крысы по изменениям барьерных свойств показал, что оптимальной для дальнейших исследований является доза общего ионизирующего излучения 10 Гр с пострадиационным периодом 72 ч. При таком протоколе облучения в тощей кишке наблюдалось увеличение уровня «уплотняющего» клаудина-1 и порообразующего клаудина-2, ткань толстой кишки была сравнительно резистентна к воздействию излучения. В диафрагмальных мышцах этих же крыс выявлена деполяризация сарколеммы, обусловленная предположительно снижением электрогенной активности альфа2-изоформы Na,K-АТФазы. V.ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ Na,K-АТФазы И КЛАУДИНОВ В УСЛОВИЯХ МОДЕЛИРОВАНИЯ ГИПОКСИИ. В опытах in vivo с применением барокамеры моделировали условия гипобарической гипоксии в течение 3-х ч при атм. давлении 530 либо 370 мм рт.ст. (соответствует высотам 3000 и 6000 м). Ткани изолировали через 3 или 24 ч после гипоксического воздействия. Гипоксию в условиях in vitro создавали заменой оксигенации перфузирующего раствора карбогеном на азотсодержащую смесь с последующей реоксигенацией. Полученные данные свидетельствуют об изменении барьерных и транспортных процессов в эпителии тощей и толстой кишки крысы только при гипобарической гипоксии. В диафрагмальной мышце гипобарическая гипоксия вызывала долговременную (в течение 24 ч) гиперполяризацию сарколеммы за счет увеличения электрогенной активности альфа2-изоформы Na,K-АТФазы. Эти изменения сопровождались устойчивым снижением уровня циркулирующего эндогенного уабаина и увеличением уровня ТБК-активных продуктов. Уровень кортикостерона, редокс статус и активность лактатдегидрогеназы не изменялись. Кратковременная (60 мин) гипоксия в условиях in vitro в течение 15 мин вызывала аналогичную по величине гиперполяризацию, которая, однако, была обратимой при реоксигенации карбогеном. VI. ВЛИЯНИЕ ПРЕДНИЗОЛОНА НА УРОВЕНЬ КЛАУДИНОВ В ТКАНИ МОЗГА. Завершена работа по изучению влияния хронического введения преднизолона на белки плотных контактов в ткани лобных долей мозга мыши. Впервые в ткани мозга, помимо уплотняющих клаудинов-1, -3, -5, участвующих в организации гематоэнцефалического барьера, обнаружен также порообразующий клаудин-2, что важно для понимания механизма регуляции ионного и водно-солевого баланса в ГЭБ. Установлено, что внутримышечное введение преднизолона (70 мг/кг) в течение семи суток модулирует экспрессию клаудинов-1, -2 и -3 без изменения их локализации в кровеносных сосудах. Учитывая способность глюкокортикоидов модулировать Na,K-АТФазу, эти данные дополнительно подтверждают возможность функциональной связи между Na,K-АТФазой и клаудинами in vivo. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Поставленные в проекте задачи выполнены полностью. В опытах с новыми экспериментальными моделями функциональных нарушений и воздействий получены дополнительные подтверждения высокой степени пластичности альфа2-изоформы Na,K-АТФазы в мышечной ткани по сравнению с функционально стабильной альфа1-изоформой. Также подтверждено, что клаудин-1, экспрессируемый всеми эпителиальными клетками, характеризуется гораздо большей способностью к адаптивному ремоделированию по сравнению с прочими исследованными клаудинами. Опыты с дестабилизацией липид-упорядоченной фазы плазматической мембраны подтверждают важность липидного окружения в такой функциональной специфичности альфа2-изоформы Na,K-АТФазы и клаудина-1. Полученные результаты подтверждают также физиологическую значимость функционального взаимодействия Na,K-АТФазы и клаудинов, в частности в условиях эндотоксемии. В опытах 2022 г. планируется продолжение этих разработок. ПУБЛИКАЦИИ 2021 г. В ЖУРНАЛАХ Web of Science Core Collection: СТАТЬЯ (квартиль Q1): Kravtsova, V.V.; Paramonova, I.I.; Vilchinskaya, N.A.; Tishkova, M.V.; Matchkov, V.V.; Shenkman, B.S.; Krivoi, I.I. Chronic Ouabain Prevents Na,K-ATPase Dysfunction and Targets AMPK and IL-6 in Disused Rat Soleus Muscle. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3920. doi:10.3390/ijms22083920. pdf файл IJMS-2021. СТАТЬЯ (квартиль Q2): Livanova AA, Fedorova AA, Zavirsky AV, Bikmurzina AE, Krivoi II, Markov AG. Dose and time dependence of functional impairments in rat jejunum following ionizing radiation exposure. Physiol Rep. 2021, 9(15): e14960. doi:10.14814/phy2.14960. pdf файл Physiol Rep-2021. СТАТЬЯ (квартиль Q4): Kravtsova V.V., Krivoi I.I. Molecular and Functional Heterogeneity of Na,K-ATPase in the Skeletal Muscle. J. Evol. Biochem. Physiol. 2021. 57: 835-851. doi: 10.1134/S0022093021040086. pdf файл J Evol Biochem Physiol_2021. СДАНА В ПЕЧАТЬ (WoS CC, квартиль Q1): Markov AG, Krivoi II, Bikmurzina AE, Vinogradova EP, Kruglova NM, Amasheh S, Fromm M, Krug SM. Chronic Prednisolone Targets both Tightening Claudin-1, -3, and Channel-Forming Claudin-2 Detected in Mouse Brain Blood Vessels. Brain Structure and Function. pdf файл «Отчет РНФ 18-15-00043_Допматериалы_2021». СТАТЬЯ ПОДГОТОВЛЕНА К ПОДАЧЕ (WoS CC, квартиль Q1): Kravtsova VV, Tishkova MV, Matytsin VO, Ganapolsky VP, Fedorova AA, Vetrovoy OV, Krivoi II. Simulating High-Altitude Hypoxia Modulates Na,K-ATPase to Improve Membrane Electrogenesis in Rat Diaphragm Muscle. Int. J. Mol. Sci. pdf файл «Отчет РНФ 18-15-00043_Допматериалы_2021».

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Исследования проводили по следующим направлениям. I. ИЗОФОРМ-СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ Na,K-АТФазы И КЛАУДИНОВ: РОЛЬ ЛИПИДНОГО ОКРУЖЕНИЯ. 1) СКЕЛЕТНАЯ МЫШЦА. Исследование было продолжено на модели бокового амиотрофического склероза (линия трансгенных мышей FUS1-513 с эктопной нейроспецифической экспрессией укороченного гена FUS человека). Контролем служили мыши дикого типа CD1. В 2022 г. были проведены комбинированные опыты с ингибированием альфа2-изоформы уабаином, сочетанным с активацией везикулярного транспорта путем прямой стимуляции диафрагмальных мышц. Полученные данные дополнительно подтверждают нарушения механизма везикулярного транспорта церамида, а также локализации альфа2-изоформы Na,K-АТФазы в сарколемме мышей FUS. Кроме того, впервые установлено участие альфа2-изоформы в модуляции везикулярного трафика, выявлены особенности этой модуляции у мышей FUS. Полученные данные не только подтверждают важность липидного окружения в способности альфа2-изоформы Na,K-АТФазы к адаптивному ремоделированию, но и показывают новый механизм ее участия в формировании липид-упорядоченной фазы плазматической мембраны. 2) ЭПИТЕЛИАЛЬНАЯ ТКАНЬ. Установлено, что удаление части мембранного холестерина с помощью метил-бета-циклодекстрина (MbCD) нарушает барьерные свойства тощей кишки крысы только при его аппликации на базолатеральную сторону, где локализована Na,K-АТФаза. Одновременно наблюдается уменьшение уровня снижающего проницаемость клаудина-1, без изменения уровня порообразующего клаудина-2. Предварительная блокада киназы легких цепей миозина (белок апикального актомиозинового кольца) ингибитором ML-7 ослабляет эти эффекты MbCD. Полученные данные подтверждают нашу гипотезу о роли липидного окружения в специфической пластичности клаудина-1 и его функционального взаимодействия с Na,K-АТФазой, которое может включать связывающий эти белки актомиозиновый комплекс. II. ИЗОФОРМ-СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ Na,K-АТФазы И КЛАУДИНОВ В УСЛОВИЯХ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ. 1) ЭПИТЕЛИАЛЬНАЯ ТКАНЬ. Анализ мозаики и уровня клаудинов показал наличие дозо-зависимости и сегмент-специфичности действия ионизирующего излучения на барьерные свойства тощей и толстой кишки крысы. Выявлен превентивный эффект хронического введения уабаина при воздействии высокой дозы облучения (10 Гр) для отдельных сегментов кишки, молекулярный механизм которого предположительно связан с изменением уровня поро-образующего клаудина-2 за счет его функционального взаимодействия с Na,K-АТФазой. Изменений в уровне и локализации клаудинов в эндотелии головного мозга при введении уабаина в условиях ионизирующего излучения не выявлено. 2) СКЕЛЕТНАЯ МЫШЦА. Впервые установлено, что ионизирующее излучение (10 Гр) специфически снижает электрогенный вклад альфа2-изоформы Na,K-АТФазы (без изменения содержание белка этой изоформы) в диафрагме крысы, вызывая тем самым деполяризацию сарколеммы. Хроническое превентивное введение уабаина предотвращает данные нарушения. Этот эффект сопровождается повышением концентрации уабаина в циркуляции и отсутствием индуцированного излучением подавления перекисного окисления липидов. Учитывая решающую роль Na,K-АТФазы в функционировании скелетных мышц, эти результаты могут иметь терапевтическое значение в качестве контрмер в условиях индуцированной ионизирующим излучением мышечной патологии. III.ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ Na,K-АТФазы И КЛАУДИНОВ В УСЛОВИЯХ МОДЕЛИРОВАНИЯ ГИПОКСИИ. 1) ЭПИТЕЛИАЛЬНАЯ ТКАНЬ. Слабая и умеренная гипобарическая гипоксия вызывают сегмент-специфичные изменения в эпителиальном слое слизистой оболочки тощей и толстой кишки, что отражает перераспределение транспортных потоков в этих отделах. В основе лежит изменение уровня белков плотных контактов в эпителии этих сегментов. В эндотелии сосудов головного мозга гипоксия вызывает избирательное влияние на молекулярный состав белков плотных контактов. Полученные результаты свидетельствуют, что гипоксия является фактором, изменяющим барьерные функции эпителия различных тканей путем изменения молекулярных детерминант плотных контактов. 2) СКЕЛЕТНАЯ МЫШЦА. Впервые установлено, что гипобарическая гипоксия (соответствует 3000 м над уровнем моря) в течение 3 ч увеличивает электрогенную активность альфа2-изоформы Na,K-АТФазы и устойчиво (в течение 24 ч) гиперполяризует внесинаптическую область сарколеммы в диафрагме крысы. Эти изменения сопровождаются увеличением продукции TBARS (thiobarbituric acid reactive substances), а также снижением уровня эндогенного уабаина в сыворотке крови. Гипоксия также увеличивает плотность распределения альфа2-изоформы Na,K-АТФазы в мембране без изменения общего содержания этого белка; липид-упорядоченная фаза плазматической мембраны не изменяется. В камбаловидной мышце гипоксия предотвращает деполяризацию сарколеммы, вызываемую функциональной разгрузкой (вывешивание задних конечностей). Учитывая, что Na,K-АТФаза имеет решающее значение для поддержания электрогенеза и работоспособности скелетных мышц, эти результаты могут иметь значение в качестве контрмер при патологии, вызванной функциональной разгрузкой. IV. ДРУГИЕ ЗАВЕРШЕННЫЕ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ И СДАННЫЕ В ПЕЧАТЬ СТАТЬИ. Подведен итог и опубликованы результаты исследований механизма Ca2+ вспышек, вызываемых микромолярными концентрациями уабаина в культуре клеток гладких мышц A7r5. Впервые показано участие альфа2-изоформы Na,K-АТФазы в данном феномене, для реализации которого требуется взаимодействие между альфа2-изоформой и Src-киназой. Полученные данные подтверждают специфичность регуляторной функции альфа2-изоформы Na,K-АТФазы в гладкомышечных клетках наряду со скелетной мышцей. Завершены и опубликованы результаты исследований роли липидного окружения в барьерных свойствах плотных контактов эндотелия сосудов головного мозга крысы. Подготовлены и сданы в печать статьи по влиянию ионизирующей радиации, а также глюкокортикоида преднизолона на барьерные свойства эндотелия. ПУБЛИКАЦИИ 2022 г. В ЖУРНАЛАХ Web of Science Core Collection: СТАТЬЯ (квартиль Q1): Kravtsova, V.V.; Fedorova, A.A.; Tishkova, M.V.; Livanova, A.A.; Vetrovoy, O.V.; Markov, A.G.; Matchkov, V.V.; Krivoi, I.I. Chronic Ouabain Prevents Radiation-Induced Reduction in the alpha2 Na,K-ATPase Function in the Rat Diaphragm Muscle. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 10921. doi: 10.3390/ijms231810921. pdf файл: IJMS-2022-a. СТАТЬЯ (квартиль Q1): Kravtsova, V.V.; Fedorova, A.A.; Tishkova, M.V.; Livanova, A.A.; Matytsin, V.O.; Ganapolsky, V.P.; Vetrovoy, O.V.; Krivoi, I.I. Short-Term Mild Hypoxia Modulates Na,K-ATPase to Maintain Membrane Electrogenesis in Rat Skeletal Muscle. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 11869. doi: 10.3390/ijms231911869. pdf файл: IJMS-2022-b. СТАТЬЯ (квартиль Q1): Rognant S, Kravtsova VV, Bouzinova EV, Melnikova EV, Krivoi II, Pierre SV, Aalkjaer C, Jepps TA, Matchkov VV. The microtubule network enables Src kinase interaction with the Na,K-ATPase to generate Ca2+ flashes in smooth muscle cells. Front. Physiol. 2022.13:1007340. doi: 10.3389/fphys.2022.1007340. pdf файл: Frontiers Physiol-2022. СТАТЬЯ (квартиль Q4): Markov, A.G., Bikmurzina, A.E., Fedorova, A.A., Krivoi, I.I. Methyl-beta-Cyclodextrin Alters the Level of Tight Junction Proteins in the Rat Cerebrovascular Endothelium. J Evol Biochem Phys 2022. 58, 849–855. doi: 10.1134/S0022093022030188. pdf файл: JEvolBiochemPhys-2022. СДАНА В ПЕЧАТЬ (WoS CC, квартиль Q1): Livanova AА. Fedorova AA., Zavirsky AV., Krivoi II., Markov AG. Dose- and Segment-Dependent Disturbance of Rat Gut by Ionizing Radiation: Impact of Tight Junction Proteins. Int. J. Mol. Sci. СДАНА В ПЕЧАТЬ (WoS CC, квартиль Q2): Markov AG., Krivoi II., Bikmurzina AE., Vinogradova EP., Kruglova NM., Amasheh S., Fromm M., Krug SM. Chronic Prednisolone Targets both Tightening Claudin-1, -3, and Channel-Forming Claudin-2 Detected in Mouse Brain Blood Vessels. BioMed Research International.