Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Целью исследования является изучение изменения эпигенетических маркеров, включая профиль фрагментов транспортной и рибосомальной РНК в сперматозоидах крыс и людей при воздействии возраста (крысы), характеристик пубератного периода и гормонального профиля (люди), а также при действии химических экспозиций хлорорганическими соединениями, свинцом и фталатами (люди) и ингибиторами горения (крысы). В течение первого года научный коллектив сфокусировался на оптимизации биоинформатических подходов для анализа экспрессии малых РНК, включая фрагменты транспортной РНК (фтРНК) и фрагменты рибосомальной РНК (фрРНК), полученных методом NGS. Существующий подход предполагает последовательное картирование прочтений на последовательности транскриптов разных баз (Shi et al., 2018), что было использовано в ряде последних работ со сперматозоидами (Nätt et al., 2019; Zhang et al., 2021). Однако такой подход имеет сразу несколько существенных недостатков. Для их устранения наш коллектив провел интеграцию баз используемых транскриптов, в ходе которой проведены исправления, в т.ч. локусы транскриптов транслированы в координаты одной версии сборки генома, последовательности транскриптов приведены в соответствие с последовательностями соответствующих локусов генома, отфильтрованы транскрипты, имеющие пересечения локусов, аннотация приведена к стандартному формату gtf, транскрипты, имеющие несколько локусов, реализованы как multi-feature транскрипты (Stupnikov et al, in preparation). Для получения экспрессионных данных были реализованы несколько вариантов препроцессинга: на основе Rsubread, RSEM и Kallisto с использованием наших образцов и образцов из публичных источников данных (Donkin et al., 2016; Ingerslev et al., 2018). Было принято решение для дальнейшего анализа использовать два подхода, в силу наибольшей сбалансированности сигнала, детектируемого для разных типов РНК, а также лучшей согласованности с наблюдаемыми ранее результатами, описанными в литературе: 1) подход на основе Rsubread; 2) подход на основе kallisto с длиной k-мера 11. Для анализа фрагментов тРНК и рРНК была проведена адаптация существующего инструмента SPORTS, устраняющая проблемы аннотаций транскриптов. После получения экспрессионных данных для транскриптов малых РНК и их фрагментов, для решения дифференциальной задачи применялся инструмент DESeq2 (Love et al., 2014). Выбор этой модели обусловлен прежде всего возможностью анализировать данные со сложной структурой и противопоставления групп разного состава с наличием ковариат, а также его устойчивостью, отмеченной в литературе (Stupnikov et al., 2021). Для данных человека также использовалась база данных фтРНК MINTBase. Был проведен анализ изменений профилей фрагментов тРНК и рРНК в сперматозоидах крыс в зависимости от возраста и перинатальной экспозиции бромированным антипиретиком БДЭ-47. Данный анализ не выявил изменений связанных с химической экспозицией. В то же время, он показал глубокие возрастные изменения. В частности профиль фрагметов тРНК и рРНК оказался хорошим предиктором возраста. Разные биоинформатические подходы идентифицировали высоко-представленные и возраст зависимые фрагменты тРНК и рРНК. Эти фрагменты картируются на 36 зрелых тРНК, 1 зрелую рРНК (объединение подходов). Оба подхода идентифицировали восемь зрелых тРНК и 1 зрелую рРНК (пересечение подходов). Интересно, что две тРНК, дифференциально экспрессируемые в зависимости от траекторий полового развития и от уровня ФСГ крови мужчин в нашем исследовании (tRNA-Gln-CTG и tRNA-Gln-TTG), были дифференциально представлены в сперматозоидах крыс разного возраста. Фрагменты одной из этих тРНК являются также возраст-зависимыми у мышей (Guo et al., 2021). Используя наши и литературные данные, мы проанализировали пересечение между различными возраст-зависимыми эпигенетическими механизмами в сперматозоидах крыс. Сравнение координат возраст-зависимых дифференциально метилированных регионов (ДМР) и локусов возраст-зависимых малых РНК показало значительное пространственное перекрывание этих двух механизмов, предполагая, что по меньшей мере часть возраст-зависимых изменений различных эпигенетических механизмов связана с друг другом причинно-следственно. Мы также проанализировали перекрывание возраст-зависимых ДМР с регионами ДНК, связанными с гистонами (РДГ), так как подавляющее большинство гистонов в сперматозоидах замещается протаминами для компактизации хроматина . Этот анализ идентифицировал 1330 генов, ассоциированных одновременно с ДМР и РДГ. Большинство категорий, обогащенных этими генами, связаны с эмбриональным развитием, а категории болезней были ранее выявлены, как патологии, имеющие повышенный риск развития у детей, зачатых отцами в пожилом возрасте. Подобные патологии включают расщепление неба, детскую лейкемию, бластомы, и болезни развития нервной системы. Таким образом, нуклеосомы маркируют участки ДНК, подверженные изменениям в зависимости от возраста и, вероятно, других факторов, и участвующие в регуляции развития. Эти участки могут быть использованы как цели для разработки терапевтических мероприятий, направленных на поддержание здоровья потомства пожилых родителей. Для данных малой РНК человека - с учетом проведенной оптимизации пробоподготовки (опубликована статья (Shtratnikova et al., 2021), и оптимизации биоинформатических подходов для работы с данными малой РНК, коллектив провел реанализ полученных прочтений образцов малой РНК сперматозоидов 49 участников исследования. С целью уменьшения ложноположительных результатов и сохранения достаточного количества детектируемых мнкРНК при последующем анализе дифференциальной экспрессии были предприняты различные способы фильтрации списков малой РНК в двух основных подходах, Rsubread и Kallisto с длиной kmer=11. В результате предварительных экспериментов был выбран оптимальный способ, на основе Rsubread, с отсечкой “минимальное количество каунтов на малую РНК>5 в не менее, чем половине образцов”. В результате для анализа дифференциальной экспрессии было отобрано 101 миРНК, 167 пиРНК, 4 рРНК, 35 зрелых тРНК и 23 фрагмента тРНК (всего 330 мнкРНК). Ранее, в рамках предыдущего гранта РНФ 14-45-00065 с помощью RRBS были получены данные метилирования ДНК 36 образцов сперматозоидов человека, среди которых были отобраны 47 531 CpG, детектированных во всех образцах. Для всей когорты участников родительского исследования Russian Childen’s Study были определены траектории полового развития на основании ежегодно измеренного объема яичек с 8-9 лет до 18-19 лет, n=489 (Plaku-Alakbarova et al, in press). Таким образом, 49 молодых мужчин, включенных в эпидемиологическое эпигенетическое исследование, были классифицированы по траекториям полового развития: «медленнее, slower (n=22, 45%)», «средне, moderate (n=18, 37%)» и «быстрее, faster (n=9, 18%)». Нами выявлено, что подростки/мужчины из траектории «медленнее» характеризовались медленным стартом увеличения объема яичек, меньшим объемом яичек в 18-19 лет, и худшими показателями качества семени (меньше концентрация сперматозоидов, меньше количество прогрессивно подвижных сперматозоидов) по сравнению с подростками/мужчинами из двух других траекторий (Sergeyev et al, in preparation). В образцах крови, собранных вместе с образцами семени, были определены уровни гормонов. Уровень фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) крови в 18-19 лет отрицательно коррелировал с траекториями пубертата (rho=-0.55). Проведен анализ влияния различных физиологических вариантов течения пубертата и уровня гормонов на такие эпигенетические маркеры сперматозоидов мужчин молодого возраста, как метилирование ДНК и профиль малой РНК, включая фтРНК и фрРНК. Было обнаружено, что уровень некоторых гормонов крови в 18-19 лет (ФСГ, в первую очередь, а также ТТГ, эстрадиол, соотношение свободный тестостерон/эстрадиол, соотношение тестостерон/ЛГ) сопровождался изменениями как экспрессии миРНК, пиРНК, фрагментов тРНК, так и изменениями метилирования ДНК сперматозоидов. Обнаружены общие тРНК, фрагменты которых дифференциально экспрессированы и в зависимости от траекторий полового развития и от уровня ФСГ крови мужчин. Это tRNA-Gln-CTG и tRNA-Gln-TTG. Примечательно, что фрагменты для этих тРНК также дифференциально экспрессированы и в сперматозоидах крыс в зависимости от возраста. По данным литературы, фрагменты одной из этих тРНК в сперматозоидах, tRNA-Gln-TTG, существенно связаны с качеством семени (Chen et al., 2021), играют важную роль в развитии эмбриона (Chen et al., 2020). В текущем году нашей междисциплинарной международной командой были представлены 2 устных доклада на 21 международном Европейском семинаре по проблемам мужских гонад (21st European Testis Workshop, https://etw2021.org/). “Peripubertal serum concentrations of dioxins and sperm small non-coding RNAs in the prospective cohort of healthy young men“ и “ Aging Induces Profound Changes in Rat Sperm Epigenome and These Changes are Modified by Perinatal Exposure to Environmental Flame Retardant”. Также был представлен доклад «Эпигеном сперматозоидов: изучение возраст-ассоциированных изменений» на форуме QIAGEN Day 2021 в Москве https://www.youtube.com/watch?v=onwNqLnbHhM. В октябре 2021 года в МГУ был организован рабочий визит членов научного коллектива, профессоров Университета Массачусетса, Амхерст, США, Александра Суворова и Джонатана Ричарда Пилзнера. Было проведено 4 совместных семинара. Подана статья-обзор «Age-associated epigenetic changes in mammalian sperm: implications for offspring health and development” в журнал Human Reproduction Update (Q1).

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Целью исследования в текущем году являлось изучение изменения эпигенетических маркеров, включая профиль малых некодирующих РНК (мнкРНК) и фрагментов транспортной РНК, в сперматозоидах мужчин 18 лет в зависимости от параметров качества эякулята и при воздействии хлорорганических соединений, свинца в перипубертатном периоде, а также фталатов в 4 уязвимые периода пубертата (препубертат, ранний период пубертата, поздний период и половая зрелость). Оптимизация биоинформатических подходов. Перед выполнением биоинформатического анализа коллектив провел существенную поисково-сравнительную работу существующих подходов по предобработке и анализу как малых РНК, так и фрагментов тРНК, с использованием метрик (бенчмарков) на каждой стадии анализа, включая тримминг ридов, фильтрацию, картирование, количественную оценку количества транскриптов и анализ дифференциальной экспрессии. Для мнкРНК наиболее предпочтительным был выбран следующий подход: 1) нижнее ограничение длины рида - 15, верхнее ограничение - «длина рида минус 40% длины адаптера»; 2) использование bowtie с 1 допустимым мисматчем; 3) использование интегрированной аннотации транскриптов малой РНК, разработанной коллективом (Stupnikov et al., 2022); 4) фильтрация по медианному количеству ридов на транскрипт >5; 5) использование DESeq2 для анализа дифференциальной экспрессии. Для анализа фрагментов тРНК наиболее предпочтительным был выбран следующий подход: 1) очищенные прочтения картируются на референсный геном; 2) отбираются прочтения, выровненные на тРНК; 3) данные экспрессии получаются с помощью kallisto с длиной к-мера 11 (Bezuglov et al., 2022). Для анализа профиля малых РНК сперматозоидов в разных слоях после фракционирования, матрица каунтов была разделена на 2 подгруппы в зависимости от плотности (зрелости) сперматозоидов. Для статистического анализа были использованы следующие малые РНК с медианным количеством чтений более 5: в слое сперматозоидов меньшей плотности (зрелости): 116 зрелых миРНК, 191 пиРНК, и 37 фтРНК (всего 344); в слое сперматозоидов большей плотности (зрелости): 99 зрелых миРНК, 247 пиРНК, и 47 фтРНК (всего 393). Фталаты в 4 уязвимых периода пубертата и эпигенетические изменения сперматозоидов. Была изучена связь с эпигенетическими изменениями, включая профиль мнкРНК и метилирование ДНК сперматозоидов, как 15 индивидуальных метаболитов фталатов, так и групп фталатов по их химическому строению и биологическим эффектам, в частности, ΣDEHP = (MEHP + MEHHP + MEOHP + MECPP), ΣDiNP = (MHiNP + MOiNP + MCOP), ΣDiDP = (MHiDP + MOiDP + MCNP), Σ Анти-андрогенные фталаты (AAP) = (MEHP + MEHHP + MEOHP + MECPP + MnBP + MiBP + MBzP + MHiNP + MOiNP + MCOP). Экспозиция фталатов изучалась в 4 уязвимых периода пубертата (препубертат, ранний период пубертата, поздний период и половая зрелость). Обнаружено, что воздействие в каждый из периодов (допубертат, начало пубертата, середина пубертата, половая зрелость) характеризуется значимыми изменениями как многих CpG, так и некоторых малых РНК сперматозоидов в 18 летнем возрасте. Например, экспозиция в допубертатном периоде сопровождалась изменениями 52 и 34 мнкРНК в сперматозоидах большей и меньшей зрелости, соответственно; экспозиция в раннем пубертатном периоде сопровождалась изменениями 78 и 19 мнкРНК в сперматозоидах большей и меньшей зрелости, соответственно; в позднем пубертатном периоде – 24 и 61; в периоде половой зрелости – 26 и 26 мнкРНК в сперматозоидах большей и меньшей зрелости, соответственно, при adjusted p-value (FDR) < 0.05. Можно отметить, что в течение экспозиции в допубертатном и раннем пубертатном периоде больше изменяется профиль мнкРНК в зрелых (плотных) сперматозоидах, а в течение экспозиции в позднем пубертатном периоде и половой зрелости больше изменяется профиль мнкРНК в незрелых (менее плотных) сперматозоидах. Выявлены 45 мнкРНК, значимо ДЭ с не менее чем 4 метаболитами фталатов (adjusted p-value (FDR) < 0.10). Функциональный анализ целевых генов топ мнкРНК выявил такой биологический путь на первом месте, как «молекулы адгезии клеток» (-log10(P)=13). Среди топ мнкРНК, часто ДЭ в зависимости от экспозиции с фталатами выявлен, в частности, фрагмент тРНК tRF-19-Q9B1XSI9_21107, который представляет собой i-tRF фрагмент CysGCA тРНК длиной 19 нуклеотидов (GCTTCAAACCTGCCGGGGC). Он выраженно отрицательно связан с уровнем концентрации метаболитов диизонилфталатов ΣDiNP в моче в периоде позднего пубертата. А нами ранее установлено, что экспозиция метаболитами ΣDiNP в этом периоде отрицательно связана с качеством семени (Minguez-Alarcon et al., 2022). Представляет особый интерес тот факт, что этот фрагмент в зрелых сперматозоидах положительно взаимосвязан с уровнем ЛГ, тестостерона крови, и с уровнем ТТГ, а также в незрелых сперматозоидах положительно связан с показателями качества семени (концентрация сперматозоидов, их подвижность, общее количество прогрессивно подвижных сперматозоидов (ОКППС)) и объемом яичек. Функциональный анализ показал на первом месте сигнальную систему андрогенового рецептора (-log10(P)=3.7). Таким образом выявленный фрагмент тРНК - i-tRF CysGCA (GCTTCAAACCTGCCGGGGC) в сперматозоидах может служить маркером происходящих в сперматозоидах изменений, связанных как с химической экспозицией фталатами в перипубертатном периоде, так и физиологически обусловленными процессами, связанными с действием гормонов гипофизарно-гонадной оси (ЛГ и тестостерон) и сперматогенезом. По результатам многофакторного анализа сформирована матрица дифференциально метилированных CpG и метаболитов фталатов в моче в 4 пубертатных периода. Экспозиция в допубертатном периоде сопровождалась изменениями метилирования 2797 CpG в сперматозоидах; экспозиция в раннем пубертатном периоде сопровождалась изменениями 2385 CpG, в позднем пубертате – 3434, в период половой зрелости – в 1275 CpG, при p-value < 0.005. Обнаружены 25 CpG, которые дифференциально метилированы более чем для 4 метаболитов фталатов в один из 4 периодов пубертата. С учетом установленного факта, что экспозиция метаболитами ΣDiNP в позднем пубертатном периоде отрицательно связана с качеством семени (Minguez-Alarcon et al., 2022), анализ CpG в разные периоды при экспозиции диизонилфталатами показал, что больше всего ДМ CpG наблюдается именно в этом периоде – 478, по сравнению с 152 в препубертатном, 123 в раннем пубертатном и 73 в периоде половой зрелости, p-value < 0.005, что подтверждает особую уязвимость для данных фталатов периода позднего пубертата (объем яичек ≥10 - 15 мл, медианный возраст=13.13 лет). Хлорорганические соединения и профиль малой РНК сперматозоидов. Обнаружены дифференциально экспрессируемые (ДЭ) мнкРНК сперматозоидов в зависимости как от перипубертатной экспозиции (в 8-9 лет) диоксинов, так и фуранов, диоксиноподобных ПХБ, недиоксиноподобных ПХБ и хлорорганических пестицидов. Обращает на себя внимание существенно большие изменения среди менее зрелых (менее плотных) сперматозоидов (SUL), в частности, 16 ДЭ мнкРНК при экспозиции Σ диоксин подобных соединений. Хлорорганические пестициды, метаболит ДДТ ppDDE и гексахлорциклогексан (ГХЦГ) имели 15 и 8 ДЭ мнкРНК, соответственно. Оценка вариабельности профиля мнкРНК в повторных якулятах. В 10 парных эякулятах, собранных с недельным интервалом, оценена вариабельность экспрессии 188 микроРНК, 930 пиРНК, 326 рРНК, 128 тРНК с помощью расчета средней разницы между парами, попарного сравнения критерием Уилкоксона, коэффициента вариации, корреляции сопряженности и анализа Блэнда-Альтмана. Отмечается средняя сопряженность мнкРНК в повторных эякулятах, коэффициент корреляции сопряженности rho составил 0.71 для тРНК, 0.65 для пиРНК и 0.54 для миРНК. Было выявлено несколько высоковариабельных мнкРНК, в частности 3 пиРНК и 1 микроРНК, p-value < 0.005.