Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В соответствии с планом на 2021 год, были выполнены следующие работы и получены научные результаты: Проведен отбор потенциально наиболее диагностически ценных маркеров метилирования ДНК для предсказания эффективности неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) РМЖ биоинформатическим алгоритмом, позволяющим на основе результатов скрининга дифференциального метилирования ДНК по данным широкогеномного метилирования XmaI-RRBS непосредственно моделировать виртуальные ампликоны для дизайна систем маркеров метилчувствительной количественной ПЦР (МЧ-кПЦР). Отбор маркеров проведен на основе анализа результатов проведенного ранее в рамках настоящего проекта широкогеномного бисульфитного секвенирования 100 образцов биоптатов - по 50 образцов РМЖ люминального В (LumB) и триждынегативного (TН) подтипов. Критерии отбора участков генома для включения в качестве маркеров в диагностическую панель на основе МЧ-кПЦР были следующими: количество сайтов узнавания чувствительных к метилированию эндонуклеаз BstHHI (GCG/C) и/или HpaII (C/CGG) в ампликоне должно быть больше 2, а длина вставки ампликона - не более 100 пар нуклеотидов. Чтобы оценить дискриминативный потенциал отдельных маркеров, выбранных описанным способом, мы рассчитали индивидуальную чувствительность, специфичность и площадь под ROC-кривой (cvAUC) для каждого потенциального ампликона с кросс-валидацией при 100 случайных разбиениях на обучающую и тестирующую выборки в соотношении 4:1. Наилучшие показатели диагностической ценности с точки зрения предсказания чувствительности к НАХТ опухолей тройного негативного подтипа показали маркеры метилирования генов DLEU2, SOCS3, MSI1, RUSC1, TFAP2C, KREMEN1, MYO15B, CACNA1H, MIR3648, MIR3687, ANKRD20A19P, EZH2, ZIC2 и трех межгенных CpG-островков. Для опухолей люминального В подтипа наилучшие маркеры принадлежат CpG-островкам генов ADRA2A, CD8BP, SCARF2, SLC9A3, PTPRT, YBX1P1, FSTL1, FAM83H-AS1, FSTL1, TRABD, MYO15B, TMEM132C, NR2F6, TMEM132D, ADCY9, BNIP3, KCNQ1-AS1 и целого ряда межгенных CpG-островков. Интересно, что полученный нами список маркеров метилирования ДНК с наилучшими прогностическими показателями содержит два участка генома, расположенные в сегментах хромосом 15q11.2 и 11p15.5, в которых расположены протяженные кластеры импринтированных генов. Для импринтированных участков ДНК характерно моноаллельное метилирование, т.е., один аллель (определенного родительского происхождения) всегда метилирован, а второй (другого родительского происхождения) – всегда неметилирован во всех соматических клетках взрослого организма. При этом импринтированные кластеры могут содержать в себе и неимпринтированные CpG-островки. Именно последние проявили в нашем исследовании высокие маркерные свойства с точки зрения различения опухолей с разной чувствительностью к НАХТ: CpG-островок на 15q11.2 содержит CpG-динуклеотиды, полностью метилированные в норме (биаллельное метилирование) и деметилирующиеся в части опухолей триждынегативного подтипа, причем в большей степени – в опухолях, не отвечающих на НАХТ, а CpG-островок на 11p15.5, напротив, практически неметилирован в нормальных тканях молочной железы и гиперметилируется в опухолевых тканях, причем для РМЖ люминального В подтипа – в большей степени в опухолях, отвечающих на НАХТ. Обнаружение дифференциального метилирования в хромосомных сегментах, содержащих кластеры импринтированных генов, напоминает о довольно популярной гипотезе «релаксации» импринтинга кластера на хромосоме 11p15.5, содержащего гены онкосупрессоров и фактора роста, в процессах онкогенеза. Полученные нами результаты широкогеномного скрининга метилирования позволили проверить справедливость этой гипотезы в отношении рака молочной железы. Нами не выявлено релаксации импринтинга ни в одном из двух центров импринтинга на хромосоме 11p15.5 ни в выборке из 100 образцов РМЖ в целом, ни в эпигенетических подтипах РМЖ по отдельности. Поскольку примененное нами клональное бисульфитное секвенирование ДНК является наиболее точным методом количественной оценки состояния метилирования геномных локусов, на основании полученных результатов мы можем уверенно утверждать, что изменений моноаллельного характера метилирования центров импринтинга на хромосоме 11p15.5 в процессе формирования злокачественных опухолей молочной железы не происходит. Тем не менее, как будет показано ниже, нормально импринтированный характер метилирования этих геномных участков нарушается в опухолях, но уже после химиотерапевтического воздействия (НАХТ). Из полученных списков виртуальных ампликонов выбрали те, для которых оказался возможен дизайн тест-систем, удовлетворяющих требованиям разработки: (1) в пределах участков отжига праймеров отсутствуют сайты узнавания метилчувствительных рестриктаз, уровень метилирования в которых не является маркерным относительно эффективности НАХТ, (2) разность значения медиан уровней метилирования маркерных сайтов узнавания в различаемых группах превышает относительную погрешность метода и в одной из групп уровень метилирования выше аналитической чувствительности метода МЧ-кПЦР (10%). Для выбора сочетаний ампликонов, обеспечивающих максимально качественную классификацию опухолей, были оценены все возможные комбинации ампликонов, составляющих потенциальные панели маркеров метилирования ДНК. С учетом пропущенных данных в XmaI-RRBS было получено 73 и 869 панелей (комбинаций) ампликонов, которые предсказывают ответ на НАХТ опухолей ТН и LumB РМЖ, соответственно. Комбинации с наилучшими показателями диагностической ценности были использованы для дизайна тест-систем многолокусной МЧ-кПЦР, который проводили с использованием модифицированного коллективом комплекта программного обеспечения MPprimer. Проведены дизайн и лабораторная отработка тест-систем многолокусной (пятицветной) МЧ-кПЦР в реальном времени с зондами, в которых в качестве репортеров выступали флуорофоры FAM, HEX, ROX, Cy5 и Cy5.5. В каждой тест-системе определялись кинетические кривые амплификации пяти локусов генома: трех исследуемых (участки CpG-островков генов, выбранные в качестве маркеров метилирования) и двух контрольных - внутреннего контроля и контроля полноты гидролиза. Локусы для положительного контроля выбирали из участков генома, не содержащих сайтов узнавания используемой рестриктазы. Контроли полноты гидролиза выбирали из участков генома, содержащих каждый по 2-3 сайта узнавания рестриктазы и неметилированных как в норме, так и в опухолях. На основе полученного списка сочетаний маркеров, для которых возможен дизайн тест-систем МЧ-кПЦР, сформировали 5 панелей, включающих в общей сложности 14 маркеров. В состав панелей входят внутренние контроли ПЦР и полноты гидролиза, и таргетные локусы – участки маркерных CpG-островков: (1) генов DLEU2, MYO15B и EZH2; (2) генов SOCS3 и DLEU2; (3) генов MSI1, KREMEN и межгенного CpG-островка 15q11.2; (4) генов CD8BP, KCNQ1-AS1 и SP6; (5) генов ADRA2A, SLC9A3, PTPRT. Первые три панели предназначены для прогноза чувствительности к НАХТ опухолей триждынегативного подтипа, последние две – для люминального В подтипа. Разработаны тест-системы, которые будут использованы в 2022 году для анализа тестирующих выборок образцов РМЖ триждынегативного и LumB подтипов. Рукопись статьи «Дизайн панелей предиктивных маркеров эффективности неоадъювантной химиотерапии триждынегативного рака молочной железы по результатам широкогеномного скрининга метилирования ДНК» с описанием и примерами реализации алгоритма на основе виртуальных ампликонов принята к печати в журнале «Генетика» (на 2022 год). Отдельно решалась задача разработки тест-системы для валидации панели маркеров (участки генов FERD3L и TRIP10), опубликованной зарубежным коллективом (Pineda с соавторами, 2019). Для валидации панели маркеров метилирования FERD3L и TRIP10 было принято решение использовать два типа тест-систем на основе бисульфитного секвенирования ДНК. Первая тест-система полностью воспроизводит таковую, описанную в статье Pineda с соавторами «A two-gene epigenetic signature for the prediction of response to neoadjuvant chemotherapy in triple-negative breast cancer patients» и реализуется в формате пиросеквенирования, на приборе PyroMark Q48 Autoprep. Дополнительно разработана тест-система для количественного анализа метилирования маркерных CpG-динуклеотидов методом клонального параллельного высокопроизводительного секвенирования ампликонов, полученных с бисульфит-модифицированных матриц ДНК с использованием праймеров из статьи Pineda. В последовательностях праймеров часть остатков тимина заменили на остатки урацила для обеспечения возможности редукции праймеров в процессе подготовки библиотек фрагментов перед лигированием с адаптерами. Подготовку ампликонов к секвенированию проводили с использованием наборов Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 (редукция праймеров и лигирование универсальных адаптеров) и Ion PGM Template IA 500 Kit (изотермическая клональная амплификация), загрузку чипов проводили в горячем боксе при температуре воздуха 45°C, и секвенировали на приборе Ion PGM (прибор и наборы реагентов Thermo Fisher, США). С целью изучения эпигенетических процессов в опухолях в процессе неоадъювантной химиотерапии в 2021 году проведено широкогеномное бисульфитное секвенирование 20 образцов core-биопсии РМЖ LumB типа, полученных до проведения НАХТ, и 20 операционных образцов тех же опухолей после химиотерапии. Были определены дифференциально метилированные участки генома, различающие опухоли до и после НАХТ. Для определения дифференциально метилированных участков мы отобрали 63314 CpG-динуклеотидов, по которым во всей совокупности исследуемых образцов наблюдалось не более 20% пропущенных данных о состоянии метилирования. Определены дифференциально метилированные участки генома, различающие опухоли до и после НАХТ, по трем категориям: 1) метилирование изменяется в опухоли до лечения относительно нормальной молочной железы и изменяется после лечения относительно образца до лечения; 2) метилирование изменяется в опухоли до лечения относительно нормальной молочной железы и сохраняется в результате НАХТ относительно образца до лечения; 3) метилирование не изменяется в канцерогенезе (в опухолевых образцах до лечения относительно нормальной молочной железы), но изменяется в результате НАХТ (в опухолевых образцах после лечения относительно нормальной молочной железы). Неожиданной находкой оказалось ярко выраженное изменение метилирования импринтированного гена KCNQ1OT1 в третьей группе сравнения. Нами показано, что метилирование этого гена не изменяется в процессе опухолеобразования (стабильность импринтинга, обсуждавшаяся выше), но значимо снижается в операционных образцах после НАХТ. На одном из участков CpG-островка KCNQ1OT1 уровни метилирования CpG-динуклеотидов снижаются после лечения практически до нулевых значений. Это наблюдение не может быть объяснено заменой клеточных популяций в образцах опухолей после лечения, и требует поиска других системных причин выраженного однонаправленного нарушения состояния метилирования после НАХТ. Основные биологические процессы, в которые вовлечены гены, дифференциально метилированные в опухолях, по трем перечисленным категориям сравнения, следующие. Первая категория – регуляция эмбрионального развития; регуляция продукции интерлейкина 6; хлоридный транспорт; регуляция ответа на химиотерапию. Вторая категория – кадгерин-опосредованная клеточная адгезия, специализация нейронов, дифференцировка стволовых клеток. Третья категория – сигнальный путь Wnt и его регуляция; сигналинг поверхностных клеточных рецепторов; регуляция миграции эпителиальных клеток. Основные метаболические и регуляторные пути, изменения которых посредством аномального метилирования ДНК характерны для РМЖ в результате НАХТ, по категориям сравнения: (1) сигнальные пути, задействованные в онкогенезе (в том числе, Wnt и NF-kappa B), метаболизм сахаров (галактозы, фруктозы, маннозы, сахаров нуклеотидов), метаболизм пирувата, гликолиз/глюконеогенез; (2) сигнальный путь VEGF; метаболизм сахаров (галактозы, фруктозы, маннозы), метаболизм аминокислот (глицина, серина, треонина, аланина, аспартата, глутамата), биосинтеза гликозаминогликанов; (3) сигнальные пути, задействованные в онкогенезе (в том числе, Hippo, Wnt, PI3K-Akt-mTOR), метаболизм пиримидинов. Следует отметить, что обогащение наборов дифференциально метилированных генов по их принадлежности к указанным выше биологическим процессам, метаболическим и регуляторным путям, определенное нами с помощью Gene Ontology (GO) Consortium Enrichment analysis tool и KEGG PATHWAY Database, статистически достоверно только на уровне значимости без поправки на множественное тестирование. Поправку на множественное тестирование не проходит ни одна из перечисленных позиций. Мы предположили, что обогащение наборов дифференциально метилированных генов по их принадлежности к метаболическим и регуляторным путям может оказаться более выраженным в категории сравнения, учитывающей только различия в уровнях метилирования CpG-динуклеотидов в образцах до и после НАХТ, безотносительно состояния метилирования тех же CpG-динуклеотидов в нормальных образцах молочной железы. Действительно, в наборе дифференциально метилированных генов из этой категории сравнения статистическая значимость обогащения со значениями p.adjust не выше 0,05 проявилась для сигнальных путей, задействованных в онкогенезе (в том числе, Wnt и Hippo) – гены AXIN2, CAMK2G, CREBBP, CTBP1, CTBP2, DAAM2, DKK1, FBXW11, FOSL1, FZD10, FZD6, FZD8, GPC4, JUN, LGR6, NFATC1, PRICKLE3, PRKACA, PRKCB, PRKCG, RAC3, RSPO1, SFRP2, SMAD4, TCF7L1, VANGL1, WNT11, WNT4, WNT5B, WNT6, и др., а также для сигнального пути глюкагона (ACACB, ADCY2, AKT1, AKT3, CAMK2G, CPT1A, CPT1C, CREB3L1, CREBBP, ITPR3, LDHA, PFKL, PHKA1, PHKB, PRKAB2, PRKACA, PRMT1) и для метаболизма жирных кислот (ACADL, CPT1A, CPT1C, ELOVL6, FASN, TECR). В целом, полученные результаты подтверждают предположение, сделанное на предыдущем этапе выполнения проекта о том, что в опухолях молочной железы в процессе НАХТ происходят значимые изменения метилирования множества геномных локусов. С практической точки зрения это означает, что использование операционных образцов, полученных после химиотерапии, для поиска эпигенетических маркеров чувствительности опухолей к НАХТ, недопустимо, поскольку приведет к ложным результатам. В 2022 году будет проведен широкогеномный скрининг дополнительной выборки образцов core-биопсии РМЖ LumB типа, полученных до проведения НАХТ, операционных образцов тех же опухолей после химиотерапии, что позволит уточнить результаты отчетного периода и сформулировать обоснованные гипотезы об основных метаболических и регуляторных путях и биологических процессах, изменения которых посредством аномального метилирования ДНК характерны для РМЖ в результате НАХТ. Проведен комплекс широкогеномных исследований (широкогеномное бисульфитное секвенирование XmaI-RRBS, хромосомный микроматричный анализ (ХМА) и высокопроизводительное секвенирование генов эпигенетических регуляторов (NGS)) на выборке 50 образцов злокачественных опухолей молочной железы с целью создания массива данных для изучения фундаментальных основ формирования паттернов аномального метилирования CpG-островков генов, характерных для РМЖ. Представлены аннотированные списки генетических вариантов, выявленных в группах гиперметилированных и умеренно метилированных опухолей. Из результатов NGS для анализа мутационного профиля РМЖ отбирали миссенс-замены, не аннотированные в базе данных ClinVar, нонсенс-мутации и мутации со сдвигом рамки считывания и/или замены, имеющие частоту минорного аллеля в общей базе данных gnomAD MAF<0,0005 . Всего нами выявлено 27 соматических мутаций, удовлетворяющих критериям отбора, в 19/50 (38%) образцах. Наибольшее число (15) мутаций определили в генах модификаторов гистонов, наименьшее (1) – в генах метилирования/деметилирования ДНК. Наиболее часто, по нашим данным, замены в образцах РМЖ происходят в генах лизиновых метилтрансфераз гистонов, причем мутации в генах KMT2А, KMT2С и KMT2D являются взаимоисключающими. Сравнение показывает, что генетические варианты присутствуют в опухолях гиперметилированного и умеренно метилированного подтипов РМЖ примерно с равной вероятностью. В то же время, наблюдаются различия по функциональным классам мутаций: в опухолях умеренно метилированного подтипа выявлены только миссенс-варианты, в то время как в опухолях гиперметилированного подтипа, наряду с миссенс-вариантами, выявлены также короткие делеции/инсерции со сдвигом рамки считывания, нонсенс-вариант, вариант сайта сплайсинга и полногенная делеция. Полученные результаты будут использованы в 2022 году в работе по изучению фундаментальных основ формирования паттернов аномального метилирования на основе комплексного анализа результатов широкогеномного анализа метилирования, хромосомного микроматричного анализа и NGS генов эпигенетической регуляции в единой выборке образцов. Заложен теоретический задел для решения одной из задач 2022 года («Проверка предложенных в заявке гипотез о формировании паттернов аномального метилирования CpG-островков генов, характерных для РМЖ»). В частности, на 2022 год запланирована проверка гипотезы, которая предполагает ведущую роль нарушений моноаллельного метилирования CpG-островков вследствие нарушений копийности участков генома в формировании аномальных метиломов опухолей умеренно метилированного эпигенетического подтипа РМЖ. Мы проанализировали динамику изменений состояния нормально моноаллельно метилированных CpG-динуклеотидов в образцах РМЖ обоих эпигенетических подтипов и показали, что в геномах умеренно метилированных опухолей нормально моноаллельно метилированные CpG-динуклеотиды имеют тенденцию к почти равновероятному изменению метилирования как в неметилированное, так и в полностью метилированное состояния. В геномах гиперметилированных опухолей нормально моноаллельно метилированные CpG-динуклеотиды чаще меняют своё состояние на полностью метилированное. Наблюдаемый характер изменений позволяет предположить, что динамика диктуется в умеренно метилированных опухолях процессами, не определяющими их вектор, а в гиперметилированных – дополнительно – направленным процессом (процессами), повышающим уровень метилирования CpG-динуклеотидов. Рассмотрение CpG-динуклеотидов, в норме имеющих статус биаллельно метилированных либо неметилированных и приобретающих моноаллельное метилирование в гиперметилированных опухолях, в сравнении с поведением этих же CpG-динуклеотидов в умеренно метилированных опухолях показывает, что (1) основным субстратом для de novo моноаллельно метилированных CpG-динуклеотидов в гиперметилированном подтипе служат, в подавляющем большинстве, полностью неметилированные в норме, то есть приобретение статуса de novo моноаллельного метилирования в этом подтипе осуществляется за счет активного процесса метилирования ранее неметилированных цитозинов; (2) в опухолях умеренно метилированного подтипа значительная доля тех же CpG-динуклеотидов сохраняет неметилированное состояние, что может отражать менее интенсивный процесс активного метилирования de novo в этом типе опухолей. В научной литературе вопрос о причинах и механизмах опухоль-ассоциированного аномального метилирования ДНК обычно решается относительно конкретных геномных локусов – промоторов генов опухолевых супрессоров или мотивов нуклеотидных последовательностей. При этом речь идет о приобретении в опухолях метилированного состояния теми CpG-островками, которые в нормальных тканях полностью неметилированы. Категория моноаллельного метилирования ДНК и вопрос о её месте в динамике метилирования CpG-островков в опухолях рассматривался до сих пор лишь в одной работе, посвященной исследованию изменений метилирования ДНК в импринтированных локусах генома человека в злокачественных опухолях [Martin-Trujillo A, Vidal E, Monteagudo-Sánchez A et al. Copy number rather than epigenetic alterations are the major dictator of imprinted methylation in tumors. Nature communications. 2017;8(1):1-12]. Авторы показали на материале клеточных линий рака, что профили метилирования импринтированных районов часто отражают нарушения их копийности (CNA). В нашем исследовании рассмотрена динамика изменения состояния не только импринтированных участков генома, но и неимпринтированных, моноаллельно метилированных в норме, участков. Наблюдаемая динамика позволяет также предполагать участие нарушений копийности в формировании опухолеспецифичных профилей метилирования нормально моноаллельно метилированных локусов, как это было показано для импринтированных CpG-островков. Рукопись статьи с описанием этой части нашего исследования принята к публикации журналом «Медицинская генетика». Также, в рамках изучения причин аномального, в том числе, моноаллельного метилирования ДНК при РМЖ, для отдельно выбранной группы генов трансмембранных белков и белков внеклеточного матрикса с высокими частотами аномального метилирования при РМЖ мы провели анализ корреляций с эпигенетическими подтипами РМЖ и рядом клинико-морфологических характеристик опухолей. Мы показали, что для таких генов с высокими частотами аномального метилирования при РМЖ, как ITGA1, ITGA9, NID1, NID2 аномальное метилирование статистически достоверно ассоциировано с принадлежностью опухолей к гиперметилированному подтипу РМЖ, т.е., возможно, носит «пассажирский» характер. В то же время, для ITGA4, с частотой аномального метилирования при РМЖ, превышающей 30%, такой ассоциации не обнаружено. В то же время, для гиперметилирования ITGA4 была выявлена корреляция с экспрессией рецептора HER2 в опухолях (p = 0.0054), причем наибольшая частота гиперметилирования ITGA4 наблюдалась в опухолях с наибольшей экспрессией HER2 (HER2 3+). При этом, несмотря на высокую частоту аномального гиперметилирования, максимальный уровень метилирования этого гена в опухолях не превышает 0,5, что говорит о достижении лишь уровня моноаллельного метилирования. Сопоставляя полученные данные, мы предложили гипотезу эволюционного преимущества моноаллельно метилированного состояния промотора гена ITGA4 в опухолях молочной железы с экспрессией рецептора HER2. Суть гипотезы состоит в том, что клетки с совместной активной экспрессией рецепторов HER2 и интегрина α4 менее конкурентны в процессе микроэволюции опухоли; «превентивный запрет» экспрессии гена ITGA4 путем метилирования его промотора дает преимущество таким клеткам при активации механизмов транскрипции ITGA4 в опухоли. Наша статья с описанием этого исследования опубликована в журнале «Scientific Reports» (https://www.nature.com/articles/s41598-021-81851-y.pdf). Все задачи этапа проекта 2021 года полностью выполнены. Результаты опубликованы в виде статьи в журнале «Scientific Reports» (Web of Science Q1), двух тезисов с индивидуальными DOI в журнале «Annals of Oncology», индексируемом Web of Science. Приняты к публикации рукописи статей в журналах «Генетика» (Web of Science) и «Медицинская генетика (РИНЦ). Результаты были также представлены в формате 6 устных и стендовых докладов, из них два – стендовые доклады на зарубежных конференциях под эгидой Европейского общества клинической онкологии (ESMO). В научно-популярной форме информация о выполнении проекта в 2021 году была представлена на сайтах РНФ, genetics-info, tobewell - медицинский навигатор для онкологических пациентов; ссылки: https://genetics-info.ru/news/genetiki-mgnts-predpolagayut-chto-mozhno-povysit-effektivnost-terapii-pri-her2-pozitivnom-rake-moloch/ https://tobewell.info/media/genetiki-mgnts-predpolagayut-chto-mozhno-povysit-effektivnost-terapii-pri-her2-pozitivnom-rake-moloch/ https://www.rscf.ru/news/found/grantopoluchateli-rnf-vystupili-na-vserossiyskom-festivale-nauki-nauka-0/

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На выборке 100 образцов core-биопсии РМЖ с известным ответом на НАХТ определены параметры диагностической ценности разработанных тест-систем многолокусной метилчувствительной ПЦР в режиме реального времени (МЧ-кПЦР). Исследовали в общей сложности 13 маркеров в составе 5 систем МЧ-кПЦР, из которых три предназначены для опухолей ТН подтипа, две – для люминального В подтипа. Для ТН подтипа наиболее информативным оказалось сочетание маркеров метилирования генов MYO15B, EZH2, ADRA2A и SLC9A3 (AUC=0,76; чувствительность 0,66; специфичность 0,77). Для LumB подтипа - сочетание маркеров метилирования двух генов - KCNQ1-AS1 и SP6 (AUC=0,79; чувствительность 0,80; специфичность 0,80). Статистический анализ не выявил значимых ассоциаций между уровнем метилирования исследуемых маркеров и клинико­морфологическими характеристиками РМЖ. В то же время, нами обнаружена корреляция ответа на НАХТ опухолей LumB подтипа со статусом вовлечения лимфоузлов в опухолевый процесс (p<0,05). Мы предположили, что добавление переменной «статус вовлечения лимфоузлов, N» для опухолей LumB подтипа могло бы улучшить качество классификаторов. Проведенный расчет диагностической ценности таких клинико-эпигенетических систем маркеров подтвердил это предположение: сочетание даже одного маркера метилирования (MYO15B) с показателем вовлечения лимфоузлов обладает чувствительностью 0,99 и специфичностью 0,83 в отношении определения принадлежности образцов РМЖ LumB подтипа к группе с наличием или отсутствием ответа на НАХТ, с AUC=0,92. Таким образом, в результате проведенного исследования удалось сформировать клинико-эпигенетические системы маркеров для предсказания эффективности НАХТ РМЖ LumB подтипа с показателями диагностической ценности, значительно превышающими таковые, полученные на этапе работы 2018-2020 гг. (максимальное значение AUC=0,92 против 0,76), т.е., цель исследования достигнута. Определены показатели диагностической ценности панели маркеров (участки генов FERD3L и TRIP10), опубликованной зарубежным коллективом (Pineda с соавторами, 2019). Оценка, проведенная на основании полученных нами результатов бисульфитного пиросеквенирования целевых CpG-динуклеотидов генов FERD3L и TRIP10, показала низкую диагностическую ценность панели (AUC=0,52). Таким образом, в точности воспроизведенный нами протокол, опубликованный ранее испанским коллективом, продемонстрировал на наших выборках отсутствие предиктивных свойств предложенной ими двухгенной системы маркеров. Чтобы исключить технические погрешности с нашей стороны, уровни метилирования были дополнительно измерены независимым методом бисульфитного высокопроизводительного параллельного секвенирования. Сравнение результатов показало хорошую корреляцию показателей – коэффициент детерминации 0,92 для FERD3L и 0,84 для TRIP10, что говорит о достоверности получаемых нами результатов. Таким образом, мы считаем проведенные нами измерения корректными, и предполагаем технические погрешности в работе Pineda с соавт. Других систем маркеров метилирования ДНК для предсказания чувствительности РМЖ к НАХТ до сих пор опубликовано не было. Учитывая, что двухгенная система Pineda с соавт. не выдержала валидации на независимой выборке, мы считаем системы маркеров, разработанных в рамках настоящего проекта РНФ, не имеющими аналогов в мире на сегодняшний день. Проведено широкогеномное бисульфитное секвенирование в дополнительной выборке образцов РМЖ до и после НАХТ. Уточнены метаболические и регуляторные пути и биологические процессы, изменения которых посредством аномального метилирования ДНК характерны для РМЖ в результате НАХТ. Особое внимание привлекает гипометилирование в образцах РМЖ после НАХТ генов, вовлеченных в сигнальные пути, регулирующие плюрипотентность стволовых клеток. Неожиданной находкой этого участка исследования оказалось ярко выраженное изменение метилирования импринтированного гена KCNQ1OT1. Его метилирование не изменяется в процессе опухолеобразования, но значимо снижается после НАХТ. Поскольку мы рассматриваем уровни метилирования CpG-динуклеотидов в образцах опухолей как результирующие уровней метилирования различных клеточных типов, а изменения метилирования считаем следствием изменения состава клеточных популяций, отклонение характера метилирования импринтированного участка генома от нормально моноаллельного в опухолях после лечения, на первый взгляд, выглядит невозможным, поскольку импринтинг фиксируется уже на стадии гаметогенеза и стабилен во всех типах дифференцированных соматических клеток, в том числе, как мы показали, и в опухолях. Единственным типом соматических клеток, для которых возможно альтернативное состояние метилирования импринтированных участков, могут быть стволовые клетки. В настоящее время рассматривается модель изменения клеточного состава опухоли под воздействием химиотерапии, предполагающая обеднение дифференцированными клетками и относительное обогащение стволовыми опухолевыми клетками за счет большей чувствительности делящихся дифференцированных клеток опухолей к цитостатикам, с одной стороны, и способности опухолевых клеток к дедифференцировке в стволовые опухолевые клетки, с другой. Учитывая совокупность этих соображений, мы изучили характер метилирования импринтированного CpG-островка в стволовых клетках человека. В эмбриональных стволовых клетках и ИПСК выявили нулевой уровень метилирования, к которому стремятся и образцы РМЖ после НАХТ, что свидетельствует в пользу гипотезы о вкладе эпигеномов стволовых клеток в формирование профилей метилирования опухолевых образцов, полученных после НАХТ. Обнаруженное нами гипометилирование в образцах РМЖ после НАХТ генов, вовлеченных в сигнальные пути, регулирующие плюрипотентность стволовых клеток, также подтверждает эту гипотезу. Если последующие исследования также подтвердят эту гипотезу, то анализ метилирования маркерных участков генома в образцах РМЖ после НАХТ может стать удобным и практичным маркером эффективности проведенной химиотерапии, особенно учитывая, что именно резистентные стволовые клетки считаются одним из важных факторов метастазирования и рецидивирования опухоли. По результатам комплексного биоинформатического анализа результатов широкогеномных исследований образцов РМЖ предложенные нами на этапе заявки гипотезы формирования паттернов аномального метилирования CpG-островков в опухолях гиперметилированного и умеренно метилированного подтипов подтвердились лишь частично, и только касательно мутационного статуса генов, вовлеченных в эпигенетическую регуляцию. Что же касается влияния нарушений копийности на формирование специфических паттернов аномального метилирования, то в этой части исследования получены результаты, противоположные ожидавшимся согласно сформулированой в заявке гипотезе. Для оценки вклада потери гетерозиготности (ПГ) в формирование аномального метилирования нормально моноаллельных CpG-динуклеотидов мы ввели метрику ПГ-индуцированного состояния метилирования: индивидуально для каждого из опухолевых образцов определяли количество CpG-динуклеотидов, для которых в норме характерно моноаллельное метилирование и которые изменили свой статус метилирования в опухоли, и сортировали их на две группы - попавшие в область ПГ и не попавшие в область ПГ. Делением количества CpG-динуклеотидов в первой группе на количество во второй получали индекс ПГ-индуцированного изменения состояния метилирования. Вопреки ожиданиям согласно гипотезы, значения индекса в выборке опухолей умеренно метилированного подтипа статистически достоверно ниже, чем в выборке гиперметилированных опухолей. Дополнительно была проведена оценка аномалий копийности ДНК, возникших в результате дефицита системы репарации путем гомологичной рекомбинации (HRD). Показано, что их количество достоверно выше в опухолях гиперметилированного подтипа относительно умеренно метилированного. Эти результаты вносят вклад в характеристику геномного ландшафта основных эпигенетических подтипов РМЖ.