Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Резистом - совокупность всех генов устойчивости к антибиотикам, которые существуют как у патогенных, так и у непатогенных бактерий, является универсальным резервуаром источников антимикробной резистентности во всех биотопах, населенных микроорганизмами. Критический уровень распространения АМР в микробиомах, ассоциированных с человеком и животными, в настоящее время представляет угрозу. В связи с этим существует необходимость выявлять и изучать источники АМР, компоненты резистома, механизмы формирования и распространения АМР. В рамках работ по проекту были изучены темпы развития антибиотикорезистентности условно-патогенных бактерий, населяющих микробиом, ассоциированный с сельскохозяйственной птицей – цыплятами-бройлерами кросса Росс 308. Была изучена динамика АМР на модельных культурах, исследовано влияние рационов с антимикробными компонентами и рационов с фитобиотическими компонентами, не вызывающими устойчивость у бактерий, на основные показатели метаболизма, общей резистентности организма цыплят-бройлеров, качество получаемой от них продукции. Получены результаты по развитию АМР in vitro на модельных культурах, в качестве которых использовали стандартные штаммы условно-патогенных микроорганизмов, актуальных в микробиоценозах сельскохозяйственной птицы. Была определена минимальная подавляющая концентрация ципрофлоксацина, меропенема, ванкомицина, цефепима и ампициллина для E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27853), S. aureus (ATCC 29213, слабый продуцент бета-лактамаз), Enterococcus faecalis (ATCC 29212). Затем эти изоляты культивировали на средах, содержащих указанные антибиотики в концентрациях меньше, чем минимальная ингибирующая, на протяжении 37 суток, что соответствует сроку содержания бройлеров в промышленных условиях от момента вывода до убоя. Установили, что при данных условиях резистентность к использованным антибиотикам не развивалась. Предположительно, это связано с тем, что использованные стандартные штаммы не имели в геноме активных детерминант резистентности, а из-за отсутствия контактов с другими микроорганизмами горизонтальный перенос генов (ГПГ) не происходил. В естественных же микробиомах постоянно происходит обмен мобильными элементами резистома за счет ГПГ, что способствует быстрому формированию резистентности у микроорганизмов. Проведены исследования АМР в микробиоценозах. Результаты исследований показали, что условно-патогенное ядро микробиоценоза было преимущественно представлено грамотрицательными бактериями (59,18%), грамположительные бактерии составляли 22,45%, а грибы - 18,37%. Среди грамотрицательных микроорганизмов наиболее часто во всех опытных и в контрольной группах встречали изоляты E. coli, P. mirabilis и K. pneumoniae. Наиболее распространенными представителями грамположительных бактерий были энтерококки – E. faecalis, E. faecium и E. gallinarum, а также стафилококки – S. xylosus, S. sciuri, S. epidermidis S. succinus, S. aureus. Так же установили, что в подстилке опытных групп, состав рациона которых включал в себя антибиотик «Максус G-100» изоляты энтерококков и стафилококков обнаруживали в малых количествах, что подтверждало активность действующего вещества (авиламицин) против, заявленных производителем, микроорганизмов. Низкое количество кокковой микрофлоры в пробах подстилки 1 и 2 групп на протяжении всего экспериментального периода связано с элиминацией целевых для авиламицина бактерий в желудочно-кишечном тракте кур. Результаты исследования фенотипической чувствительности выделенных культур показали, что к меропенему и цефепиму резистентность у штаммов отсутствовала, т.е. приобретения в ходе эксперимента генов, кодирующих карбапенемазы и ESBL, предположительно не произошло, либо эти гены не экспрессировались и не имели фенотипического проявления. Во всех опытных и контрольной группах отмечали высокий уровень резистентности к ципрофлоксацину и ампициллину в основном за счет устойчивых изолятов Klebsiella pneumoniae, а также изолятов Enterococcus spp. к ванкомицину. Таким образом, при исследовании фенотипической чувствительности выделенных культур, не было обнаружено резистентности к наиболее клинически значимым антибиотикам класса β-лактамов: меропенему (представителю группы карбапенемов) и цефепиму (представителю группы цефалоспоринов IV поколения). Однако, при анализе генотипа изолятов К. pneumoniae были обнаружены гены blaDHA, кодирующие бета-лактамазы расширенного спектра. Данные факты свидетельствовали о наличии в микробиоме высокого потенциала резистентности к бета-лактамным АМП. Все штаммы K. pneumoniae показали резистентность к ампициллину, что подтверждается данными EUCAST по природной устойчивости к этому антибиотику, это связано с присутствием в хромосомах K. pneumoniae пенициллиназы SHV-1. Высокий уровень устойчивости P. mirabilis, K. pneumoniae и E. coli к ципрофлоксацину свидетельствовал о контаминации микробиоценоза генетическими детерминантами резистентности (ARG) к фторхинолонам. 84% штаммов Klebsiella pneumoniae были устойчивы к ципрофлоксацину, 100% штаммов Proteus mirabilis из смывов и подстилки демонстрировали устойчивость к этому антибиотику. Резистентность к фторхинолонам, предположительно, имела плазмидно-опосредованный характер и была ассоциирована с генами qnrA и qnrB, которые характерны для K. pneumoniae. В геномах штаммов E.coli и K. pneumoniae обнаружили ген резистентности blaDHA, ассоциированный с бета-лактамазами расширенного спектра, а также гены blaKPS и blaOXA48-like, кодирующие резистентность к защищенным пенициллинам, цефалоспоринам I, III и IV поколения и карбапенемам. При оценке чувствительности к ванкомицину Enterococcus spp были, в основном, чувствительны к ванкомицину (с МПК 1,0 мг/л), за исключением штаммов, характеризующихся природной устойчивостью (Enterococcus gallinarum, Enterococcus casseliflavus). Устойчивость к ванкомицину этих штаммов обусловлена хромосомно-кодируемым опероном vanC. При оценке чувствительности к ванкомицину штаммов Staphylococcus xylosus, все штаммы были к нему чувствительны (с МПК 0,5 мг/л). Результаты проведенных исследований указали на то, что большинству микрорганизмов требуется более длительный временной интервал для формирования резистентности к антибиотикам путем приобретения мутаций в генах или за счет плазмид, в условиях селективного давления антимикробных препаратов. В ходе исследований эффективности применения антибиотиков и фитобиотических средств для поддержания естественной резистентности организма кур было установлено, что темп набора массы цыплятами из опытных и контрольной групп был наиболее высоким во второй группе в первые 20 суток, а затем, с 21 суток до убоя части поголовья на 37 сутки, и убоя оставшегося поголовья на 58 сутки – темп набора массы и показатель живой массы был наибольшим в 3 опытной группе, получавшей фитобиотики. Средняя масса белого мяса была наибольшей в контрольной группе и третьей опытной группе и составляла 242,6 г и 245,3 г. Средняя масса печени и сердца была наиболее высокой в 3 группе. Результаты исследования крови и сыворотки бройлеров показали повышение количества псевдоэозинофилов на фоне снижения лимфоцитов, выявленное у цыплят 3 группы, что свидетельствовало об усилении бактерицидной и антитоксической функции крови. Незначительное увеличение относительного содержания Т- и В-лимфоцитов свидетельствовало об активации клеточного и гуморального звеньев иммунитета. Анализировали также концентрацию малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови цыплят-бройлеров. Наиболее высокая концентрация МДА установлена в крови цыплят-бройлеров во 2-й и 4-й группах – в среднем, 0,201±0,067 ммоль/мл и 0,194±0,044 ммоль/мл соответственно. Содержание МДА в грудной и бедренной мышцах цыплят-бройлеров опытных и контрольной групп, убитых на 37 сутки было наибольшим через сутки после убоя в пробах белого мяса. Было выявлено, что массовая доля жира была выше у бройлеров 2 и 3 групп – получавших масляный фитобиотический препарат в качестве добавки к рациону. Содержание белка, влаги, золы, сухого вещества в мясе существенных различий не имело (Р>0,05). Таким образом, в ходе работ по проекту было установлено, что за периоды в 37 и 58 суток, соответствующие стандартным технологическим схемам выращивания бройлеров кросса РОСС308 не происходило формирования антимикробной резистентности у основных условно-патогенных бактерий в микробиоценозах, ассоциированных с продуктивной птицей. При этом микробиом был контаминирован генами резистентности к бета-лактамазам расширенного спектра и микроорганизмами, имевшими высокий уровень резистентности к фторхинолонам, что при более длительных пассажах микрофлоры может привести к распространению АМР. Применение фитобиотических препаратов самостоятельно либо одновременно с антибиотиками не ухудшало технологические характеристики и качество мяса бройлеров, а в большинстве случаев оказывало выраженное положительное влияние на показатели здоровья и продуктивности птицы, что позволяет рассматривать фитобиотики, как перспективную замену антибиотикопрофилактики.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Исследовали темп и характеристики развития антибиотикорезистентности условно-патогенных представителей микробиоценозов кур-несушек при использовании стандартных рационов, содержащих антимикробные компоненты, фитобиотические компоненты по отдельности и в сочетании друг с другом. Анализировали состав и антибиотикочувствительность микрофлоры, биохимический, иммунологический, гематологический статус кур, показатели продуктивности, качественные характеристики яйца. Проведенные микробиологические исследования показали, что использование антибиотика энрофлоксацина отдельно или в сочетании с фитобиотическим препаратом не оказало существенного влияния на темп развития и уровень антибиотикорезистентности условно-патогенной микрофлоры у кур-несушек 400-дневного возраста. На всех этапах эксперимента выявляли резистентные изоляты E. coli и K. pneumoniae, имевшие гены CTX-M+, ассоциированные с устойчивостью к пенициллинам и цефалоспоринам I-IV поколения, гены бета-лактамаз расширенного спектра типов TEM и SHV. Микробиомы желудочно-кишечного тракта кур-несушек к этому времени были сформированы, стабильны и контаминированы агентами АМР. При биохимическом и иммуногематологическом исследованиях крови несушек установили, что совместное применение энрофлоксацина и фитобиотика приводило к снижению антигенной нагрузки на организм за счет ингибирования условно-патогенной микрофлоры кишечника, уменьшало выраженность цитолитических процессов, Использование фитобиотика в дополнение к энрофлоксацину корректировало функциональные изменения иммунной системы, вызванные применением энрофлоксацина, устраняло признаки нарушения тканевого и клеточного дыхания, а также оказывало мембраностабилизирующий эффект. У птицы, получавшей только энрофлоксацин, были выявлены признаки супрессии гуморального компонента иммунитета и компенсаторного смещения иммунореактивности организма в сторону неспецифической защиты. У несушек, получавших только фитобиотический препарат, обнаружили метаболические изменения, характерные для дефицита холекальциферола, что было связано с его частичным растворением в липидной основе фитобиотика и затруднением всасывания. Фитобиотик имел бактериостатический эффект, однако более слабо выраженный, чем у энрофлоксацина, что косвенно подтверждалось результатами биохимических и иммуногематологических исследований крови птицы. Наиболее высокий средний показатель яйценоскости на несушку за весь период анализа выявили в группе, получавшей энрофлоксацин и фитобиотический препарат – 0,99. Наименьший – в группе, где несушки получали только фитобиотик – 0,89. Отмечали снижение яйценоскости на несушку в конце опыта в группе #1 на 3,6%, в группе #3 на 2,2%. В группе #2 данный показатель вырос на 12,3%, в контрольной группе #4 –на 11,6%. Сравнение средней массы яйца за неделю в начальном и конечном периодах, показало, что в контрольной группе средняя масса яйца снизилась на 3,94%, в опытных группах практически не изменилась. При исследовании остаточного содержания хинолонов в яйце установили, что применение фитобиотика способствовало более быстрому выведению энрофлоксацина из организма несушек. Таким образом, оптимальным было сочетанное применение энрофлоксацина и фитобиотика, в то время как использование каждого из этих препаратов по отдельности оказывало менее выраженное действие и сопровождалось нежелательными эффектами. Исследовали возможность применения бактериофагов в качестве альтернативы антибиотикам для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта у бройлеров. Установили, что использование препаратов бактериофага оказывало положительный эффект на состав микрофлоры кишечника бройлеров, уменьшая в его структуре долю клинически значимых условно-патогенных бактерий, в том числе, имеющих резистентность к антибиотикам. При этом у получавших бактериофаг бройлеров была отмечена положительная тенденция увеличения живой массы к сроку убоя.